虹鳟致病性杀鲑气单胞菌的分离鉴定及其毒力因子的检测

为研究虹鳟Oncorhynchus mykiss致病性杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida的致病机理,利用微生物学及分子生物学方法,从患皮肤溃疡病的虹鳟病灶处分离纯化获得1株优势菌株RBWF-1,通过人工感染试验证实其具有较强的致病性。结果表明:菌株RBWF-1对虹鳟的半致死浓度(LD50)为5.5×10~6CFU/m L;通过对菌株RBWF-1 16S r DNA基因序列扩增、测序及Blast对比,发现其与杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种Asalmonicida subsp.masoucida菌株NBRC 13748及无色亚种A.salmonicida subsp.achromogens菌株NCIMB 1110的16S rDNA基因序列同源性最高,一致性均为99.6%;构建系统发育树显示,菌株RBWF-1与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种A.salmonicida subsp.salmonicida、杀日本鲑亚种、无色亚种和史氏亚种A.salmonicida subsp.smithia聚为一支;为进一步明确菌株的分类地位,利用Biolog微生物鉴定系统结合传统生理生化试验对菌株RBWF-1各项理化指标进行检测,经对比,与杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种吻合度最高,因而判断该分离株为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种;同时,对分离菌株的气溶素、溶血素、封闭带毒素、DNA酶、丝氨酸蛋白酶、磷脂酶、S层蛋白7个毒力相关基因进行了PCR检测,检测结果均呈阳性;酶活性检测结果显示,菌株RBWF-1胞外产物具有蛋白酶、淀粉酶、脂酶、DNA酶和溶血活性。本研究结果可为中国虹鳟养殖过程中杀鲑气单胞菌的感染特征、分类鉴定和疫苗研制提供必要的数据和参考。     

盐度对牟氏角毛藻生长及总脂含量的影响

[目的]研究不同盐度对牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)生长及总脂含量的影响,以确定最高油脂产率的盐度。[方法]采用微挑法进行藻株的分离纯化;采用血球计数法进行细胞计数、干重法测定藻株生物量;采用氯仿-甲醇法进行藻株总脂含量的测定。[结果]盐度为20‰时,牟氏角毛藻生长最快,最大细胞密度为2.1×106个/ml,干重为58.89 mg/L,;盐度为25‰时,牟氏角毛藻总脂含量最高,达到29.93%。[结论]综合评价其生长及总脂积累,得出盐度为20‰时,牟氏角毛藻总脂产率最高,但与盐度25‰时差异不大。     

羊源杀鲑气单胞菌16S rRNA基因的克隆测序及分析

从重庆市丰都县无菌采集山羊血液,提取全血基因组,用16SrRNA基因的引物进行PCR扩增,得到2条长约1 500bp的扩增片段,将其克隆到pMD19-T载体后进行测序,并与3条豚鼠气单胞菌,3条嗜水气单胞菌,3条中间气单胞菌,4条杀鲑气单胞菌,2条温和气单胞菌,3条维氏气单胞菌和5条舒氏气单胞菌16SrRNA基因序列进行系统发育分析.结果表明:所克隆的基因片段长度均为1 507bp,GenBank登录号为JF823571和JF823572.系统发育分析发现2条序列均被聚类到杀鲑气单胞菌群,并与温和气单胞菌聚类到一个大的分支.同源性比对结果显示所获得的序列与杀鲑气单胞菌法国株(ATCC33658T)X74681和阿根廷株AF134065的同源性最高,均为99.6%,表明重庆地区存在受杀鲑气单胞菌感染的山羊.     

鲤源杀鲑气单胞菌无色亚种的分离鉴定及毒力基因检测

为了解引起鲤鱼皮肤溃疡的病原分子分型特征及其毒力基因,从患溃疡症鲤鱼体内分离到1株致病性菌株GZGY2 019,鉴定其为气单胞菌,并运用多位点序列分型(MLST)方法进行分类研究,利用PCR和测序方法分析6种毒力基因Aer、Ser、Alt、Lip、Act和Hly.通过对分离株的16S rDNA基因进行分析,确认其属于杀鲑气单胞菌.分离株对复方新诺明等9种抗菌药物耐药,毒力基因扩增结果显示:分离菌能检出气溶素基因(Aer)等6种毒力基因.基于气单胞菌6个管家基因分析,与MLST数据库中等位基因序列比对,发现其属于新的序列型(ST),隶属于杀鲑气单胞菌无色亚种.这一研究对发病鲤鱼的病因进行了准确诊断,为该病的防治与分子流行病学研究提供了依据.     

