一种适于PCR扩增的快速提取猪基因组DNA的碱裂解法

以大白猪背最长肌、脾脏、耳组织为材料,用碱裂解法和酚-氯仿法分别提取猪基因组DNA,用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增检测DNA的产量和质量,结果发现2种方法提取的DNA产量没有明显差异。通过猪MC4R、TEF-1基因特异引物进行PCR扩增均能得到目的条带。碱裂解法提取的DNA原液稀释5倍、10倍后作为模板均获得了较为稳定的扩增产物。该结果表明,简单、快速、无毒的碱裂解法适用于动物定性PCR检测时DNA的提取。     

肉中猪源性成分Real-time PCR定量检测技术

【目的】建立一种快速、准确的肉中猪源性成分定量检测方法。【方法】首先从GenBank数据库中筛选猪特异性的微卫星DNA,根据微卫星DNA核酸序列设计引物,对常见10种动物基因组DNA进行PCR扩增,通过有无扩增产物判断筛选的微卫星DNA对猪源性成分的特异性。然后根据微卫星DNA核酸序列,设计特异性引物和探针,建立猪源性成分Real-time PCR检测方法,采用双标准曲线分别对猪源性成分和总动物源性成分进行定量,计算猪源性成分的百分含量。【结果】筛选到猪特异性微卫星DNA（Accession EF172428）,根据其序列设计的引物SEQ-sus2-F/R只能从猪基因组DNA中扩增出目的条带,其他动物的基因组均无目的条带扩增。建立的Real-time PCR检测方法灵敏度为0.02 ng/25 μL反应体系。该方法能够准确检测出混合DNA样品中猪源性成分和混合肉样品中猪源性成分,百分误差分别约为1.32%和1.06%—7.12%。【结论】本研究利用Real-time PCR技术建立的定量猪源性成分的检测方法可以用来检测猪源性成分在混合样品中的百分含量。     

猪附红细胞体特异性PCR检测方法的建立

从猪血中分离附红细胞体,提取其基因组DNA,用EcoRI对基因组DNA进行酶切,将酶切片段进行琼脂糖电泳,得到一个1.8 kb的DNA片段,根据DNA序列分析与GenBank已知基因比较和PCR方法确定该片段具有特异性,以该片段为模板进行PCR,并将其扩增产物与其它猪的其他细菌DNA扩增产物相比较,建立一种检测猪外周血中附红细胞体的特异性PCR检测方法,并通过斑点杂交试验检测该产物特异性,通过临床应用检验该法的适用性。结果表明:扩增产物大小为782 bp,其序列与已知附红细胞体序列同源性为100%,斑点杂交试验证实该产物为附红细胞体特异性产物,将该方法应用于检测10头临床症状典型的感染猪和10头健康猪的血液,所有感染和隐性带菌猪的PCR检测结果为阳性,健康猪为阴性。猪外周血中附红细胞体的特异性PCR检测方法适用于检测无临床症状的隐性带菌动物。     

不同数量猪毛中提取基因组DNA的比较

在进行分子生物学试验尤其是动物分子标记的研究中需要大量纯化的基因组DNA,这些DNA通常情况下是从动物的血液、耳组织、肝脏等组织中提取,所提取的基因组DNA质量较好.但是,在进行本地猪遗传多样性研究过程中,通常需要大量的血样,其获得和收集较为困难,尤其是野猪的血样更不易获得.因而,从猪的毛发中提取合格的DNA将解决上述难题.通常认为,从动物的毛发中提取DNA无论从数量还是质量上均明显低于从血样或其他组织中提取的DNA .但也有从脱落的狗毛中成功地提取基因组DNA的报道.为了探索从毛发中提取合格DNA的途径,本试验通过从不同数量的猪毛中提取的DNA进行质量比较分析,找出适合于做分子标记试验所需猪毛样本数量,为提高样本收集效率,降低劳动强度和减低试验成本提供依据.     

猪毛干部位基因组DNA的三种提取方法比较

通过比较三种猪毛干基因组DNA提取方法,改进了提取猪毛干基因组DNA的技术方法。将DNA提取物进行琼脂糖凝胶电泳、紫外可见分光光度计及PCR扩增分析,结果表明,在毛干中能成功提取到基因组DNA,其浓度和纯度足以满足分子生物学技术试验的要求,该技术还可以减少对动物的伤害,在样品不易获得的濒危动物研究中尤为适用。     

