基于RNAi技术转移脂肪酸延长酶基因fae1 及转基因油菜的获得

通过构建RNAi载体抑制油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）表达，获得了油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）功能缺失突变体。经酶切及序列测定证实，成功构建完成油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）反向重复结构RNAi载体；通过农杆菌介导的油菜转化，经RCR及印染检测，获29个油菜转基因再生株系。     

农杆菌介导的花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2 RNAi抑制表达遗传转化研究

以成熟花生种子萌动4d的上胚轴为受体材料,采用农杆菌介导的转化方法,将倒位重复Δ12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2片段分别与CaMV35S启动子和种子特异性表达的大豆凝集素启动子相连导入花生。经PCR检测证实含有AhFAD2倒位重复基因片段的RNAi抑制表达框架已成功转入花生。     

花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因FAD2的克隆及反义表达载体的构建

从花生的幼嫩叶片中提取总DNA,应用PCR方法分离到了两个FAD2基因片段,分别命名为FAD2-1和FAD2-2,将反向的FAD2-1和FAD2-2片段分别与所克隆的大豆油体蛋白基因启动子片段oleosin-a与oleosin-b相连,在中间表达载体pSPROK中构建了三个带T-nos的融合基因,进而把融合基因构建到植物表达载体pCAMBIA1300中,酶切鉴定后进行测序,结果表明,所构建的三个植物表达载体均分别带有Oleosin启动子和反义FAD2基因序列,FAD2-2的长度为593bps,与引用序列的同源性达到97%,包含一个起始密码子;FAD2-1的长度为1175bp,与引用序列的同源性达到99%,包含一个起始密码子与一个终止密码子。将构建好的植物表达载体已经转化农杆菌LBA4404并用于侵染花生外植体。     

农杆菌介导的花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2 RNAi抑制表达遗传转化研究

以成熟花生种子萌动4d的上胚轴为受体材料,采用农杆菌介导的转化方法,将倒位重复Δ12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2片段分别与CaMV35S启动子和种子特异性表达的大豆凝集素启动子相连导入花生.经PCR检测证实含有AhFAD2倒位重复基因片段的RNAi抑制表达框架已成功转入花生.     

Δ6-脂肪酸脱氢酶基因克隆及其共转化表达载体的构建

采用RT-PCR的方法从海南玻璃苣中克隆了Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(Δ6-dsa).DNA序列测定结果表明,Δ6-dsa全长1 347bp编码448个氨基酸.Δ6-dsa序列在genbank中采用BLAST程序进行同源序列分析,结果表明,Δ6-dsa核苷酸序列与克隆自美国德克萨斯州的玻璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列完全相同.Δ6-dsa克隆进T-easy Vector后形成质粒pGΔ6-DSA.把质粒pGΔ6-DSA上的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因片段克隆进含有T-DNA和35S启动子的质粒pGIN22中,形成含有目的基因的表达载体pGIN23.把表达载体pGIN23与另一个含有T-DNA、启动子、筛选标记基因的表达载体PLPN28进行亚克隆,使得筛选标记基因和Δ6-dsa分别插入到同一质粒的2个相互独立的T-DNA内,构建成共转化表达载体pLIN61.     

不同O/L值花生品种油酸脱氢酶基因的时空表达特征

本研究以不同油酸/亚油酸比值（O/L比）花生品种为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对四个不同O/L花生品种不同组织中油酸脱氢酶基因（FAD2）的表达进行相对定量分析。结果表明：FAD2基因在不同O/L基因型中组成型表达,其在根、茎、叶中表达量低,在花中表达量最高,显著高于荚果等其它组织中的表达量,且品种间差异达显著水平;花U606和花U12在花、幼荚、成熟荚果中的表达量呈依次下降趋势;花育17和狮油红4号在花、幼荚、成熟荚果中的表达量则呈现高-低-次高的表达趋势,差异达显著水平。       

花生△12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B在酿酒酵母中的表达及功能分析

花生油中亚油酸(LA,C18:2Δ9,12)含量很高,为了研究花生Δ12脂肪酸脱氢酶(Δ12 FAD)的功能,用RT-PCR方法从花生未成熟种子中扩增出AhFAD2B的cDNA,连接到酵母表达载体p416中,并转化酿酒酵母K601,得到工程菌Kp4AFAD2B。气相色谱分析脂肪酸成分,结果表明该基因能在酵母K601中表达,并使菌株产生了两种新的脂肪酸即棕榈二烯酸(C16∶2Δ9,12)和亚油酸(C18∶2Δ9,12),含量分别占总脂肪酸的2.1%和9.2%,棕榈油酸(C16∶1Δ9)和油酸(C18∶1Δ9)含量与对照相比相应地下降,证明该基因编码的Δ12脂肪酸脱氢酶除能作用于C18∶1Δ9,还具有催化16碳的C16∶1Δ9底物在Δ12位脱氢生成C16∶2Δ9,12的功能,但在两种底物之间可能更偏爱C18∶1Δ9。     

