鸭黄病毒感染逆转录半套式PCR检测方法的建立

根据GenBank发布的黄病毒Bagaza毒株的NS3基因的保守序列设计了3条引物,建立了一种适用于鸭黄病毒的半套式PCR快速检测方法。采用该方法对鸭黄病毒山东分离株进行检测,结果半套式PCR对2株分离株均能扩增出277bp的特异性条带,而对鸭瘟病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的扩增结果均为阴性;经检测该方法第1次扩增的敏感性为1×105拷贝/μL,第2次扩增的敏感性为1×102拷贝/μL,第2次扩增的敏感性比第1次高103倍;该方法对山东省各地采集的24份疑似病料可检出22份阳性。表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV—Ⅰ）A66株的RNA聚合酶基因序列,设计合成了2对引物,建立了适合DHV-I快速检测的逆转录套式PCR方法（RT-nested-PCR）,采用该方法对DHV-Ⅰ A66弱毒株和R85952强毒株进行了检测。结果显示,均能扩增到304bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝组织、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性腔上囊病病毒、减蛋综合征病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100Pg,第2次扩增的敏感性是1fg,第2次比第1次扩增的敏感性高10^6倍。表明,所建立的逆转录套式PCR方法可用于鸭病毒性肝炎（DVH）的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等。     

应用逆转录套式PCR检测新城疫病毒核酸

选择DNV融合蛋白保守的编码区域,设计并合成了一对外引物和一对内引物,建立并优化了检测新城疫病毒核酸的逆转录套式PCRI地,通过检测NDV感染的实验客观存在病料和临床病料,结果表明,逆转录套式PCR法最低能鉴别出约0.3pg的NDV RNA,攻毒后第8天还能从非免疫鸡和SPF鸡泄殖腔拭子中检出DNV,第8天非免疫鸡泄殖腔拭子中NDV的最大检出率为5/10,第8天SPF鸡泄殖腔拭子中NDV的最大检出率为6/10,对非免疫鸡和SPF鸡的泄殖腔中NDV最佳检出时间均在攻毒后第5天。逆转录套式PCRY应运地临床样品中DNV的最大检出率为6/7,经核酸杂交验证,该法具有很高的特异性和敏感性,也比较简便快速,为从分子水平探讨NDV的发病机理、临床早期快速诊断提供了新的研究手段。     

B亚型禽偏肺病毒逆转录套式PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank发布的B亚型禽偏肺病毒Fusion(F)基因的保守序列设计2对引物,建立了一种适用于B亚型禽偏肺病毒的逆转录套式PCR检测方法.采用该方法对B亚型禽偏肺病毒山东分离株进行检测,可以特异性地扩增出415 bp的目的片段.此方法具有高度特异性和敏感性,以H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒作为模板进行扩增,结果均为阴性.经检测,该方法第1次PCR扩增的敏感性为102 copies/μL,第2次扩增的敏感性为102 copies/μL,第2次扩增敏感性比第1次高105倍.应用本方法对采自山东省不同地区的64份可疑临床病料进行检测,最终从64份疑似病料中检测出37份为阳性.结果表明,所建立的套式PCR检测方法具有特异、敏感、实用等优点,为B亚型禽偏肺病毒的快速诊断以及深入研究奠定了基础.     

J亚群禽白血病病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽白血病病毒(ALV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为478 bp,内部引物的扩增片段大小为314 bp,建立了适合ALV快速检测的套式PCR方法(nested-PCR)。采用该方法对ALV毒株进行了检测,试验结果表明,能扩增到314 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽网状内皮增生病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高10⁵倍。所建立的套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于禽白血病病毒(ALV)的临床诊断和分子流行病学调查等。     

禽流感病毒NP cDNA反义逆转录病毒载体的构建及重组病毒的鉴定

根据反义ＲＮＡ作用原理,以禽流感病毒（ＡＩＶ）Ｈ１４Ｎ５　ｃＤＮＡ全长及５’端２３５个ｂｐ为目的基因,反向插入反转录病毒载体 ｐＬＸＳＮ中,命名为 ｐＬＸＳＮ－ＮＰ及 ｐＬＸＳＮ－ＮＰ,用脂质体包裹重组质粒转染包装细胞 ＰＡ３１７,Ｇ４１８筛选抗性克性,扩增单个克隆后提取包装细胞上清的病毒ＲＮＡ（ｖＲＮＡ）,以巢式ＰＣＲ方法检测,以及用包装细胞上清（重组病毒）感染滴定细胞系ＮＩＨ３Ｔ３,表明已筛选出产毒的的克隆细胞质,得到重组逆转录病毒,为反义ＲＮＡ抑制禽流感病毒复制的实验研究奠定了物质基础。     

