水貂肠炎细小病毒结构蛋白VP2基因的克隆和序列分析

对水貂肠炎细小病毒SMPV-11株结构蛋白VP2基因进行扩增,获得了基因序列全长为1755bp的SMPV-11株VP2基因,其编码584个氨基酸;应用DNAStar分析软件对该序列进行同源性分析发现,SMPV-11株VP2基因与其他6株水貂肠炎细小病毒株核苷酸和氨基酸均有较高的同源性,分别为99.2%～99.4%和98.6%～99.1%,与猫泛白细胞减少症病毒标准株CU-4株同源性为99.3%和99.1%,系统发生树分析表明它们属于同一个分支。本研究为水貂肠炎细小病毒分子流行病学调查和新型疫苗的研究奠定基础。     

水貂肠炎病毒NS1基因进化分析

采用PCR方法,从辽宁省、吉林省、山东省、河北省采集的32份样品中检测出21份水貂肠炎病毒感染阳性样品。每个地区选取有代表性的样品共计11份进行NS1基因的克隆和测序,并与已知参考毒株进行比对及系统发育分析。结果显示,本次检测的11个阳性样品的核苷酸序列和氨基酸序列同源性为98.8%~100.0%和98.5%~100%;本次测序序列和国内毒株MEVB基因的核苷酸和氨基酸序列同源性为98.7%~99.9%和98.7%~99.9%;与国外毒株MEVAbashiri基因的核苷酸和氨基酸序列同源性为99.0%~99.5%和98.7%~99.1%。11份阳性样品中水貂肠炎病毒的NS1基因有24个氨基酸位点存在变异。11份阳性样品可划分为3个分支。     

猪细小病毒YL株序列分析及其 VP2基因原核表达

为对猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)进行分子生物学研究,将该病毒YL株基因组分为4个重叠片段进行PCR扩增,并将扩增产物克隆到pGEM-T载体中,测定病毒基因组全长序列。另外,应用其中1对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原区域的片段,构建重组质粒pET-VP2,IPTG诱导表达。序列分析结果表明,PPV YL株和国内外PPV分离毒株NS1基因核苷酸同源性为97.8%～99.4%,氨基酸同源性为96.7%～99.5%,与国内外主要毒株VP2基因核苷酸同源性为98.7%～99.7%,氨基酸同源性为97.4%～99.8%。进化树分析表明,PPV YL株与BQ株(EU790641)毒株处在同一分支上,遗传距离最近。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量为56ku,经Western blotting检测具有生物学活性。     

水貂株犬瘟热病毒融合蛋白基因的克隆与序列分析

以犬瘟热病毒水貂分离株RNA为模板,经RT-PCR反应,扩增出融合蛋白基因的1053bp DNA片段,通过T-A克隆技术,成功构建克隆载体PMD-18T/F。序列分析表明:分离株与01-2689株、2544-Han95株、A75-17株、DOGDK91C株、00-2601株、ONP株、PDV-2株核苷酸序列同源性分别为94.3%、93.5%、94.4%、93.6%9、5.3%、97.3%和94.5%;氨基酸序列同源性分别为97.2%、96.6%、97.4%、97.4%、97.4%、97.2%和98.0%。抗原指数分析表明分离株与疫苗ONP株、强毒A75-17株在40-50位氨基酸间存在明显差异。     