从南阳黄牛被毛毛囊中提取DNA方法初探

从南阳黄牛被毛毛囊细胞和血液中分别提取DNA用于RAPD扩增。结果表明,从被毛毛囊细胞中提取DNA的方法简便可行。     

天冬药材基因组DNA提取方法研究

[目的]从天冬药材中提取可用于RAPD扩增的高质量基因组DNA。[方法]分别采用改良CTAB法、SDS法以及植物基因组DNA提取试剂盒法提取天冬药材基因组DNA;通过电泳、DNA浓度与纯度检测以及RAPD扩增效果确定天冬药材基因组DNA的最佳提取方法。[结果]CTAB法提取的基因组DNA较完整,DNA浓度与纯度均较高,可获得丰富的、清晰的RAPD条带。[结论]CTAB法为天冬药材基因组DNA提取的最佳方法,提取的DNA可用于天冬RAPD分析,该方法可为其他药材基因组DNA提取提供参考。     

单增李斯特菌基因组DNA提取方法比较

为了选择一种简单、快速、有效的单增李斯特菌基因组DNA的提取方法,采用溶菌酶-蛋白酶K法、氯仿/异戊醇法、液氮冻融法提取单增李斯特菌基因组DNA,利用PCR扩增结果判断所得DNA样品的质量.结果为,3种不同方法均能扩增出234 bp条带,溶菌酶一蛋白酶K法提取的DNA模板检出限最低,为1.25 x 10,CFU/mL.结论为,溶菌酶-蛋白酶K法提取的DNA模板进行PCR扩增检出限最低,该方法提取的基因组DNA适用于PCR扩增和其他分子生物学研究.     

小蠹科昆虫基因组DNA提取方法的比较研究

为探讨小蠹科昆虫基因组DNA的提取方法,分别以单头削尾材小蠹、削尾材小蠹足部肌肉组织以及多年75%酒精浸渍标本为研究对象,采用经典的酚仿抽提法、改良的CTAB法、SDS法及动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒(即磁珠法)4种方法提取小蠹基因组DNA,对提取的基因组DNA进行分光光度值的测定以及COⅠ基因扩增。结果表明:4种方法均可从单头标本中提取总DNA;对于75%酒精浸渍2年的标本,4种方法均适用,大于2年的浸渍标本,仅磁珠法适用,且磁珠法适合微量组织总DNA的提取。      

不同种质荔枝基因组DNA提取研究

针对荔枝体细胞富含多酚、多糖、色素以及蛋白质等次生物质的特点,以荔枝叶片为材料,分别采用CTAB法和SDS法对荔枝野生、半野生和栽培种质的基因组DNA进行提取。结果表明,SDS法提取的荔枝基因组DNA效果稳定,获得DNA的机率为100％,DNA纯度高、质量好,可用于AFLP酶切、连接、预扩增和选择性扩增,并获得清晰、稳定的扩增产物;CTAB法提取的荔枝基因组DNA效果不稳定,DNA浓度较低,易出现多糖等次生物质与DNA共沉淀现象,无法检测出DNA。因此,SDS法可用于不同荔枝种质基因组DNA的提取,进行AFTJP、SSR、ISSR分析。     

不同pH值对DNA提取率的影响

[目的]探索pH值与DNA提取率的关系。[方法]以新鲜猪肝为研究材料,在常规DNA提取方法的基础上设置5个不同的pH值,分析不同pH值对DNA提取率的影响。[结果]OD值与pH值有一定的关系。pH值为7.4时,OD值最大,DNA提取率最高。pH值偏离此值越远,则DNA提取率越低。pH值对DNA提取率有一定的影响。用pH=7.4的缓冲液作提取液时,DNA提取率分别为pH值为7.2、7.6、7.8和8.0时的1.09、1.03、1.06和1.11倍。DNA提取的最适pH值为7.4。[结论]该研究对于提高DNA提取率具有一定的应用价值。     

质粒DNA提取的简便方法

以质粒pBR322为对象,在经典的质粒提取方法的基础上进行了一些改进,将酚氯仿异戊醇抽提和氯仿异戊醇抽提省去。比较了简便方法和经典方法提取质粒的效果,结果显示:两种方法均能够提取出质粒DNA,RNA的量并没有比经典方法提出来的多;简便方法抽取的质粒,蛋白含量稍稍多于后者;简便方法节省了大约一半的提取时间及大量的药品,并且减少了有害的化学物质对人体的危害,是一种经济实用的方法,完全可以满足一般实验需要。     

乳酸乳球菌质粒提取方法的改进与优化

[目的]建立一种简便、快速、安全的乳酸乳球菌质粒提取方法.[方法]质粒提取采用文献报道的乳酸菌质粒提取与常用的大肠杆菌质粒提取相结合的方法,并对提取过程中溶菌酶浓度、溶菌酶处理方式和时间进行优化.[结果]采用改良后的方法提取乳酸菌质粒效果显著.最佳溶菌酶浓度是10 mg/mL,最佳溶菌酶处理方式和时间是37℃振荡培养30 min.[结论]该方法避免了毒性物质溴化乙锭的使用,同时减少了通常提取乳酸菌质粒的复杂步骤,是一种高效、快速、安全的提取乳酸菌质粒的方法.     