鸭圆环病毒套式PCR检测方法的建立

根据GenBank发布的鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)序列(AY228555),运用Primer Premier 5.0设计2对引物,建立了适合DuCV快速检测的套式PCR方法,采用该方法对从安徽省望江县采集的发病鸭肝脏、胸腺、法氏囊、肾脏和脾脏等内脏病料进行DuCV检测。结果显示,套式PCR对所有内脏病料均能扩增出340 bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝脏、鸭瘟病毒、禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、网状内皮组织增生病毒、鸡传染性贫血病毒、鸭源大肠杆菌和鸭疫里氏杆菌的扩增结果均为阴性;该方法第1次扩增的敏感性是1 ng,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高106倍;表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭圆环病毒(DuCV)感染的临床诊断和流行病学调查。     

鸡贫血病病毒套式PCR检测方法的建立及应用

鸡贫血病病毒不仅引起鸡的传染性贫血 ,而且也是引起鸡免疫抑制病的主要病原。本研究首次在国内建立了鸡贫血病病毒的套式PCR检测方法。试验证明此方法具有高度的特异性和敏感性 ,以鸡马立克氏病毒、鸡网状内皮组织增生病毒、鸡传染性法氏囊病毒、正常MDCC_MSB1细胞DNA作为模板扩增时均未出现可见带 ,在检测鸡的各种组织病料时均未出现假阳性结果 ,该法比一次性PCR的敏感性高约 1 0 0 0倍 ,能检测到约一个拷贝的鸡贫血病病毒DNA ,而一次性PCR只能检测到3.6× 1 0 3 个拷贝。此方法已成功地应用于临床试验。对于鸡贫血病毒的许多鸡胚分离物和细胞分离物 ,一次性PCR不能扩增出可见电泳条带 ,而套式PCR都能扩增出特异的DNA片段 ,从而说明 ,套式PCR的敏感性大大高于一次性PCR ,可消除一次性PCR产生的假阴性结果     

鸡传染性贫血病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽传染性贫血病毒(CAV)基因序列,设计合成2对引物,外引物的扩增片段大小为485 bp,内引物的扩增片段大小为297 bp,建立了适合CAV快速检测的套式PCR方法(nested PCR),并采用该方法对CAV阳性毒株及临床病料进行了检测。结果显示,该方法能扩增到297 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽网状内皮增生病病毒、减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1步扩增的敏感性是100 pg,第2步PCR扩增的敏感性是1 fg,敏感性提高了10⁵倍。本研究建立的CAV套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于CAV的临床诊断和分子流行病学调查等。     

番鸭细小病毒套式PCR检测方法的建立及应用

通过比对分析GenBank上登录的多株番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus,MDPV）和鹅细小病毒（Goose parvovirus）全基因序列,选取两种病毒间相似性较低的区域设计合成了2对特异性引物,建立了能快速鉴别诊断MDPV的套式PCR方法。该法仅能特异地扩增MDPV,敏感性达到62copies／uL,比普通PCR高1000倍。运用该方法对分离的12份临床样品进行检测,结果检测出2份MDPV。本试验所建立的套式PCR方法可用于MDPV感染的临床诊断和流行病学调查。     

应用逆转录套式PCR检测猪流行性腹泻病毒

根据已发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因核苷酸序列,设计合成2对引物,其中外引物扩增片段长度为297 bp,内引物扩增片段长度为212 bp,在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了检测PEDV的套式RT-PCR检测方法,该方法较普通RT-PCR更加灵敏、可靠,能有效降低假阳性和污染,可用于PEDV的快速诊断和流行病学调查。     

绵羊肺腺瘤病毒实时荧光PCR检测方法的建立

为建立绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据JSRV的ag基因,选取其保守序列作为检测目的片段,设计并合成相应的引物和TaqMan探针,以自然病例的肺肿瘤组织基因组DNA为模板,经PCR扩增目的基因构建重组质粒pMD-gag,并将其作为阳性标准品,梯度稀释建立标准曲线,得到扩增方程为:y=-0.304x+38.4,扩增效率为100％,线性相关系数为0.999,该方法最低检出量为103拷贝,与其它病原核酸样品无交叉反应,其变异系数在1.374％以内.本研究为快速检测JSRV以及组装检测试剂盒奠定了基础.     

