抗农业病害真菌的海洋细菌筛选·发酵及分离初步研究

[目的]筛选对农业病害真菌有较强拮抗作用的海洋细菌。[方法]以油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)为筛选模型,采用平皿拮抗法筛选抗菌活性,对活性菌株进行发酵工艺优化,并对活性物质提取进行初探。[结果]海洋细菌菌株MB133具有明显抑菌现象,最优发酵工艺条件为最适培养温度28℃,发酵液中最适葡萄糖浓度2.0%,最适培养时间72 h;热稳定性试验表明活性物质对热不稳定;醇沉法提取有效物质发现抑菌组分在沉淀中。[结论]该研究为农用病害真菌的生物防治扩充了菌种资源。     

植物病原真菌广谱拮抗菌M29的筛选、鉴定及其抑菌机制

[目的]从蚯蚓粪中筛选广谱拮抗植物病菌的细菌并应用于生物防治,同时对它的抑菌机制进行初步探究。[方法]以10种病原真菌为靶菌,采用梯度稀释法和平板对峙法对蚯蚓粪中的拮抗菌进行初筛和复筛,并结合形态学特征、生理生化指标和16S rDNA基因序列对拮抗菌进行初步鉴定;采用生长速率法测定菌株及其脂肽类提取物的拮抗活性;通过平板倒扣法测定菌株产挥发性物质(VOCs)抑制病原菌菌丝生长的效果。[结果]筛选出拮抗水稻纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌、桃溃疡病菌和灰霉病菌的拮抗细菌分别为12、21、3和3株。其中,菌株M29(Gen Bank登录号:KU870670)能够有效且强烈地抑制灰霉等10种病原菌,对水稻纹枯病菌、大丽轮枝病菌和灰霉病菌的抑制率分别高达95%、91%和89%。结合形态学特征、生理生化指标和16S rDNA基因序列分析,初步鉴定菌株M29为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。菌株M29产生的脂肽类粗提取物对桃溃疡病菌的抑制率高达97%;产生的VOCs对大丽轮枝病菌的抑制率达65%,且VOCs不仅能明显抑制烟曲霉孢子的生长,还可抑制多种病原菌色素的产生。[结论]枯草芽孢杆菌M29菌株具有较高的广谱拮抗病原真菌的能力,在植物真菌病害生物防控中具有潜在的应用价值。     

草坪病害真菌拮抗放线菌的筛选及活性研究

[目的]筛选拮抗活性菌株和寻找新的活性代谢产物。[方法]以引起草坪真菌病害的3种病原真菌镰刀菌(Fusarium sp.)、丝核菌(Rhizoctonia sp.)、腐霉菌(Pythium sp.)为目标菌,通过琼脂块法初筛、管碟法复筛对采自云南香格里拉的茶园土壤进行了放线菌的分离筛选,并对其中活性较好的菌株进行了抗菌活性验证及活性物质的粗分离与检测。[结果]共分离得到85株放线菌,最终获得S-6、S-23、S-31 3株对病原真菌有较强作用的菌株,其中最高抑菌达61.90%。将3株拮抗放线菌液体发酵,并通过管碟法进一步验证抗菌活性;将发酵液乙酸乙酯萃取浓缩后,在萃取相中检测到活性成分。[结论]该研究结果为草坪病害防治提供了新资源。     

水稻胡麻斑病土壤拮抗菌的筛选·鉴定及抑菌谱分析

[目的]从土壤中筛选对水稻胡麻斑病病原菌(Helminthospotium oryzae Breda de Hann)具有稳定拮抗作用的细菌。[方法]利用稀释平板法对从土样中分离出的细菌进行拮抗菌的初筛,再采用室内平板筛选法进行复筛。将拮抗效果最佳的菌株进行培养,通过菌体形态特征观察和生理生化测试进行菌种鉴定,并采用平板对峙法进行拮抗菌的抑菌谱分析。[结果]从38份土样中分离了494株细菌,初筛获得拮抗菌株24株,复筛得到4株拮抗能力较强的菌株,经鉴定4种拮抗菌均为地衣芽孢杆菌属(Bacillus licheniformis),并得到其抑菌谱。[结论]为利用拮抗菌生物防治水稻胡麻斑病提供了理论依据。     

