凡纳滨对虾CTNNBL1基因克隆及表达分析

[目的]明确CTNNBL1基因在凡纳滨对虾抗病过程中的功能作用,为深入探讨对虾抗病免疫机制提供参考依据.[方法]采用RACE-PCR克隆凡纳滨对虾CTNNBL1基因(LvCTNNBL1),利用在线软件进行生物信息学分析,并进一步分析其组织表达特征及应答白斑综合征病毒(WSSV)和副溶血弧菌感染的表达模式.[结果]LvCTNNBL1基因cDNA全长1906bp,其中开放阅读框(ORE)长1692 bp,编码563个氨基酸,含有1个CTNNBL结构域.同源性分析发现LvCTNNBL1蛋白与大型溞(Daphnia magna)同源蛋白的相似度最高,为77%.基于CTNNBL1基因序列的系统发育进化分析结果显示,凡纳滨对虾被聚为无脊椎动物一类,与同为节肢动物的大型溞、西方蜜蜂(Apis mellifera)和美洲鲎(Limulus polyphemus)的亲缘关系较近.LvC TNNB L1基因在凡纳滨对虾中呈组成型表达,以在肠道中的表达量最高、表皮中的表达量最低.注射感染WSSV后,LvC TNNB L1基因在凡纳滨对虾血细胞中的表达量呈先下降后上升趋势,在所有检测时间点与对照组间存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01,下同)差异;注射感染副溶血弧菌后,LvCTNNBL1基因在凡纳滨对虾血细胞中的表达量呈先上升后下降趋势,感染后12h内较对照组极显著升高.[结论]LvCTNNBL1基因表达量在病毒和细菌感染时发生明显变化,可能参与了凡纳滨对虾的抗病免疫途径.     

凡纳滨对虾ATG6基因克隆及其在WSSV感染中的表达

[目的]克隆获得凡纳滨对虾自噬相关基因Lv ATG6 cDNA全长,揭示其组织表达特征及其在白斑综合症病毒(WSSV)感染后的表达变化。[方法]利用PCR方法克隆Lv ATG6,半定量PCR方法检测Lv ATG6在对虾10种组织中的表达情况及WSSV侵染后Lv ATG6在对虾鳃和肝胰脏2种组织中的基因表达变化。[结果]克隆获得Lv ATG6 cDNA全长1 275 bp,编码424个氨基酸,预测蛋白分子量大小为51.5 k D;Lv ATG6基因在凡纳滨对虾10种组织中均有表达,无组织表达特异性;Lv ATG6在病毒感染不同时间的对虾鳃和肝胰脏组织中均出现明显的表达变化。[结论]凡纳滨对虾Lv ATG6及参与的细胞自噬可能在WSSV病毒感染增殖过程中发挥了重要作用,该研究为深入揭示凡纳滨对虾细胞自噬与WSSV病毒作用关系奠定了基础。     

凡纳滨对虾WDS基因克隆及其表达分析

[目的]分析WDS基因在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)各组织中的表达情况及应对不同病原感染时的表达变化,以揭示WDS在动物体除生殖外其他生理活动中的功能作用.[方法]采用RACE-PCR克隆凡纳滨对虾WDS基因(LvWDS)cDNA序列,利用在线生物信息学软件进行序列分析,并以实时荧光定量PCR分析LvWDS基因在凡纳滨对虾不同组织中的表达情况及不同病原感染后的表达变化.[结果]LvWDS基因(GenBank登录号MH330316)cDNA序列全长1880 bp,其中,开放阅读框(ORF)978 bp,5'端非编码区(5'UTR)183 bp,3'端非编码区(3'UTR)719 bp,编码325个氨基酸.LvWDS氨基酸序列含有7个WD40重复序列(保守结构域),与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)WDS氨基酸序列的相似性最高,为99%,基于WDS氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示LvWDS与拟穴青蟹WDS的亲缘关系最近.LvWDS基因在凡纳滨对虾精囊中的相对表达量最高,在血细胞、鳃和肠道等免疫组织中处于较高表达水平,在肌肉组织中的表达水平最低.经白斑综合症病毒(WSSV)和副溶血弧菌(Vib-rio parahaemolyticus)感染后,凡纳滨对虾血细胞、鳃和肠道组织中LvWDS基因的相对表达量均不同程度发生变化.[结论]WDS进化十分保守,其在不同物种中的功能稳定.LvWDS除了在凡纳滨对虾生殖发育中发挥重要作用外,可能还与免疫相关,在凡纳滨对虾抗病免疫中发挥作用.     