及转基因油菜的获得

通过构建RNAi载体抑制油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）表达，获得了油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）功能缺失突变体。经酶切及序列测定证实，成功构建完成油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）反向重复结构RNAi载体；通过农杆菌介导的油菜转化，经RCR及印染检测，获29个油菜转基因再生株系。     

向大豆导入琉璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的初步研究

采用RT-PCR法扩增出中国境内生长的琉璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因,序列分析表明,该基因全长为1 359个核苷酸,与美国德克萨斯州的琉璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因同源性可达到99%。将克隆到的基因连接pRTL2质粒的35S启动子,构建重组载体pPTN-D6D,并通过农杆菌介导的子叶节转化系统,将该基因导入到垦农18和小粒豆2个大豆品种中。经PCR检测分析,初步证明琉璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因已导入并整合到大豆基因组中。     

农杆菌介导的花生△^12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2 RNAi抑制表达遗传转化研究

以成熟花生种子萌动4d的上胚轴为受体材料，采用农杆菌介导的转化方法，将倒位重复△^12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2片段分别与CaMV35S启动子和种子特异性表达的大豆凝集素启动子相连导入花生。经PCR检测证实含有AhFAD2倒位重复基因片段的RNAi抑制表达框架已成功转入花生。     

油菜PEPase基因的克隆及其对应RNAi载体的构建

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPase)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶.采用RT-PCR方法从甘蓝型油菜中双4号中扩增出PEPase基因cDNA片段,与已发表的PEPase基因(登录号为D13987)序列同源性为98%.根据RNA 干扰(RNAi)目标序列的选取原则选取两段长度约为400bp的DNA序列,分别克隆到RNAi载体pHBM1301中,构建了油菜中对应于PEPase基因的RNAi载体pHBM1301-PEP1和pHBM1301-PEP2.     

转基因高油酸油菜株系W-4种子脂肪酸组成

为研究fad2基因下调表达对油菜种子脂肪酸组成的影响,分析比较了转基因高油酸油菜品系W-4的T5、T6和T7种子以及非转基因对照Westar种子中的脂肪酸组成。数据显示W-4种子中油酸平均含量为84.61%±1.41%,较对照增加了25.91%,达到极显著水平;亚油酸和亚麻酸含量分别为3.22%±0.56%和3.45%±0.51%,较对照分别下降了80.89%和47.00%,降幅均达极显著水平。此外,W-4种子中棕榈酸平均含量为3.42%±0.18%,较对照Westar下降18.10%,达到极显著水平;而硬脂酸平均含量为1.87%±0.19%,较对照下降了8.33%,亦达到显著水平;W-4种子中廿碳烯酸的平均含量为1.54%±0.06%,较对照平均增幅为18.46%,达到极显著水平;W-4平均芥酸含量较对照略有增加,但不显著。结果表明油菜种子中fad2基因下调表达对种子的脂肪酸合成与积累影响较大,其不仅显著降低种子中多不饱和脂肪酸含量,增加油酸的含量;而且也显著降低饱和脂肪酸含量,并促进长链单烯酸的合成。     

花生FAD2基因RNAi载体转化及转基因籽粒脂肪酸分析

在构建了以花生△12脂肪酸去饱和酶（FAD2）基因自身启动子驱动、有内含子间隔的该基因编码序列反向重复片段的RNA干扰载体的基础上,对上述干扰载体进行了农杆菌介导的花生胚小叶的遗传转化,以期特异调控花生籽粒中油酸、亚油酸含量。 在2个受体品种中获得105株抗性再生植株,用两对引物对其进行了PCR扩增,其中32株初步证实为转基因植株。采用近红外分析仪对转基因T1籽粒油酸和亚油酸含量的检测表明,转基因株系内油酸/亚油酸比值的变异高于对照,多数转基因株系油酸亚油酸比值平均数也显著高于对照。     