油茶炭疽病拮抗内生细菌的筛选

从健康的油茶叶中分离得到内生细菌菌株156株,经平板对峙法初筛,筛选到油茶炭疽病菌菌丝生长有抑制作用的有25株,再通过发酵法复筛,筛选到1株具有较强拮抗作用的菌株Y13,其抑菌直径达10mm以上．对Y13进行形态学和生理生化指标分析,初步鉴定为芽孢杆菌．抗菌谱测定表明,该菌对黄瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、番茄早疫病菌、油茶叶枯病菌等4种病原真菌也具有较强的抗菌活性．     

棉花黄萎病拮抗细菌7-30菌株的筛选与鉴定

[目的]筛选大丽轮枝菌的拮抗芽孢细菌,并对其进行生理生化鉴定。[方法]以棉花黄萎病痛原菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliag）V-190为测试菌,筛选对其具有拮抗作用的芽孢细菌。通过初筛及复筛,得到1株具有较强抑菌活性的拮抗细菌7-30菌株,并对该菌株进行了形态特征观察和生理生化鉴定。[结果]通过初筛从各地的土样中分离到84株拮抗细菌菌株,再对其中拮抗能力较好的18株进行了复筛,得到抑菌圈达18．9mm的强抑菌活性的拮抗细菌7-30菌株,结合其形态特征和生理生化特征综合考察,初步判断其为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。[结论]获得了大丽轮枝菌的拮抗芽孢细菌7-30菌株。     

土壤拮抗细菌的分离与抗植物病原真菌活性初步研究

为了分离筛选出土壤中对植物病原真菌具有拮抗作用的细菌,以4种土传病害病原菌为诱导菌株,采用土壤颗粒撒布法,从不同生态区农田土壤样本中分离得到55株拮抗细菌菌株。测定了部分拮抗菌株及发酵滤液对植物病原菌的拮抗作用。结果表明:分离获得的细菌菌株对病原真菌均表现出一定程度的抑制作用,其中对菜豆根腐病菌(Fusarium solani)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum)菌丝抑制率达60%以上的拮抗菌株,分别有1、12和8株。9株拮抗菌发酵滤液对大豆菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻稻瘟病菌(Pyricularia grisea)、玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)和马铃薯早疫病菌(Alternaria solani)6种植物病原菌表现出较高的抑菌效果,其中YS7菌株发酵产物对玉米大斑病菌、小麦根腐病菌、水稻恶苗病菌均表现较强的抑菌活性,对玉米大斑病菌抑菌圈直径最大达到了56.2mm。从抗菌谱上看,27株拮抗菌株代谢产物对4种以上的拮抗对象表现有抑菌活性,表明拮抗菌株代谢产物具有较为广谱的抑菌效果。     

解磷拮抗真菌分离鉴定及其对猕猴桃软腐病的生防评价

[目的]筛选可应用于猕猴桃果实软腐病的高效生防菌株,为猕猴桃软腐病生防制剂研发提供菌种资源.[方法]采集有猕猴桃软腐病发生的猕猴桃种植园健康植株根际土壤,利用解磷选择性培养基分离土壤中解磷真菌,采用平板对峙法、菌落直径法、继代培养及发酵液抑菌试验等从中筛选对猕猴桃软腐病菌具有拮抗作用的菌株,通过形态学结合分子生物学方法对拮抗菌株进行鉴定.[结果]从猕猴桃根际土壤中分离得到35株解磷真菌菌株,通过对峙培养从中筛选出5株对猕猴桃软腐病菌具有拮抗作用且抑菌率超过50.00%的菌株,其中MHT0308菌株的抑菌效果最佳,对猕猴桃软腐病菌的抑菌率达87.71%,复筛抑菌圈也明显,抑菌直径达33.50 mm;MHT0308菌株的含菌发酵液和无菌发酵液均对靶标菌生长有抑制作用,抑菌率分别达88.13%和80.87%;猕猴桃果实经MHT0308菌株发酵液处理后对猕猴桃软腐病的离体防效达87.00%;根据MHT0308菌株形态学特征结合其分子生物学鉴定结果,确定MHT0308菌株为哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum).[结论]MHT0308菌株对猕猴桃软腐病具有较好的防治效果,可作为一种重要的生防菌资源用于猕猴桃软腐病防治研究.     