三北地区鱼源气单胞菌的分离鉴定与药敏试验

选取三北地区鲤、鲫、草鱼、大西洋鲑等鱼体内分离到的气单胞菌共16株,结合革兰氏染色、氧化酶反应和分子生物学方法对其进行鉴定后,采用K-B药敏纸片法测定16株菌对10类25种药物的敏感性。结果表明:16株菌均为革兰氏阴性、氧化酶阳性细菌;Blast比对分析发现实验菌株的16S rRNA序列分别与Gen Bank数据库中维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和杀鲑气单胞菌的不同菌株的16S rRNA基因序列同源性较高,相似性达95%以上;系统发育树显示16株菌分别与维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和杀鲑气单胞菌的不同菌株聚为一支,而与肠杆菌、志贺菌和弧菌分支较远,从而判定为维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和杀鲑气单胞菌;16株分离菌中有3株维氏气单胞菌、4株嗜水气单胞菌、3株温和气单胞菌和6株杀鲑气单胞菌;药敏试验中16株气单胞菌对氨苄西林、青霉素G、阿莫西林、三甲氧苄氨啶、复方新诺明、磺胺异噁唑、氯霉素、利福平具有较高的耐药性,耐药率达95%以上,对氟喹诺酮类药物普遍较敏感,不同菌株之间的耐药谱存在很大差异。为气单胞菌的鉴定及三北地区淡水鱼细菌病的药物防治提供科学依据。     

盐度对牟氏角毛藻生产性培养的影响

采用生产性培养方式,研究盐度对牟氏角毛藻生长的影响。结果表明,牟氏角毛藻细胞生长的适宜盐度范围是18.5～23.5,最适宜的盐度为21.0。低盐度下藻细胞生长缓慢,达到稳定期的时间长;高盐度下藻细胞生长较快,生长周期较短。     

3种重金属离子对牟氏角毛藻生长的影响

采用f/2培养基,研究了不同浓度的Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)和Pb(Ⅱ))对牟氏角毛藻Chaetoceros muelleri生长的影响。结果表明:在特定浓度条件下,3种重金属离子对牟氏角毛藻的生长具有显著影响。当Cu(Ⅱ)浓度为0.1 mg/L、Zn(Ⅱ)和Pb(Ⅱ)浓度为0.1~1.0 mg/L时,能促进牟氏角毛藻的生长;Zn(Ⅱ)和Pb(Ⅱ)浓度为10~50 mg/L时,牟氏角毛藻能维持一定的速率生长;Cu(Ⅱ)浓度为1~50 mg/L时,牟氏角毛藻的生长受到显著抑制。     

气单胞菌几丁质酶的产酶条件优化研究

[目的]为了进行气单胞菌几丁质酶产酶条件的研究。[方法]从自然死亡家蚕中肠围食膜中分离的气单胞菌进行产酶优化试验。其优化条件为:粉状几丁质1.2%,K2HPO4 0.12%,乙酸铵0.02%,发酵72 h,温度为30℃,起始pH值为8.0,培养基装量为15%。[结果]结果表明:该菌株所产几丁质酶的最适反应温度为25℃,pH值5.5,耐温性较差,但pH值5.0～9.0的酶活力较稳定(>88%)。[结论]该研究提供了提高几丁质酶产量的途径,但对该菌株进行基因改造或诱变育种,充分发掘其产酶潜力,对其几丁质酶基因进行克隆、表达等仍需进一步研究。     

CO_2/空气比值对牟氏角毛藻生长和总脂含量的影响

以牟氏角毛藻作为试验材料,通过向培养液中通入5种不同比值的CO2与空气的混合气体培养牟氏角毛藻,研究了CO2/空气比值对海洋产能微藻的生长以及总脂含量的影响。结果显示:CO2/空气的比值对牟氏角毛藻的相对生长率、总脂含量、总脂日增量均有极显著影响;牟氏角毛藻在CO2/空气=1/15时相对生长率最高,为1.76 d-1;总脂含量百分比最高,为31.26%;总脂日增量也最高,为样品藻初始干重的0.75倍。牟氏角毛藻的总不饱和脂肪酸的含量随CO2/空气比值的减小而增加,CO2/空气=1/25时最高,达70.27%;CO2/空气=1/5时最低,为65.28%。研究表明,CO2/空气=1/15的混合气体最适合牟氏角毛藻的生长以及粗脂肪的积累;CO2/空气=1/25最适合牟氏角毛藻不饱和脂肪酸的积累。     