油菜野芥细胞质雄性不育恢复基因候选片段的克隆

根据植物细胞质雄性不育恢复基因编码的PPR（pentatricopeptide repeat）蛋白的特点,结合拟南芥PPR基因簇相似序列,扩增油菜野芥细胞质雄性不育(Nsa CMS) 基因组DNA,筛选出一对简并引物,在Nsa不育系育性恢复后的可育材料和野芥亲本中可以同时扩增出符合预期的片段。片段长度为309bp,与萝卜CMS恢复基因核苷酸序列的一致性为69%,与拟南芥1号染色体臂上PPR基因簇核苷酸序列的一致性大于70%,与含波里马（Pol）CMS恢复基因的白菜型油菜相关序列一致性达85%。该片段编码的氨基酸序列含有两个相邻排列的PPR基序,可作为Nsa CMS育性恢复基因的候选片段。     

甘蓝型油菜分枝籽粒油酸含量的光谱估测

为寻找最佳光谱检测部位,创新一种高油酸油菜种质资源筛选方法,以44个高油酸含量的甘蓝型油菜为材料,按照从主茎、一次分枝到二次分枝的顺序,采集籽粒反射光谱及油酸含量数据,分析不同部位的原始及一阶微分光谱与对应籽粒油酸含量的相关关系,建立了基于全波长、特征波长的逐步多元线性回归(stepwise multiple line...     

高油酸油菜品系农艺性状研究

对油菜（Ｂ．ｎａｐｕｓ）种子油酸含量与种子产量之间关系进行了研究。采用３个高油酸品系（油酸含量分 别为７７．５％,７６．９％和７８．９％）与３个普通油酸品系（油酸含量分别为６３．５％,６１．６％和６２．９％）,在田间试验条件 下进行了比较。结果表明,高油酸品系植株生长势、农艺性状、种子产量、菌核病危害程度等与普通油酸品系差异 很小,仅高油酸品系单株角果数稍少,病毒病危害程度稍高,但差异未达到显著水平。高油酸油菜品系叶片中的油 酸含量比普通油菜高,且油酸减饱和率（ＯＤＲ）较低。     

甘蓝型油菜BAN同源基因片段克隆与序列分析

参照拟南芥（Arabidopsis thaliana)BAN基因和cDNA的保守序列设计引物，对甘蓝型、白菜型、芥菜型油菜和拟南芥及其它十字花科栽培品种的基因组总DNA进行PCR扩增，均获得与拟南芥BAN基因扩增片段大小极其相似的PCR扩增产物，表明BAN基因可能广泛存在于十字花科植物中。甘蓝型油菜和拟南芥BAN扩增片段测序比较分析显示，拟南芥BAN片段（779bp)与已往的报道完全相同，甘蓝型油菜的BAN片段（780bp)与拟南芥BAN外显子的同源性为90％，但与内含子的同源性仅为74％。甘蓝型油菜BAN氨基酸序列与80多种植物的NADPH还原酶类有不同程度的同源性。     

香蕉Maasr1基因RNAi植物表达载体的构建及鉴定

以香蕉Maasr1基因为目的基因,载体pBS为中间载体,pBBB、pBI121为表达载体,分别构建含有Maasr1基因的RNAi植物表达载体DBBB-S-I-A和含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBl121-S,并通过农杆菌介导的方式对构建的该RNAi载体沉默效果进行鉴定.结果表明:(1)利用中间载体pBS和植物表达载体pBBB成功构建了香蕉Maasr1基因的RNAi植物表达载体pBBB-S-I-A;(2)利用载体pBI121成功构建了1个含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBI121-S:(3)构建的RNAi载体pBBB-S-I-A可以抑制Maasr1基因的表达,具有较好的沉默效果.     

甘蓝型油菜Bn19070的表达与同源基因At2G19070的amiRNAi研究

基于原芯片杂交结果,油菜杂合双显性雄性核不育系差异表达基因Bn19070与拟南芥At2G19070基因高度同源,在油菜可育株雄蕊中高量表达,不育株雄蕊中表达量极低。从雄性不育基因At2G19070入手,利用amiRNAi (人工微RNA干扰)技术对其两个RNA区段分别设计靶标,转化拟南芥。在多个转基因拟南芥植株和后代中普遍观察到小孢子数量减少、成熟花粉萎缩失去活力、不结实或者少结实的不育表型。两个靶标的干扰使转基因拟南芥出现了类似的表型,基因表达抑制率都在90%以上,干扰效果好,暗示amiRNAi技术在靶标选择上具有一定的灵活性。At2G19070基因的干扰对Bn19070的功能研究有借鉴作用。