猪细小病毒NS1基因和VP2基因的克隆与序列分析

根据GeneBank 上发表的猪细小病毒(PPV)的基因组序列,分别设计扩增非结构蛋白NS1基因和结构蛋白VP2基因的特异性引物,采用PCR方法扩增PPV泰安株(PPV-TA)NS1基因和VP2基因.结果表明,PPV-TA NS1基因长1989 bp,编码662个氨基酸,与参考PPV NS1基因核苷酸同源性在98.3 %～99.9 %之间.PPV-TA NS1蛋白有3个糖基化位点分别是356NIS、446NFS、513NLT,除PPV Tomau/1/02在356位缺失了一个糖基化位点之外,PPV-TA与其他PPV参考毒株一致;这表明不同毒株NS1蛋白调节功能可能有差异.PPV-TA NS1蛋白的潜在磷酸化位点是Thr435和Ser473,与PPV参考毒株相同.NS1基因系统发生分析表明,PPV-TA与PPV china亲缘关系最近.PPV-TA VP2基因长1740 bp,编码579个氨基酸,与PPV参考毒株VP2基因核苷酸同源性在98.3 %～99.8 %之间.PPV-TA VP2蛋白的378D、383H、436S氨基酸残基决定了PPV的组织嗜性,与PPV-NADL-2和PPV-china相同,这表明这3个毒株的组织嗜性是一致的.但与其他PPV参考毒株有差异,这表明不同毒株在动物体内的组织分布是有差别的.PPV-TA VP2蛋白有9个线性抗原位点,与PPV NADL-2和PPV china的线性抗原位点是一致的,这表明具有相同的抗原特性.VP2基因系统发生分析表明,PPV-TA与PPV NADL-2亲缘关系较近.     

犬瘟热病毒水貂分离株H基因的遗传多样性分析

以犬瘟热病毒水貂分离株的RNA为模板,对分离株的H基因进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后与pMD-18T Sim-pie Vector连接,成功地构建了克隆质粒pMD-18T-CDVH.序列分析表明,分离株H基因由1 596 bp组成,编码532个氨基酸,含有5个潜在的N-联糖基化位点,12个半胱氨酸残基.与已发表的24株CDV毒株进行同源性比较,核苷酸序列同源性在90.7%～98.6%之间:推导的氨基酸序列同源性在89.9%～97.O%之间.与Onderstepoort、Convac、Hamatsu,A75/17、TN株相比,根据推导的氨基酸序列比较分析表明,N-联糖基化位点的数目与位置均存在差别.聚类分析结果表明分离株与Snyder Hill毒株的亲缘关系最近,二者与疫苗株Onderstepoort和Convac具有较高的同源性,组成一组,而与标准野毒强毒株Hamatsu的亲缘关系较远. 个半胱氨酸残基.与已发表的24株CDV毒株进行同源性比较,核苷酸序列同源性在90.7%～98.6%之间:推导的氨基酸序列同源性在89.9%～97.0%之间.与Onderstepoort、Convac、Hamatsu,A 5/17、TN株相比,根据推导的氨基酸序列比较分析表明,N-联糖基化位点的数目与位置均存在差别.聚类分析结果表明分离株与Snyder Hill毒株的亲缘关系最近,二者与疫苗株Onderstepoort和Convac具有较高的     

犬细小病毒分离株VP2基因的克隆与序列分析

以犬细小病毒 (Canine parvovirus,CPV)扬州分离株病毒的 DNA为模板 ,根据基因库 CPV-d序列设计合成了VP2基因的 1对特异引物 ,进行聚合酶链式反应 ,扩增出约 1 .7kb的片段 ,按常规方法克隆进 p UC1 8载体 ,经 Eco R 和Sal 双酶切筛选到阳性质粒 ,进一步对该片段进行序列分析。结果表明 :所扩增基因片段长度为 1 740 bp,与美国参考株 CPV-d (type 2 )、CPV-1 5 (type 2 a)、CPV-3 9(type 2 b)相比较 ,核苷酸同源性分别高达 99.5 %、99.7%、99.7%。     

猪细小病毒Vaccine株VP2基因克隆与抗原性分析

[目的]为研制和筛选猪细小病毒核酸疫苗提供依据。[方法]对猪细小病毒Vaccine株VP2进行克隆、测序以及抗原性分析。[结果]参考GenBank公布的NADL-2株序列,设计出1对引物,并利用该引物扩增了猪细小病毒vaccine株VP2主要抗原基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体上,测序获得656 bp核苷酸序列,并推导出其氨基酸序列,共编码218氨基酸,与NADL-2株相应的序列进行比较分析,比NADL-2毒株缺失781 bp,两者核苷酸同源性为98.9%,氨基酸同源性为97.2%;应用DNAStar软件对氨基酸的抗原表位进行了预测,共有7个抗原表位,分别在氨基酸N端的第10~183、4~39、94~103、121~126、137~144、156~165和209~214区段,此序列具有较好的免疫原性。[结论]该研究为发展特异性和敏感性诊断系统和研制疫苗提供了有力的技术依据,为研究蛋白质特性分析提供了理论依据。     