适用变性梯度凝胶电泳分析的石油污染土壤微生物DNA模板制备的研究

[目的]为了快速、简便和经济地获得理化性质不同的石油污染土壤中微生物总DNA,以用于后续微生物群落结构分析及动态监测。[方法]采用3种提取方法对石油污染土壤中细菌总DNA进行提取,并通过DNA产量、纯度、片段大小、基因组完整性等对提取得到的DNA质量进行评价;并对16S rDNAV3可变区的PCR扩增产物进行DGGE分析。[结果]采用3种方法均能从石油污染土壤中提取得到相应的细菌DNA片段,且针对同一种提取方法,土壤理化性质的差异对DNA提取效果影响不明显,但不同方法提取得到的DNA在浓度和纯度上存在明显差异。采用3种方法提取得到的DNA量分别可达98.3、79.9和43.8 ng/μl。[结论]选取方法1提取基因组DNA并进一步纯化,纯化后的DNA分别采用引物F27/R1492和F357/R518进行16S rDNA及116S rDNAV3可变区的扩增,获得了条带清晰、浓度高、无污染的DNA目的片段;对其PCR扩增产物进行DGGE分析,得到的DGGE图谱可直观反应石油污染土壤中微生物的多样性及优势种群。     

内蒙古阿尔巴斯绒山羊毛囊结构特征分析

以内蒙古阿尔巴斯绒山羊为材料,通过石蜡包埋技术制作皮肤组织切片,利用Sacpic染色法分析内蒙古阿尔巴斯绒山羊3月、5月和10月的毛囊结构,得到了3个时期较为清晰和具有明显时期特征的形态学图片,为阐明绒山羊绒毛生长发育提供了组织学基础.     

神秘果基因组DNA提取方法比较研究

在CTAB法及SDS法的基础上设计了6种提取方法,比较了不同方法对神秘果幼嫩叶片DNA的提取效果。结果表明:改进的SDS法,通过提高提取缓冲液中重要成分的含量,与二次纯化的方法相结合,提取的DNA无明显降解、杂质少,OD260/OD280值为1.62,接近标准值,是有效提取神秘果基因组DNA的方法。     

甘薯DNA的小量快速提取

以甘薯幼叶为试验材料,用小量快速法提取转基因甘薯总DNA。所提取的DNA以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测和用试ECORI对DNA进行酶切。结果证明,该方法提取的DNA质量较高,可满足RAPD标记、PCR检测和Southernblot杂交等技术分析的需要。为甘薯及其他多糖类植物DNA的提取提供了一个所需材料量少、简便、快速的方法。     

新疆野猪mtDNA控制区序列遗传多样性分析

[目的]为研究猪种起源和遗传分化提供依据。[方法]从6个新疆野猪样本中提取基因组DNA,克隆线粒体DNA控制区序列并进行测序。在测定新疆野猪与其他20个国内外猪种间的遗传距离的基础上,对其进行聚类分析。[结果]通过PCR扩增克隆到大小为1398bp的DNA片段,其A+T含量为59.87%,有明显的碱基偏向性。控制区内存在大量的ACACGTGCGT串联重复序列。在6个新疆野猪样本中检测到3个单倍型。群体平均单倍型多样度(H)为0.600,核苷酸多样度(π)为0.00086。聚类分析结果表明新疆野猪与滇南小耳猪、泰国野猪和藏猪具有较近的遗传关系。[结论]新疆野猪与亚洲野猪和中国地方猪种有较近的遗传关系。     

一种适用于PCR的环境友好型植物DNA提取方法(英文)

改进DNA提取方法,利用含2%CTAB、1%SDS、2%PVP、100mmol/LTris-Cl(pH8.0)、20mmol/LEDTA(pH8.0)和1.4mol/LNaCl的DNA提取缓冲液,提取了不同种属12种植物的DNA,并对其进行了PCR检测.结果显示,所提取的DNA符合PCR试验要求,用真核生物ITS4/ITS5通用引物均能扩增出清晰的条带.该方法无需酚仿抽提,简单、高效、环保,特别适合大规模植物DNA的提取.     

长期直接冻存猪肉样中基因组DNA提取方法的改进与PCR分析

以新鲜猪耳组织作为对照 ,比较了用经典方法从新鲜猪耳组织和长期直接冻存猪肉样中提取的DNA ,提出了从长期直接冻存肉样中提取高质量DNA的改进方法。结果表明 ,采用改进方法可得到大量的、较完整的基因组DNA ,即对于基因组DNA降解较严重的样品是行之有效的方法。对提取到的DNA进行扩增 ,并分析了影响PCR反应的因素。