碱性成纤维细胞生长因子对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

为研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响,试验对牛骨骼肌卫星细胞进行体外分离培养,在生长培养基和分化培养基中分别添加bFGF,观察细胞生长及分化情况,绘制细胞生长曲线,并进行EDU细胞增殖检测试验。结果显示,添加了bFGF培养基的细胞生长状态较对照组良好,细胞增殖速度快,细胞增殖率显著高于对照组(P<0.05),说明bFGF对牛骨骼肌卫星细胞在生长培养基和分化培养基中增殖都具有良好的促进作用。本研究建立了一种高效的牛骨骼肌卫星细胞培养方案,为骨骼肌卫星细胞的研究利用提供参考。     

牛骨骼肌卫星细胞的分离鉴定和诱导分化

为了在体外研究西门塔尔牛的肌肉生长发育过程并建立牛骨骼肌卫星细胞的原代细胞模型。本研究采用0.2%的Ⅱ型胶原酶消化后再使用0.25%胰酶消化获得牛骨骼肌卫星细胞（bovine skeletal satellite cell,BSSC）,并利用差速贴壁法分离获得纯化后的BSSC,使用RT-PCR、免疫荧光染色和Western blotting等方法鉴定BSSC,使用成脂诱导剂诱导其分化为脂肪细胞,油红O染色鉴定分化后细胞的成脂能力,使用2%马血清诱导其分化为肌细胞,RT-PCR鉴定静止期PAX7基因和肌细胞的标记基因MyoG在诱导前后表达量的变化。结果发现,分离纯化得到的BSSC呈梭形或纺锤形,细胞形态饱满,折光性强,随着培养时间的延长,细胞由原来的无序生长变为有序生长;RT-PCR检测发现,BSSC表面标志基因Desmin、c-Met、Myf5和特异性标志基因PAX7均呈阳性表达;免疫荧光染色及Western blotting结果显示,PAX7和MyoD基因均呈阳性表达;成脂细胞诱导分化后被油红O大量染色并观察到大量脂滴出现;成肌细胞诱导分化后静止时期PAX7基因表达量诱导前高于诱导分化后,而成肌标记基因MyoG表达量诱导前低于诱导分化后。综上,本研究成功分离获得BSSC,并证明BSSC具有分化成脂肪细胞和肌细胞的能力,为体外研究西门塔尔牛肉制品调控机制提供原代细胞模型。     

干扰HNRNPAB对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的作用研究

为了研究核不均一核糖核蛋白AB(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein AB, HNRNPAB)对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的影响。本研究以体外分离培养的鲁西黄牛胎牛原代骨骼肌卫星细胞为试验材料,体外诱导成肌分化,分别收取分化前和分化后第1、2、3天的细胞,提取RNA(每组设置4个重复)或蛋白质(每组设置3个重复),通过qRT-PCR、Western blot检测HNRNPAB在成肌分化前后的表达情况。随后合成HNRNPAB的干扰RNA,并转染牛骨骼肌卫星细胞干扰HNRNPAB的表达,设置阴性对照组;在试验组和对照组中,分别利用EdU试验检测细胞增殖情况,qRT-PCR技术、Western blot技术检测HNRNPAB、增殖标志因子Pax7、Cyclin D1及分化标志因子MyoG、MyHC的mRNA表达水平及蛋白表达水平。结果显示,HNRNPAB在牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程中的mRNA表达呈现先升后降的趋势,在分化第1天表达量最高,分化前后蛋白表达水平也具有显著差异。干扰HNRNPAB后,EdU细胞阳性率极显著上升(P<0.01),增...     

不同浓度油酸对延边牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响

试验旨在探究油酸对延边牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响。试验设1个空白对照组（CON）和3个油酸（OA）诱导组：50、100、200 μmol/L油酸组（OAL、OAM、OAH）。油酸诱导96 h后,通过测定细胞大小及活力评估油酸对细胞的影响。通过油红O染色和测定甘油三酯来验证脂滴的形成,通过实时荧光定量PCR测定相关成肌成脂基因的表达水平来验证脂肪细胞的生成。结果显示,与对照组相比,添加油酸后,延边牛骨骼肌卫星细胞内有脂滴生成,并且脂滴形成量、甘油三酯累积量与油酸呈剂量依赖关系;实时荧光定量PCR测定结果表明,成肌相关因子Pax3、MyoD显著下调（P<0.05）,成脂相关因子C/EBPβ、PPARγ显著上调（P<0.05）,脂肪酸代谢相关因子SCD显著下调（P<0.05）,PLIN2基因显著上调（P<0.05）。综合上述试验结果,用油酸诱导处理延边牛骨骼肌卫星细胞可促进细胞的成脂转分化。     