樟叶越桔叶内生真菌的抑菌活性研究

为筛选具有抑菌活性的樟叶越桔叶内生真菌,以小麦雪腐病菌等10种植物病原真菌作为靶标菌,采用平板对峙法和生长速率法测定内生真菌的拮抗效果及其代谢产物的抑菌活性。结果表明:有10株内生真菌分别对小麦雪腐病菌、三七丝核病菌、番茄灰霉病菌、辣椒镰刀病菌和白菜黑斑病菌具有较强的抑菌活性,其中烟曲霉菌株的抗菌活性最强,对番茄灰霉病菌、辣椒镰刀病菌和三七丝核病菌的抑菌率分别为83.26%、68.82%和68.57%。     

肿节风炭疽病拮抗真菌筛选及作用机理研究

[目的]筛选肿节风炭疽菌(Colletotrichum dematium)拮抗真菌,为肿节风炭疽病的生物防治提供科学依据.[方法]采用平板稀释法和平板对峙法从肿节风主产区广西靖西市和都安县健康肿节风根系土壤中筛选出对肿节风炭疽病菌及14种其他植物病原真菌具有较强抑制作用的真菌,采用ELISA试剂盒测定拮抗真菌无菌发酵液中的蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶含量,综合平板对峙培养、抑菌谱及产酶能力选取综合表现最优的拮抗菌株;基于形态学和分子生物学特征对拮抗菌株进行鉴定.[结果]平板对峙试验结果表明,菌株JT-8、JT-3和DT-5对肿节风炭疽病菌具有较强的拮抗作用,其中拮抗作用最强的菌株是JT-8,对炭疽病菌的抑制率达91.57%.抗菌谱测定结果表明,菌株JT-8、JT-3和DT-5对供试14种病原真菌均有明显的拮抗作用,其中拮抗作用最强的为菌株JT-8,平均抑制率达89.88%,该菌株可产生几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶,可抑制炭疽病菌菌丝生长,病原菌菌丝表现为扭曲、断裂、分支缠绕和颜色加深等.通过形态学观察和ITS测序鉴定,确定菌株JT-8为淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum).[结论]淡紫紫孢菌对肿节风炭疽病病原菌具有强拮抗作用,能产生多种抗菌活性物质,且广谱抑菌,具有较好的生防开发潜能.     

荷花腐败病生防菌的筛选及鉴定

[目的]筛选对荷花腐败病菌有较强拮抗作用的生防菌,为荷花的健康生产及荷花腐败病的有效控制提供参考.[方法]采用抑菌圈法和对峙培养法从106株供试拮抗细菌中筛选对荷花腐败病菌有较强拮抗作用的生防菌,经形态学、生理生化和分子鉴定确定生防菌分类地位,通过与其他6种作物病原真菌的对峙培养了解生防菌的抑菌谱,并通过田间小区试验明确生防菌的田间防治效果.[结果]从供试的106株测试菌株中筛选获得4株对荷花腐败病菌具有拮抗效果的生防菌,其中以DR1菌株的拮抗效果最佳,抑菌带宽为9.8 mm.DR1菌株的拮抗谱较宽,对供试6种植物病原真菌均具有良好的抑制活性.田间防效试验结果表明,DR1菌株对荷花腐败病的平均防效为41.83%.根据16SrDNA和gyrB基因序列分析结果并其结合生理生化特征,将DR1菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).[结论]解淀粉芽孢杆菌的拮抗活性、耐热性和抗逆性强,且有较宽的抗菌谱,在荷花病害防治中具有较好的开发应用前景.     