应用PCR技术合成生物素化蓝舌病病毒核酸探针的研究

用禽类成髓细胞病毒（AMV）反转录酶将蓝舌病病毒RNA反转录成cDNA,以dATP、dGTP、dCTP、dTTP和bio-11-dUTP作为TaqDNA聚合酶的底物,应用PCR技术合成了生物素化蓝舌病病毒核酸探针,经斑点杂交试验证明,合成的探针为蓝舌病病毒特异性核酸探针。     

绵羊肺腺瘤病毒SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank登录的绵羊肺腺瘤病毒gag基因序列设计1对特异性引物，经RT—PCR扩增出了276bp的片段。产物经回收与pMD18-TVector连接后转化到基因工程菌DH5a中，提取重组质粒，经PCR及测序鉴定后，作为阳性模板建立SYBRGreenI荧光定量PCR标准曲线，并做敏感性试验、特异性试验、重复性试验和临床检测应用。结果表明，标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，产物Tm在82～82．5℃之间，灵敏度为2．22个拷贝／μL，特异性和重复性较好，较常规RT—PCR方法提前1h出检测结果。本试验建立了检测JSRV的SYBR—GreenI荧光定量PCR方法，为该病的早期快速诊断，并定量分析JSRV感染程度奠定了基础。     

应用体外重组PCR技术构建鸡单链抗体基因的研究

用异硫氰酸胍与β-巯基乙醇联合变性的方法，从罗曼鸡脾脏中提取总BDA，RDA样品经紫外检测后，A230=0.0715,A260=0.1518,A280=0.0793；根据莱航鸡免疫球蛋白的轻、重链可变区基因的骨架区1和骨架区4的序列，分别设计一对引物，通过反转录-PCR方法，分别扩增出了罗曼鸡的轻、重链可变区基因，1．5％的琼脂糖凝胶电泳图谱显示其大小分别约为360bp和420bp；以VL和VH为模板，借助重组PCR手段，构建了vL-Linker-VH形式的鸡单链抗体，1．5％的琼脂糖凝胶电泳图谱显示出一条约780bp区带；为进一步构建鸡的噬菌体抗体库和筛选特异性的鸡单链抗体打下了基础。     

犬瘟热病毒RT-nested PCR检测方法的建立与应用

根据犬瘟热病毒（CDV）弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白（NP）基因序列设计了套式引物，建立了RT-nested PCR检测方法。特异性试验表明，该法可以特异扩增出CDV NP基因片段，但从RNA病毒狂犬病病毒（RV）、犬副流感病毒（CPIV）、犬冠状病毒（CCV），DNA病毒犬细小病毒（CPV）、犬腺病毒（CAV）及正常Vero细胞中均不能扩增出条带。敏感性试验表明，RT-PCR可以扩增10^-6稀释度的病毒RNA，而建立的RT-nested PCR可以扩增到10。稀释度的病毒RNA，后者的敏感性明显高于前者。用RT-nested PCR法检测了2006年我国东北地区临床表现犬瘟热症状的病例19例，检出率达90％，明显高于RT-PCR的检出率（45％）。部分病例扩增片段的测序结果表明，CDVNP基因出现个别碱基变异。研究结果表明，建立的犬瘟热病毒RT-nested PCR方法敏感、特异，适用于动物犬瘟热的快速诊断。     

非洲猪瘟病毒常规PCR及Real-time PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因的核苷酸序列,设计并合成引物以及荧光标记的TaqMan探针,以含P72基因的重组质粒作为阳性模板,用于常规PCR和Real-time PCR方法的建立,结果表明常规PCR的检测灵敏度是600个拷贝的病毒核酸分子,Real-time PCR的检测灵敏度是20个拷贝的病毒核酸分子,两种PCR检测方法均具有特异性强、简单快速的优点。可以用于出入境检验检疫部门对非洲猪瘟病毒的快速检测。     

绵羊肺腺瘤病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)方法,根据外源性JSRV-NM株env基因序列,选其保守序列作为目的片段,设计引物和TaqMan探针,以自然病例的肺肿瘤组织基因组DNA为模板,经PCR扩增目的基因、克隆,重组质粒鉴定,并严格定量后,梯度稀释作为阳性标准品,优化反应条件进行Real-time qPCR扩增,获得的标准曲线为:Y=-3.308X+47.848,线性相关系数为0.991;Ct值变异系数小,并且灵敏度高,初步建立了检测JSRV前病毒DNA的Real-time qPCR方法。应用该方法对不同来源(A、B、C、D、E组)的绵羊外周血及其他组织样品进行测定其前病毒载量。结果显示B组和C组外周血白细胞、肺脏、肺门淋巴结以及鼻液中检测均为阳性,并发现前病毒DNA的载量在肺脏中明显高于外周血白细胞;D组虽未发现有绵羊肺腺瘤(SPA)临床症状,但在肺门淋巴结里可以检测到;E组中1只绵羊的肺脏也检出低拷贝数的前病毒DNA,而在A组中检测结果均为阴性。本研究对检测未知羊群JSRV感染程度及研究SPA流行病学等均有重要意义。