猪瘟病毒石门株NS4B基因的序列测定及分析

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,利用２对引物,从猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）强毒石门株感染的猪血中成功扩增了ＮＳ４Ｂ基因,片段大小分别为７５７ｂｐ和７７４ｂｐ。克隆后经酶切鉴定,自动测序和序列分析,结果显示该基因较为保守,与其他猪瘟病毒毒株均有很高的同源性,与同属的ＢＶＤＶＳＤ－１株和ＮＡＤＬ株也有较高的同源性。     

猪瘟病毒石站株NS4B基因的序列测定及分析

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，利用２对此物，从猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）强毒石门株感染的猪血中成功扩增了ＮＳ４Ｂ基因，片段大小分别为７５７ｂｐ和７７４ｂｐ。克隆后经酶切鉴定，自动测序和序列分析，结果显示该基因较保守，与其他猪瘟病毒毒株均有很同的同源性，与同 ＢＶＤＶＳＤ－１株和ＮＡＤＬ株也有较高的同源性。     

口蹄疫病毒R株基因组序列分析研究

根据GenBank上发表的口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）全基因序列数据，设计了多对引物，采用RT-PCR的方法，分别对R株编码区和非编码区基因进行扩增，将各片段克隆至pMD18-T载体，进行核苷酸序列测定．按顺序拼接各基因的序列，将结果序列与GenBank上各FMDV毒株的序列进行比较和同源性分析．序列的比较和分析表明，R株编码区全长为6966个核苷酸，共编码2322个氨基酸；非编码区5’端内部核糖体结合位点（intemal ribosome entry site，IRES）长约450个核苷酸，3’非翻译区（untranslatable region，UTR）从TAA始至Poly（A）前长度为94个核苷酸，所测出Poly（A）尾长度为18个核苷酸．与GenBank世界流行毒株的序列比较，编码区核苷酸序列同源性为88％～90％，推导氨基酸序列同源性为88％～95％．     

虎源猫泛白细胞减少症病毒VP1、VP2和NS1基因的克隆与序列分析

根据Genbank上发表的猫泛白细胞减少症基因序列数据,设计了3对引物,并采用PCR方法对从东北虎粪便中分离出的FPV-HLJ的结构蛋白VP1、VP2和非结构蛋白NS1基因进行了扩增,将各片段克隆至pMD18-T载体,经PCR鉴定后进行了序列测定和分析.结果显示:FPV-HLJ与GenBank上公布的FPV、CPV和MEV毒株相比,核苷酸序列同源率VP1为98.8%～99.8%,VP2 为98.1%～99.4%,NS1为98.6%～99.7%.VP1氨基酸同源率为97.6%～99.2%,VP2、NS1氨基酸同源率与其核苷酸同源率相同.并且VP1、VP2和NS1上分别有 4、3和9处氨基酸发生变异.     

5株猪O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取5株猪O型口蹄疫病菌（FMDV）（L1-L5）的RNA，用1对通用引物经RT-PCR法扩增了5株病毒VP1基因的DNA片段，克隆后通过测序获得其核苷酸序列，分析表明，除L2株外，其余4株（L1，L3，L4和L5）VP1基因的核苷酸序列同源性在96.7%-99.8%。氨基酸序列同源性在99.5%-100%；而L2株与L1，L3，L4和L5株VP1基因的核苷酸序列同源性在82.0%-83.4%，氨基酸序列同源性在89.7%-90.1%,L1,L3,L4和L5株病毒VP1基因的核苷酸序列与已经发表的GD/CHA/86，HKN/1/99，HKN/16/96的同源性较高，核苷酸序列同源性在85.0%-99.8%，属于同一基因型；而与L2，F29/CHINA及国外大多数毒株相比，属于不同的基因型，其核苷酸序列同源性仅为41.0%-82.6%，5株毒株中的L1，L3，L4和L5的主要中和抗原位点140-160，200-213位氨基酸序列完全相同，推测其有相近的中和单抗表位和相同的抗原性。     