产蛋白酶海洋细菌的筛选及产酶工艺优化

[目的]筛选产蛋白酶的海洋细菌资源。[方法]分别采用2216E培养基和酪蛋白固体培养基,对采自宁波洋沙山和象山海域的海水进行微生物的分离与纯化,采用平板透明圈法初筛和酶活力测定法复筛,采用16S r DNA序列分析进行菌株鉴定,并进行产酶工艺优化研究。[结果]纯化出15株产蛋白酶海洋细菌,从中筛选出1株产蛋白酶活力最高的菌株PB02,经鉴定为交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)。该菌株最适培养温度为20℃,最适装液量为10%,最适接种量为0.5%,最适转速为100 r/min,最适培养基pH为7。酶促反应最适温度为40℃,最适pH为10。[结论]该研究为蛋白酶高产菌株的改造和定向进化奠定了资源基础。     

紫外诱变吸水链霉菌选育高产农用抗生素菌株

[目的]为抗生素产生菌在农业生产中的应用奠定基础。[方法]以小麦赤霉菌为指示菌,以从吸水链霉菌海南变种S101菌株分离到的S510菌株为出发菌株,经紫外诱变后分别采用琼脂块法和二级摇瓶复筛法对其进行初筛和复筛,以选育出高产菌株,分析发酵培养基pH值和培养时间对发酵液效价的影响。[结果]当发酵培养基的pH值为5.5~6.5时,发酵液效价较高,最适pH值为6.0。发酵液的效价在72 h后可维持在较稳定的范围内,最佳发酵时间为96 h。通过连续2次紫外诱变,菌株的产抗生素能力比初始菌株提高了30.06%。将获得菌株在斜面培养基上连续传代5次后,仍有稳定的遗传性状。[结论]采用紫外诱变法选育该链霉菌是有效的。     

链霉素抗性筛选吸水链霉菌高产农用抗生素菌株研究

[目的]筛选吸水链霉菌的高产农用抗生素菌株。[方法]从海南土壤中筛选出1株吸水链霉菌,以经过自然分离和2次紫外诱变的S6-7为出发菌株,经过紫外光照射辅以链霉素抗性筛选后,再进行摇瓶发酵复筛。[结果]从62株随机挑选的单菌落中初筛出7株较好菌株,经斜面连续传代3次后复筛,发现5株菌株具有较好的正突变,正突变率可达8.06%,效价最高提高25.11%。[结论]将链霉素筛选法与传统紫外诱变法相结合,使菌株的产素能力有较大提高,而且极大地提高了菌种正向突变的筛选效率。     

链霉素抗性筛选吸水链霉菌高产农用抗生素菌株研究（英文）

[Objective] The research aimed to screen Streptomyces hygroscopicus strains with high production of agricultural antibiotics.[Method] A strain of S.hygroscopicus was screened from the soil of Hainan Island.After natural screening and consecutive ultraviolet induced mutation twice,S6-7 strain was obtained as the original strain then treated by UV irradiation and streptomycin resistance screening,and finally rescreened through shake-flask fermentation.[Result] 7 better strains were selected by primary screening from 62 single colonies which were picked out randomly.After 3 generations of consecutive cultivation on slant media and rescreening,5 strains presented obvious forward mutation.The forward mutation rate reached 8.06%,and the largest production increasing rate came up to 25.11%.[Conclusion] By combining streptomycin resistance screening and conventional ultraviolet induced mutation,both the antibiotic-producing capacity and forward mutation screening efficiency of the original strain were greatly enhanced.     

链霉素抗性筛选吸水链霉菌高产农用抗生素菌株研究

农用抗生素作为一类生物农药,具有使用剂量低,环境相容性好,选择性强的特点,因此受到普遍重视。目前已发现的天然抗生素有约2／3来源于链霉菌。利用链霉菌产抗生素能力与链霉素抗性基因之间的对应关系来定向筛选正向突变株,是目前农用抗生素科研领域的研究热点。     

鸡粪中具有产酒精能力酵母的初步筛选

[目的]筛选能发酵产酒精的酵母茵。[方法]在鸡粪样品中经过初筛、复筛,以及生理生化试验和发酵试验,确定所筛选的酵母菌株产酒精的能力,并对所筛选出菌株的适宜生长条件做初步研究。[结果]共筛选出4株可发酵菌株：HY-1、HY-2、HY-3和HY．4,其中HY-1产酒精能力最高。[结论]HY-1菌株的适宜生长条件为：pH值6．5,温度30℃,最适碳源为葡萄糖。该茵株的致死温度为50℃。在最适奈件下进行HY-1的酒精发酵试验,测得发酵液中的酒精度达6．90％。     