凡纳滨对虾eIF5A基因的克隆及表达分析

真核细胞翻译起始因子5A(eIF5A)是真核生物细胞内的蛋白质翻译起始因子.近年来的研究发现eIF5A在动植物细胞衰老死亡、环境胁迫应答和免疫应答等过程中起着重要的调控作用.通过对凡纳滨对虾cDNA文库进行测序,首次获得了包含eIF5A完整的氨基酸序列的cDNA.该cDNA包含474 bp的开放阅读框,编码157个氨基酸,预测分子量约为17.257 ku,理论等电点为5.06.凡纳滨对虾eIF5A和其他物种对比结果显示,该基因的氨基酸序列和其他物种有较高的同源性.实时定量RT-PCR结果显示,eIF5A基因在凡纳滨对虾不同组织中的mRNA表达没有明显的差异.对WSSV、TSV和IHHNV感染的凡纳滨对虾的肝胰腺的实时定量RT-PCR结果显示,病毒感染的凡纳滨对虾的eIF5A基因的表达明显增加,分别是对照样品表达量的2.2、2.5和1.6倍,表明eIF5A可能涉及凡纳滨对虾的抗病毒免疫应答.     

凡纳滨对虾HSP10基因序列与低温表达分析

[目的]克隆分析凡纳滨对虾HSP10基因,为研究其在寒冷耐受过程中发挥调控功能提供参考依据.[方法]搜索EST库获得凡纳滨对虾HSP10基因序列,再通过RACE-PCR扩增获得凡纳滨对虾HSP10基因cDNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并通过荧光定量PCR分析HSP10基因的组织表达及低温胁迫下表达量的变化.[结果]凡纳滨对虾HSP1基因cDNA全长720 bp,包含306 bp的开放阅读框,编码102个氨基酸.以各物种的HSP10蛋白序列构建系统进化树,能较好反映各物种间的进化关系.荧光定量PCR分析结果显示,凡纳滨对虾HSP10mRNA在各组织中呈遍在表达,其中以肌肉中的表达量最高.低温表达谱分析结果显示,凡纳滨对虾HSP10mRNA在低温处理凡纳滨对虾的各组织中均呈下调表达,当处理温度降至13℃,其在肝胰腺中表达量降至最低.[结论]凡纳滨对虾HSP10在结构和进化上较保守,其mRNA表达量在低温胁迫下呈下降趋势,可能在寒冷耐受过程中发挥负调控作用.     

凡纳滨对虾钙蛋白酶M、D和B型基因的克隆及序列比较分析

通过克隆凡纳滨对虾钙蛋白酶B(Calpains,Calp-B)、钙蛋白酶D(Calpains,Calp-D)、钙蛋白酶M(Calpains,Calp-M)基因序列,并对其进行生物性息学预测和分析。根据同源比对设计引物,以凡纳滨对虾肌肉组织的c DNA为模板PCR扩增目的基因,克隆测序和拼接。结果:首次获得凡纳滨对虾的Calp-M和Calp-D基因序列,Calp-M、Calp-B和Calp-D3个基因的部分c DNA序列长度分别为597、1739、623 bp,分别含有507、924、232 bp的开放阅读框(ORF),分别编码169、307和77个氨基酸的蛋白前体,分子量为19.350、35.732、9.082 KDa,等电点分别为4.656、6.502、5.522。成功克隆了凡纳滨对虾Calp-M、Calp-B和Calp-D3个基因的部分序列并对其进行了部分生物信息学预测分析,为该基因家族功能的研究提供一定的研究基础。     

凡纳滨对虾Crustin-like基因的克隆及在副溶血弧菌感染条件下的表达分析

【目的】研究凡纳滨对虾Crustin-like基因(即CL基因)的结构和功能,探明CL基因是否参与副溶血弧菌侵染条件下的免疫应答,为进一步研究凡纳滨对虾的免疫机制和抗病育种奠定基础。【方法】采用RT-PCR技术克隆凡纳滨对虾CL基因;用DNAstar、Clustalx、MEGA 5.0、PROSITE、TMpred和SignalP软件,分析CL基因序列及其蛋白结构,并预测蛋白功能;利用副溶血弧菌进行攻毒试验和实时定量PCR,检测CL基因在病原侵染条件下的表达情况。【结果】克隆获得了凡纳滨对虾CL基因(登录号:JQ824114)的cDNA,全长为501bp,含有33bp的5′非翻译区(1～33bp)和24bp的3′非翻译区(478～501bp),编码区为444bp,共编码147个氨基酸;对CL蛋白结构及功能的分析表明,该蛋白编码蛋白质含有1个信号肽、1个跨膜螺旋和1个WAP结构域;攻毒试验表明,副溶血弧菌刺激可导致CL基因表达量的明显变化,总体呈现出先降低后升高的变化趋势。【结论】克隆了凡纳滨对虾CL基因的全长,发现其与副溶血弧菌侵入后引发的免疫反应密切相关,可以作为副溶血弧菌感染前期诊断的参考指标。     