干扰lnc4351对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

为探究长链非编码RNA(lncRNA)对牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的影响,本研究以牛骨骼肌卫星细胞及已建立的体外成肌诱导分化模型为基础,以前期高通量测序获得的牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达差异倍数较大的一个预测lncRNA为靶标,对其进行生物信息学分析及亚细胞定位,命名为lnc4351。设计合成lnc4351的siRNA,转染牛骨骼肌卫星细胞,采用EdU染色的方法检测干扰lnc4351对细胞增殖的影响;对转染siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,观察肌管的形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MHC基因的mRNA及蛋白水平的表达变化,研究干扰lnc4351对细胞分化的影响。结果显示,lnc4351位于牛的14号染色体,不具有蛋白编码潜能,是一个未报道过的lncRNA,在牛骨骼肌卫星细胞的细胞质和细胞核内均有分布,主要存在于细胞核;干扰lnc4351表达后,EdU阳性细胞比率显著下降(P<0.05),说明下调lnc4351表达显著抑制了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;下调lnc4351表达后肌卫星细胞经诱导分化产生的肌管量呈现增多趋势,分化标志因子MyoG和MHC的蛋白水平显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),说明干扰lnc4351能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰lnc4351表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖并促进其成肌分化过程,为进一步开展lncRNA对牛骨骼肌发育的调控机制及肌肉发育相关研究提供参考。     

干扰lncbMD对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

旨在研究长链非编码RNA(lncRNA)对牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。本研究以体外分离培养的鲁西黄牛胎牛原代骨骼肌卫星细胞为试验材料,体外诱导成肌分化,以前期高通量测序筛选的肌肉组织特异性表达lncRNA为靶标,通过RACE技术对其进行全长扩增,命名为lncbMD,对lncbMD进行生物信息学分析和亚细胞定位。收取增殖期和分化期第1、2、3天的细胞,提取RNA(每组设置4个重复)或蛋白质(每组设置3个重复),通过qRT-PCR检测lncbMD在牛骨骼肌卫星细胞分化进程中不同时期的表达情况。根据lncbMD的序列设计合成干扰RNA,转染牛骨骼肌卫星细胞干扰lncbMD的表达,利用EdU试验检测细胞增殖情况,qRT-PCR技术检测lncbMD干扰效果、lncbMD的mRNA表达水平,增殖标志因子Pax7、Cyclin D1以及分化标志因子MyoG、MyHC的mRNA表达水平,荧光倒置显微镜观察细胞生长情况。结果显示,lncbMD全长序列1 902 nt,位于牛基因组23号染色体上,不具有编码潜能,是一条未报道的lncRNA。在牛骨骼肌卫星细胞与肌管中均主要存在于细胞核,在牛骨骼肌卫星...     

UBE2L3对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

将分离的牛骨骼肌卫星细胞(BSMSCs)进行体外培养,首先检测泛素结合酶UBE2L3在BSMSCs增殖分化过程中mRNA以及蛋白表达水平的变化.设计UBE2L3的3个干扰RNA(si-UBE2 L3-1、si-UBE2L3-2、si-UBE2L3-3),对干扰效果进行筛选.构建UBE2L3过表达质粒载体pcDNA3.1...     

干扰核心蛋白聚糖对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为探究肌肉生长抑制素(MSTN)对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究以前期MSTN^+/-蒙古牛与野生蒙古牛腿臀肌肌肉组织定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学筛选获得的表达差异倍数较大的核心蛋白聚糖(DCN)为靶标,以实验室前期分离培养的牛骨骼肌卫星细胞及建立的体外诱导成肌分化模型为对象,通过对设计合成的3个DCN siRNA干扰效果的筛选,将干扰效果最显著的si-DCN-2(si-DCN)转染牛骨骼肌卫星细胞。采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测增殖期(GM)牛骨骼肌卫星细胞中增殖标志因子Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,以及使用EdU染色的方法检测干扰DCN对细胞增殖的影响。对转染DCN siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化第3天(DM3)的肌管形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MyHC的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,并对DM3期肌管MyHC进行免疫荧光染色,以研究干扰DCN对细胞分化的影响。结果显示,干扰DCN表达后,增殖期牛骨骼肌卫星细胞中Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平都显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),且EdU阳性细胞率显著增加(P<0.05),表明干扰DCN表达显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖。干扰DCN表达后,牛骨骼肌卫星细胞分化第3天诱导形成的肌管直径呈现增大趋势,检测成肌分化标志因子MyoG在mRNA和蛋白水平的表达分别极显著和显著高于对照组(P<0.01;P<0.05),MyHC在mRNA水平显著降低(P<0.05),但在蛋白水平上极显著升高(P<0.01),免疫荧光结果显示,下调DCN后肌管融合指数显著高于对照组(P<0.05),说明干扰DCN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰DCN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。研究结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究奠定了基础。     

干扰DHX9对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

为研究天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-组氨酸盒解旋酶9 (DEAH (Asp-Glu-Ala-His)-box helicase 9,DHX9)对牛骨骼肌细胞增殖与分化的影响,利用已经建立的牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化模型,设计合成DHX9的si-RNA,采用荧光定量PCR和Western blot技术检测DHX9基因在成肌...     