水产养殖用微量元素肥料的研制

该项目系统研究确定了铁、锰、锌、铜、钼、钴、镍等微量元素为牟氏角毛藻和球等鞭金藻培养的必需营养元素,并确定了最佳浓度。研究结果较著名的M-f/2配方增加了镍,并对其它的五种元素浓度进行了修订。在国内率先研制出水产养殖用商品微量元素肥料,具有稳定性好、使用和运输方便等优点。应用于牟氏角毛藻和球等鞭金藻的培养,可提高细胞浓度和叶绿素浓度,分别为20.4%～43.2%和19.7%～25.6%;在室内规模培养牟氏角毛藻和球等鞭金藻,提高叶绿素浓度分别为19.7%和24.0%在对虾养殖池肥水中应用,叶绿素提高13.5%～90.3%。用微肥繁殖的牟氏角毛藻投喂对虾蚤状幼体的试验结果表明,蚤状幼体到糠虾幼体的变态率提高14.0%。可广泛应用于海水育苗和养殖池基础植物饵料生物的繁殖。经鉴定委员会鉴定认为该成果居国内先进水平。该成果1999年通过鉴定。 (黄海水产研究所)     

锌和铁对浅水湖泊中浮游植物复苏影响研究——以玄武湖为例

选取冬季12月的玄武湖水样,调整培养液的起始金属离子浓度(锌:0、3.25×10-4、3.25×10~(-3)、3.25×10~(-2) mg·L~(-1);铁:0、2.80×10-4、2.80×10~(-3)、2.80×10~(-2)mg·L~(-1)),探讨金属离子锌、铁对浮游植物复苏过程中群落结构的影响。结果表明:当锌为3.25×10~(-2)mg·L~(-1)时,蓝藻的复苏受到明显的抑制,绿藻及硅藻的生长受到胁迫作用,Fv/Fm值分别降至0.40、0.30、0;当铁浓度高于2.80×10~(-2)mg·L~(-1)时,蓝藻的复苏同样受到抑制,Fv/Fm值降为0.45,而绿藻和硅藻的Fv/Fm分别为0.33和0.07。高铁浓度下复苏后的浮游植物以蓝藻门的微囊藻为主,绿藻门的栅藻次之;高浓度锌胁迫下复苏后的浮游植物主要为绿藻门的栅藻,其次是绿藻门的小球藻,再后是蓝藻门的微囊藻。     

鳙鱼维氏气单胞菌的分离鉴定及其毒力基因检测

从患病鳙鱼中分离纯化得到一株优势菌株AH-YS,通过革兰氏染色、氧化酶试验、生化鉴定以及16S r RNA基因扩增、测序和系统进化分析等操作,结果显示,分离到的细菌为维氏气单胞菌。药敏试验显示,在使用的11种抗菌药物中,该菌株对氧氟沙星、诺氟沙星和恩诺沙星等9种药物敏感,对甲氧苄氨嘧啶和氨苄西林耐药。对9种毒力基因的扩增结果显示,可以检测到气溶素、细胞毒性肠毒素、鞭毛、弹性蛋白酶和酯酶5种。     

外源乙烯利对禾谷炭疽菌生物学特性的影响及转BtACO基因植物的抗病性评价

为明确乙烯对禾谷炭疽菌(Colletotrichum graminicola)致病性的影响并评价转BtACO基因拟南芥对禾谷炭疽菌的抗性.通过施加不同浓度外源乙烯利,对禾谷炭疽菌生长状况进行比较,并对喷施不同浓度乙烯利处理的野生拟南芥接种禾谷炭疽菌,分析禾谷炭疽菌的致病性,最后对转BtACO基因拟南芥接菌后的抗病性进行...     