凡纳滨对虾肌钙蛋白Ⅰ型基因4种不同剪切体的序列分析

采用RT-PCR技术克隆了凡纳滨对虾肌钙蛋白Ⅰ基因全长编码序列,对其核苷酸序列和编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析,并在对虾肌钙蛋白Ⅰ基因的编码区查找了单核苷酸多态性位点。结果显示：本研究克隆获得了凡纳滨对虾肌钙蛋白Ⅰ基因的4个可变剪切体,其编码的蛋白质均具有Troponin超家族结构域特征,同源性比对发现该蛋白的氨基酸序列在节肢动物中高度保守。系统进化分析发现凡纳滨对虾Tn-Ⅰ3和Tn-Ⅰ4与中国对虾和小龙虾的Tn-Ⅰ遗传距离较近,而Tn-Ⅰ1和Tn-Ⅰ2单独聚为一支,且与其他物种Tn-Ⅰ遗传距离较远;通过测序比较不同个体凡纳滨对虾Tn-Ⅰ基因序列发现在Tn-Ⅰ的4种不同剪切体编码区共同序列区第302位和472位碱基分别存在2个（A/G） SNP位点,其中位于第302位碱基的（A/G）错义突变使编码氨基酸由甘氨酸变为了谷氨酸（G/E）。凡纳滨对虾Tn-Ⅰ基因不同剪切体及编码区错义突变的发现为进一步探讨其基因功能奠定了基础。     

凡纳滨对虾烯醇酶基因Enolase的克隆及表达分析

以生长性状分离的凡纳滨对虾家系的肌肉组织.构建凡纳滨对虾生长性状差减cDNA文库.斑点杂交筛选获得Enolase基因,克隆获得全长编码区序列.序列分析表明,序列包含1 305 by的开放阅读框.推测编码的蛋自质含434个氨基酸.预测的分子量为47.4 ku,等电点为5.67.通过荧光定量PCR法研究了Fnolase基因在凡纳滨对虾的不同组织和不同生长期的肌肉组织中的表达情况,结果显示,Fnolase基因在凡纳滨对虾的心脏、肝胰腺、肌肉、胃、肠、眼柄、鳃和血等组织或器官中都有表达;在肌肉组织中表达量最高,在肝胰腺中表达量最低;在日龄为125 d的对虾肌肉组织中表达量量高,在口龄为80 d的对虾肌肉组织中表达量最低.     

利用高通量测序技术分析IHHNV感染凡纳滨对虾的基因差异表达

[目的]研究传染性皮下及造血组织坏死病毒（Infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus,IHH-NV）感染凡纳滨对虾的基因差异表达,为进一步了解IHHNV与凡纳滨对虾的相互作用分子机制提供参考.[方法]采用454高通量测序技术对IHHNV感染和对照凡纳滨对虾进行转录组测序,测序获得的序列除去接头后用iAssembler软件进行拼接得到unigene（单一基因序列）,通过计算各unigene的转录本数目（RPKM）确定差异表达基因,并以实时荧光定量PCR验证基因的差异表达.[结果]采用454高通量测序技术对IHHNV感染和对照凡纳滨对虾进行转录组测序,共获得208690条短序列,序列拼接共得到21912条tmigenes;通过对IHHNV感染和对照凡纳滨对虾的测序数据比较分析,结果发现221个差异表达基因,包括81个上调表达基因和140个下调表达基因.经实时荧光定量PCR验证,454高通量测序数据统计的基因表达差异结果可靠.[结论]IHHNV感染显著影响凡纳滨对虾免疫相关基因的表达,而利用高通量测序技术可有效检测出这些差异表达基因.     