海洋真菌HZ-01菌株产几丁质酶的研究

[目的]探讨海洋真菌HZ-01菌株产几丁质酶的培养条件和部分性质。[方法]从海洋环境中筛选出1株几丁质酶高产真菌HZ-01,以该菌株为材料,进行不同碳源、氮源以及温度对菌株发酵产生几丁质酶的影响试验,研究几丁质酶的培养条件。将粗酶液在不同温度下保温60 min后,取样测定几丁质酶活力,分析几丁质酶的热稳定性和酸碱稳定性。[结果]海洋真菌HZ-01菌株产几丁质酶的最佳碳源为几丁质,蛋白胨为最佳氮源;以1.0%的几丁质作为碳源,0.1%的蛋白胨作为氮源,温度为30℃时,其产生的几丁质酶活力最高,且随着温度的上升,该酶活力下降;该酶的酸碱稳定性较差,只在pH值6~8具有较高活性。[结论]该研究为规模化生产几丁质酶初步奠定基础。     

海洋细菌N-LY-1菌株的农用功能活性研究及其种属鉴定

【目的】明确海洋细菌N-LY-1菌株的抑菌、促生作用及其促生机理,确定其分类学地位,为该菌株进一步开发为农用微生物制剂提供参考。【方法】以前期从江苏连云港海域鲈鱼肠道内分离获得的海洋细菌N-LY-1菌株为材料,采用平板对峙法、牛津杯法及室内盆栽试验测定N-LY-1菌株对12种植物病原真菌的抑菌作用及其对黄瓜的促生防病作用;通过测定N-LY-1菌株的解磷、解钾、固氮作用以及产吲哚乙酸（IAA）和铁载体能力,探明菌株的促生长作用机理;通过形态学观察、生理生化试验和16S rDNA序列分析,对菌株进行种类鉴定。【结果】N-LY-1菌株及其无菌发酵液对供试的12种植物病原真菌的抑菌带宽度均大于5.00 mm,均具有明显的抑菌作用,其中,其无菌发酵液对苹果轮纹病菌、小麦赤霉病菌、草莓灰霉病菌、苹果腐烂病菌、番茄早疫病菌和黄瓜枯萎病菌的抑制作用较强,抑菌带宽度在16.00 mm以上;其发酵液能促进黄瓜幼苗生长,在供试浓度范围内对黄瓜枯萎病的防治效果最高达81.5%;该菌具有固氮和解有机磷作用,能产生IAA和铁载体。结合菌落形态学观察、生理生化特征及分子生物学鉴定结果,将NLY-1菌株鉴定为海胆鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas echinoides）。【结论】N-LY-1菌株是一株具有较强抑菌、防病及促进植物生长作用的海胆鞘氨醇单胞菌;固氮、解有机磷及产IAA和铁载体是该菌株的促生作用机制。N-LY-1菌株具有进一步开发为农用微生物制剂的潜力。     

酒精耐受型酿酒酵母菌的诱变筛选

[目的]筛选酒精耐受型酿酒酵母菌最佳菌株。[方法]利用紫外线对酿酒酵母JL2008进行诱变处理,并结合氯化三苯四氮唑(TTC)进行筛选,对5株对酒精具有较强耐受性的突变株SC1～SC5的酒精耐受性进行比较,选择出2株酒精耐受性较强的突变株(SC1和SC5)进行酒精发酵,测定其生长速率和发酵性能。[结果]2株菌的酒精耐受能力远远高于出发菌株,均能在酒精体积分数为9%的培养基上生长;在含糖15%的培养基中,SC1的酒精发酵终浓度和发酵效率与原始菌株大致相同;在含糖30%的培养基中,SC1的酒精发酵终浓度和发酵效率分别是16.54%和85.2%,均高于原始菌株。[结论]突变株SC1在含酒精培养基中的生长和在浓醪条件下的发酵效果优于JL2008,是一株极具潜力的应用于浓醪发酵的酵母菌株。