不同生长条件下铁皮石斛内生细菌多样性及活性菌株的筛选

目的 比较和分析野生与人工栽培铁皮石斛Dendrobium officinale 内生细菌分布特点,筛选有较强定殖能力的活性菌株,为促进野生铁皮石斛驯化、提高药材品质奠定基础。方法 采用组织块分离法分离铁皮石斛根、茎、叶各部位的内生细菌,利用16S rDNA序列和系统发育树对分离菌株进行分析鉴定,体外筛选具有解磷、解钾、固氮、产铁载体、产IAA、拮抗病原菌的促生活性菌株,回接后再分离,观察内生细菌在组培苗中的定殖动态。结果 从铁皮石斛中分离到285株内生细菌,其中,217株分离自野生铁皮石斛,归类于3门9属,以芽孢杆菌属Bacillus和不动杆菌属Acinetobacter为优势菌群存在于根、茎、叶中,其菌株数分别占总分离菌株数的79.26%和8.76%;68株内生细菌分离自人工栽培铁皮石斛,归类于1门3属,以伯克霍尔德菌属Burkholderia和埃希菌属Escherichia为优势菌群存在于根、茎中,其菌株数分别占总分离菌株数的54.41%和30.88%。泛菌属Pantoea在野生和人工栽培铁皮石斛中均有分布。野生铁皮石斛内生细菌的物种数(9)和多样性指数(0.85)明显高于人工栽培铁皮石斛(物种数为3,多样性指数为0.61)。活性筛选共获得38株菌株,占筛选菌株的45%,4株野生铁皮石斛的活性内生细菌中有3株在人工组培苗具有较好的定殖性。结论 野生与人工栽培铁皮石斛内生细菌的类群结构和生物多样性具有明显差异,铁皮石斛内生细菌蕴含丰富的促生潜力。     

立枯丝核菌拮抗青霉菌筛选及抑菌机制初步研究

为筛选具有生防作用的青霉菌菌株并探索其作用机制,采用平板稀释法和对峙培养法,从宁夏回族自治区境内不同作物土壤中分离到18株青霉菌菌株,筛选到1株具有高效拮抗立枯丝核菌的生防菌P19,对立枯丝核菌丝生长抑制率达58.5%。利用光学显微镜观察P19对立枯丝核菌菌丝形态的影响,发现菌丝壁出现弯曲和畸形,原生质体凝结和溶解,菌丝被溶解等现象。结果表明,P19对立枯丝核菌具有明显的抑制作用,其生长对立枯丝核菌造成空间和营养方面的竞争,也可能是P19所含有的抗菌物质破坏立枯丝核菌的细胞壁,进而溶解菌丝内的原生质体,使立枯丝核菌的生长受到限制。     

假结核耶尔森氏菌rpoS基因的抗胁迫功能

为探讨食源性病原微生物假结核耶尔森氏菌的抗逆机制,采用同源重组原理进行双交换以获得rpoS基因突变株。分别在5mmol/L H_2O_2和pH 3.5两种胁迫下测定野生型菌株、rpoS基因突变株和互补菌株的存活率,并以2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)为荧光探针,测定两种胁迫下细菌胞内活性氧水平。结果显示,在5mmol/L H_2O_2和pH3.5胁迫下,假结核耶尔森氏菌rpoS基因突变株存活率明显降低,这种降低能够在互补菌株中得到恢复;突变株中胞内活性氧自由基水平明显高于野生型菌株和互补菌株。说明:rpoS基因具有帮助假结核耶尔森氏菌抗氧化胁迫和酸胁迫的功能,且这一功能的发挥是通过调节胞内活性氧水平实现的。     

核盘菌几丁质酶基因家族分析与表达特性研究

核盘菌菌核以子实体形式萌发是作物菌核病病害循环中关键性的一环,研究菌核子实体萌发分子机理将为菌核病的安全控制提供线索.该研究通过生物信息学方法对核盘菌几丁质酶基因家族进行分析,并利用实时荧光RT-PCR对其在菌核子实体萌发阶段的表达进行探讨.生物信息学分析表明核盘菌中共有12个基因编码假定的几丁质酶,它们均具有GH18结构域,部分蛋白还具有几丁质结合结构域和纤维素结构域;除SS1G_11212外其余蛋白均为亲水性蛋白;亚细胞定位预测表明其中10个假定几丁质酶位于胞外,其余2个分别位于细胞核和细胞质中.通过构建系统发育树分析发现假定几丁质酶可以分为2大类,其中3个与酵母几丁质酶CTS1归为一类,其余9个与CTS2归为另一类.除SS1G_00773外,其余11个几丁质酶基因在核盘菌菌核子实体萌发过程中表达量均有变化,推测几丁质酶家族蛋白可能参与核盘菌菌核子实体萌发过程.     