小麦液泡膜反转运蛋白基因TaNHX1的生物信息学分析

[目的]利用生物信息学方法分析基因的功能,[方法]通过生物信息学数据库和因特网上的软件进行分析,对小麦液泡膜Na+/H+反转运蛋白基因TaNHX1的理化性质、结构与功能进行了预测。[结果]TaNHX1基因编码的蛋白是一种相对分子质量为59.7 kD、等电点pI为8.13的疏水性稳定蛋白,富含Leu、Phe、Lle、Gly、Ser、Val、Ala等氨基酸。TaNHX1基因编码的氨基酸序列内含有一段氨氯吡嗪咪的结合域的高度保守序列FF-YLLPI。同源性比较发现TaNHX1与AeNHX1、TiNHX1的亲缘关系很近,分别是99%和97%,推测他们可能为同源基因,具有相似的生物学功能。[结论]该研究为进一步探讨TaNHX1的生物学功能奠定了基础。     

大鲵泛素结合酶cgsUBE2L3基因克隆及其在免疫应答中的表达分析

[目的]研究泛素结合酶UBE2L3基因在大鲵免疫应答过程中的作用。[方法]克隆大鲵泛素结合酶基因(cgsUBE2L3),进行相关生物信息学分析,并通过qRT-PCR对其组织分布及免疫刺激下的表达谱进行分析。[结果]成功克隆了cgsUBE2L3基因,该基因全长包含一个462 bp的开放阅读框,编码154个氨基酸,预计蛋白分子量为21.2 ku;cgsUBE2L3氨基酸序列保守性很高,与非洲爪蟾的同源性高达97.4%;此外,qRT-PCR结果显示,cgsUBE2L3基因在大鲵组织中广泛分布,且被LPS感染的大鲵多个免疫组织中cgsUBE2L3的mRNA水平均发生了明显变化。[结论]cgsUBE2L3基因具有高度保守的结构特征,其组织分布具有特异性且参与大鲵抵抗LPS刺激的免疫应答。     

无核荔枝半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因克隆及序列分析

[目的]对无核荔枝的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因进行克隆,并对其序列下进行分析。[方法]根据构建的无核荔枝胚败育SSH消减文库的半胱氨酸蛋白酶抑制剂EST序列,通过RACE技术获得半胱氨酸蛋白酶抑制基因的核苷酸序列并应用生物信息学软件进行分析。[结果]获得一个635 bp的半胱氨酸蛋白酶抑制基因序列,预测该序列含有321 bp的开放阅读框,推导其编码的蛋白质含106个氨基酸,具有半胱氨酸蛋白酶抑制剂保守区,与多个物种的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因具有较高的同源性。[结论]为进一步研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂在植物中的生理功能奠定了基础。     

动物组蛋白H3K4三甲基化转移酶MLL3的生物信息学分析

[目的]对动物组蛋白H3K4三甲基化转移酶MLL3进行生物信息学分析。[方法]利用生物信息学的方法,对小鼠MLL3的基因结构、氨基酸序列、系统进化树、染色体定位和共线性等问题进行分析。[结果]编码合成的小鼠MLL3蛋白质一级结构包括7个锌指结构域、1个HMG-box(高迁移率族蛋白)、1个FYRN(N-末端富含苯丙氨酸或酪氨酸区域)、1个FYRC(C-末端富含苯丙氨酸或酪氨酸区域)、1个SET域和1个postSET域;从序列对比和同源性上发现,该研究中的19种动物都基本上具有这些结构,说明这些结构在进化上是相对保守的,其中SET域具有高度的保守性,是维持组蛋白甲基化酶活性所必须的;从系统发生上看,19种动物在进化树上的位置与其分类地位相一致;在共线性分析中,虽然小鼠和人的MLL3基因位于不同的染色体上,但其上游和下游具有相同的基因,说明小鼠和人的MLL3基因具有共线性。[结论]不仅揭示了MLL3的核苷酸序列及其氨基酸序列的一级结构,为以后研究其高级结构和蛋白质的功能奠定了基础;同时也为后期进行小鼠MLL3基因的引物设计、启动子分析、基因的克隆、定位和表达的调控模式研究奠定了基础。     

广西巴马小型猪SP1基因克隆测序及其真核表达载体的构建

[目的]克隆广西巴马小型猪特异性蛋白1(SP1)基因,并构建其真核表达载体,为揭示其对猪生长发育的调控机理打下基础.[方法]利用RT-PCR从广西巴马小型猪背最长肌组织中扩增SP1基因,采用DNASTAR、TMHMM等分别进行基因生物信息学分析;以pEGFP-N1质粒构建真核表达载体pEGFP-N1-SP1并转染293T细胞,于转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察并拍照.[结果]克隆获得的广西巴马小型猪SP1基因与GenBank中野猪(Sus scrofa)的参考序列(XM_005652569.3)一致,未发现碱基突变位点;其编码序列(CDS)全长2340 bp,编码779个氨基酸.广西巴马小型猪SP1蛋白不存在跨膜结构,也不存在信号肽,不属于分泌型蛋白;其二级结构中α-螺旋占17.84%,延伸链占21.31%,β-转角占9.76%,无规则卷曲占51.09%.构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能成功转染至293T细胞中并表达出绿色荧光蛋白.[结论]广西巴马小型猪SP1基因CDS序列编码蛋白主要参与细胞内活动,而非外分泌型蛋白,以SP1基因构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能转染293T细胞并成功表达,可直接用于后期SP1基因功能探索及干扰表达等研究.     