干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为研究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,本试验以牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型为对象,以前期设计合成3个干扰RNA（si-MSTN-1、si-MSTN-2、si-MSTN-3）并对其进行干扰效果筛选为基础,将干扰效果极显著的si-MSTN-2（si-MSTN）转染牛骨骼肌卫星细胞,通过EdU染色法检测干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响;进一步对干扰MSTN的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过肌管形成状态和分化标志因子综合分析干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响：首先通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的肌管形成状态,然后利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测牛骨骼肌卫星细胞分化标志因子MyoG和MyHC在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果显示,干扰MSTN后,牛骨骼肌卫星细胞中EdU阳性细胞率极显著增加（P < 0.01）,说明下调MSTN表达极显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后形成的肌管数量和直径均呈现增大趋势,牛骨骼肌卫星细胞成肌分化标志因子MyHC在mRNA和蛋白水平的表达均极显著高于对照组（P < 0.01）,说明下调MSTN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰MSTN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖及成肌分化过程。本试验结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究提供了参考。     

不同发育阶段蒙古牛肌肉组织差异表达基因的筛选

应用mRNA差异显示技术,对两个发育阶段(16月龄和5岁龄)蒙古牛臀肌组织差异表达的基因进行研究,从分子水平分析影响不同发育阶段蒙古牛肉品质的遗传机制。经mRNA差异筛选获得6条差异表达的EST片段,与GenBank中序列进行相似性比对后发现,其中一条序列S1与牛的丝切蛋白2(cofilin 2, CFL2)基因高度同源(相似性99%),确认S1就是牛的CFL2基因;另外5条S2-S6在数据库中未发现同源序列,确定为新的EST片段。 采用相对定量PCR方法对差异表达基因CFL2进行真实性鉴定和差异表达量检测,结果显示,CFL2基因在5岁龄蒙古牛肌肉组织中的表达量是16月龄的3.8倍。过量的丝切蛋白2可以抑制单体型肌动蛋白的聚合及1型优质肌纤维的累积,其高表达可能导致了蒙古牛肉质性状的下降。     

骨骼肌特异性钙蛋白酶与蛋白质降解

骨骼肌特异性钙蛋白酶calpain-3是钙蛋白酶系统的一员,与肌细胞生成和细胞凋亡密切相关,同时也被认为参与了蛋白质降解过程.本文主要从骨骼肌特异性钙蛋白酶的结构功能和生理活性,并结合近年来国际上的研究成果来分析骨骼肌特异性钙蛋白酶在骨骼肌蛋白质降解中的作用.     

二甲双胍对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的影响

为探究二甲双胍对牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响,本研究将体外培养的牛骨骼肌卫星细胞分别用0（对照组）、1、2、4 mmol/L二甲双胍进行处理,采用CCK-8法筛选出二甲双胍作用于牛骨骼肌卫星细胞的最适浓度,接着通过EdU染色法检测二甲双胍处理牛骨骼肌卫星细胞后对其增殖的影响,然后对二甲双胍处理的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的细胞状态,然后利用Western blotting技术检测牛骨骼肌卫星细胞的分化标志因子肌球蛋白重链（MyHC）、肌细胞生成素（MyoG）在分化24、48和72 h的表达情况。结果表明,二甲双胍作用于牛骨骼肌卫星细胞的最适浓度为2 mmol/L。2 mmol/L二甲双胍处理牛骨骼肌卫星细胞后,其细胞增殖率显著降低（P<0.05）,说明二甲双胍可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖;牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后形成的肌管数量和直径均呈现减少趋势,牛骨骼肌卫星细胞成肌分化标志因子MyHC、MyoG在分化24、48和72 h的表达均显著低于0 mmol/L （对照）组（P<0.05）,说明2 mmol/L二甲双胍能够抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。研究结果表明,二甲双胍可以显著抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖及成肌分化过程。该研究为二甲双胍在肌肉发育调控及肌损伤修复方面的应用提供一定的理论依据。     

Effect of Basic Fibroblast Growth Factor on the Proliferation of Bovine Skeletal Muscle Satellite Cells

To investigate the effect of basic fibroblast growth factor (bFGF) on the proliferation of bovine skeletal muscle satellite cells,bovine skeletal muscle satellite cells were isolated and cultured in the medium with bFGF,the growth and differentiation state of muscle satellite cells were observed,and the growth curve and EDU cell proliferation assay were conducted.The results showed that cell morphology of bovine skeletal muscle satellite cells cultured in medium containing bFGF was better and proliferation rate was significantly higher than that in control group (P<0.05).The results indicated that bFGF could promote proliferation of bovine skeletal muscle satellite cells efficiently in growth medium and differential medium.Our study established an efficient method to culture bovine skeletal muscle satellite cells,which could provide reference for studying and using of skeletal muscle satellite cells.