甘草内生细菌对4种植物病原菌的抑菌谱及其16S rRNA系统发育分析

旨在筛选对4种植物病原真菌具有拮抗活性的甘草内生细菌,为新疆甘草内生细菌的开发应用提供理论依据。采用平板对峙培养法从100株甘草内生细菌中筛选对石榴枯萎病甘薯长喙壳、草果叶斑病镰刀菌、草果假茎黑斑病小孢拟盘多毛孢、墨兰炭疽病胶孢炭疽菌等4个病原菌具有拮抗活性的菌株,并测定其16SrRNA基因序列,建立系统发育树对其进行初步鉴定。结果显示,61株菌株对甘薯长喙壳具有拮抗作用,其中13株菌的抑菌半径均大于15mm。进一步研究表明,10株菌对4种植物病原菌都表现出较高的抑菌能力。基于16Sr RNA基因序列分析与系统发育分析表明,其中11株菌为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus),另外2株菌分别为副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)和莫哈韦芽胞杆菌(B.mojavensis)。     

土壤中棒束孢菌的生物多样性及对黄曲条跳甲的活性

目的 调查国内部分地区不同土壤中棒束孢属Isaria真菌的多样性分布,测定其对黄曲条跳甲Phyllotreta striolata的生物活性,促进棒束孢菌对黄曲条跳甲的生防应用。方法 从福建、广东、广西、云南、贵州、湖南、湖北、河南、河北等地的不同生境中采集土壤样品,通过选择培养基分离纯化棒束孢菌株,根据形态学和分子标记鉴定菌种,采用多样性指数与优势度指数评价生物多样性;采用浸虫法测定棒束孢菌株对黄曲条跳甲成虫的生物活性。结果 从200余份土壤样品中分离得到棒束孢属真菌41株,优势菌种是爪哇棒束孢Isaria javanica,有34株,优势度指数为0.829;玫烟色棒束孢I. fumosorosea有5株,粉棒束孢I. farinosa和环链棒束孢I. cateniannulate各1株。林地物种丰富度最高,多样性指数为1.121,休耕地、果园、耕地和草地的多样性指数范围为0~0.349;林地种间分配最均匀,优势度指数为0.468,休耕地、果园、耕地和草地的优势度指数范围为0~0.159。生测结果表明,大部分供试的棒束孢菌株对黄曲条跳甲都有一定活性,玫烟色棒束孢IfH6102菌株对黄曲条跳甲的活性最高,在处理黄曲条跳甲成虫11 d后,其校正死亡率达60.89%。结论 棒束孢菌在我国土壤中分布广泛,林地生境中的物种多样性最丰富,棒束孢菌具有防治黄曲条跳甲的应用潜力。     

三七根际耐皂苷木霉菌的分离鉴定及其拮抗促生活性评价

为筛选出三七根际具有拮抗促生活性的耐皂苷木霉菌,通过收集一年生健康三七根际土壤进行木霉菌株的分离,并测定三七根系分泌物对木霉菌孢子萌发的影响以及皂苷对木霉菌菌丝生长的抑制效果,筛选获得耐皂苷的菌株,进一步对其分类鉴定后进行拮抗根腐病病原菌活性测定以及盆栽促生效果、根际定殖能力及其对连作障碍缓解效果的评价。结果表明:试验共分离到6株木霉菌株,其中2株对三七根系分泌物敏感性较低,经过形态学特征和ITS序列比对鉴定为绿色木霉(Trichoderma viride)T3和渐绿木霉(T. viridescens)T20。T3和T20菌株对三七主要根腐病病原菌恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)、毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)和雪腐镰刀菌(Monographella cucumerina)均具有较强的拮抗效果,对恶疫霉菌抑制率分别可达到61.76%和70.59%;T3和T20菌株能促进三七植株的生长,将其接种于三七连作土中,在接种20 d后能够在根际较好的定殖,增加三七植株的存苗率,降低根腐病发病率。该研究结果为缓解三七连作障碍提供了重要的生防菌资源。