动物组蛋白H3K4三甲基化转移酶MLL3的生物信息学分析(英文)

[目的]对动物组蛋白H3K4三甲基化转移酶MLL3进行生物信息学分析,从而探寻其相对保守的进化过程以揭示组蛋白H3K4三甲基化转移酶MLL3在在人类癌症的中的作用。[方法]利用生物信息学的方法,对小鼠MLL3的基因结构、氨基酸序列、系统进化树、染色体定位和共线性等问题进行分析。[结果]编码合成的小鼠MLL3蛋白质一级结构包括7个锌指结构域、1个HMG-box(高迁移率族蛋白)、1个FYRN(N-末端富含苯丙氨酸或酪氨酸区域)、1个FYRC(C-末端富含苯丙氨酸或酪氨酸区域)、1个SET域和1个postSET域;从序列对比和同源性上发现,该研究中的19种动物都基本上具有这些结构,说明这些结构在进化上是相对保守的,其中SET域具有高度的保守性,是维持组蛋白甲基化酶活性所必须的;从系统发生上看,19种动物在进化树上的位置与其分类地位相一致;在共线性分析中,虽然小鼠和人的MLL3基因位于不同的染色体上,但其上游和下游具有相同的基因,说明小鼠和人的MLL3基因具有共线性。[结论]不仅揭示了MLL3的核苷酸序列及其氨基酸序列的一级结构,为以后研究其高级结构和蛋白质的功能奠定了基础;同时也为后期进行小鼠MLL3基因的引物设计、启动子分析、基因的克隆、定位和表达的调控模式研究奠定了基础。     

葡萄miR169及其靶基因的生物信息学分析

[目的]明确葡萄miR169(vvi-miR169)基因家族在葡萄生长发育及逆境胁迫响应中的重要作用,为其在葡萄分子育种和抗逆新品种选育中的应用提供参考依据.[方法]利用miRNA、Phytozome、NCBI等数据库及ClustalX 2.1、MEGA 6.0、RNAfold WebServer、psRNATarget等在线软件对vvi-miR169基因家族的序列分布、定位特征、二级结构、发育进化树和靶基因调控功能进行生物信息学分析.[结果]在miRBase中搜索到25条vvi-miR169基因同源序列,分别分布在6条染色体上,其中以位于Chr11上的序列最多,共有17条,位于Chr01、Chr04和Chr14上各有2条,而在Chr08和Chr17上各有1条.vvi-miR169基因家族成熟序列的碱基保守性很高,其前体序列均可形成稳定的二级茎环结构,且位于同一条染色体上的miR169基因序列显示出相对更近的亲缘关系.vvi-miR169基因家族共预测到21个靶基因,绝大部分miRNA都有多个靶基因,且不同miRNA具有相同的靶基因,其中有22个miRNA靶基因均含有GSVIVT01015120001(NF-YA转录因子).[结论]vvi-miR169基因家族序列保守性较高,家族特征明显,且具有相似的调控功能;NF-YA转录因子是vvi-miR169基因家族最主要的靶基因,也是葡萄生长发育过程中抗逆境胁迫的主要调控元件.     

人胰腺癌HPAC细胞中Furin蛋白的表达和序列分析研究

[目的]研究人胰腺癌HPAC细胞中furin蛋白的表达,并对furin蛋白序列进行分析,探讨furin对HPAC细胞的作用及影响.[方法]采用Western Blot方法检测HPAC中furin蛋白的表达,并运用生物信息学技术对furin蛋白序列进行分析.[结果]Furin在进化过程中保守性不强,而furin蛋白与Furin基因不同,在进化过程中高度保守,并且含有较多的螺旋和折叠结构.胰腺癌细胞系HPAC中的furin蛋白能高度表达;生物信息学分析结果显示,Peptidase S8/S53 domain是furin的主要功能结构域.[结论]可以通过对Peptidase S8/S53 domain进行突变,进一步分析furin的生物学功能,为胰腺癌靶向治疗提供理论依据.