猪细小病毒HN-2011株VP2基因的克隆及序列分析

根据GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)VP2基因序列设计引物,扩增HN-2011河南分离株的VP2基因片段,并将其克隆到pMD-18T载体中.序列分析结果表明,HN-2011分离株VP2基因长度为1 740 bp,编码580个氨基酸.利用MAGE 5.0软件绘制PPV系统发育进化树,结果显示,PPV毒株可以划分为4组,我国的PPV毒株主要集中在A和B两组,仅JY毒株位于C组;PPV VP2蛋白3维结构显示,氨基酸变异的多态性位点主要集中在病毒衣壳蛋白的表面.以上遗传进化关系表明,PPV HN-2011株是我国PPV的流行毒株.     

猪圆环病毒2型北京株全基因组的克隆与序列分析

为探索近年来北京地区猪圆环病毒2型（PCV2）的流行病学和变异规律,用PCR技术从北京不同猪场的临床发病猪和死亡猪病变组织中分别扩增和克隆获得4株PCV2分离株全基因组序列,并进行测定和分析。结果显示,4株PCV2基因组全长均为1767nt,其核苷酸同源性高达99％,与其他北京分离株的同源性也达98％以上,与国内外其他地区PCV2的核苷酸同源性也在95％以上。由此表明,各个PCV2分离株在进化方面存在地域相关性。     

猪传染性胃肠炎病毒SC-H株M基因的克隆与序列分析

参照Genbank已发表的TGEV的核酸序列设计一对扩增M基因的引物,经RT-PCR扩增了SC-H株的M基因cDNA片段,插入pMD18-T构建重组质粒pMD-M,对pMD-M进行了酶切鉴定及核苷酸测序,将M基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列与参考毒株进行了比较分析。结果表明SC-H株M基因扩增片段长度为852bp,包含789bp的M基因编码区,编码262个氨基酸;SC-H株与TS、96-1933、FS772/70、HN2002、TFI、Purdue及TO14株的M基因核苷酸序列同源性为97.8%、94.2%、97.2%、97.8%、99.7%、96.8%及98.2%,氨基酸同源性为96.6%、92.0%、95.4%、96.6%、99.2%、95.8%及97.7%,表明不同毒株的M基因高度保守,系统进化分析显示SC-H株与Prudue株有较近的亲缘关系。     

猪圆环病毒1型北京株全基因组克隆及序列分析

参照GenBank上猪圆环病毒1型（PCV1）全基因组序列设计1对引物,用PCR技术从北京一猪场的临床发病猪病变组织中扩增和克隆获得1株PCV1全基因组序列,并进行序列测定和分析。全基因组序列结果显示,该株PCV1基因组全长为1759bp,与国内外其他各株PCV1的核苷酸同源性为99．4％。主要开放阅读框（ORF）序列结果显示,该分离株与国内外其他PCV1毒株间的ORF1与ORF2的核苷酸同源性分别在97．5％～99．8％和92．7％～100％。虽然各个PCV1分离株之间的全基因组与主要ORF的核苷酸同源性均很高,但仍然呈现出一定的地域相关性。     

建兰花叶病毒广东分离物的全基因组序列分析

【目的】建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)是最主要的兰花病毒病原之一,其广泛传播对兰花产业发展造成严重威胁。探究CymMV遗传信息和进化,为广东省兰花病毒病的监测预警和兰花抗病毒病基因工程提供重要科学依据。【方法】对采自广州地区的墨兰疑似病毒病叶片进行CymMV的RT-PCR及DA-SELISA检测鉴定,利用相关分子生物学软件对CymMV分离物进行基因组序列组装、注释、系统进化及选择压力分析。【结果】首次在广东省发现2个CymMV分离物GZV013和ZC-29,基因组全长均为6227 nt,编码5个功能蛋白;GZV013与台湾分离物M2的核苷酸序列一致性为97.03%;ZC29与南京分离物NJ-1的核苷酸序列一致性为97.11%;CymMV各分离物的全基因组序列一致性为86.85%～98.31%,且多样性种群的分化与寄主种类和地理隔离关系密切;CymMV基因组每个区域均受到负选择的影响,并符合中性进化模型;编码RdRp、TGB1和TGB2的基因在基因组中变异率最高。【结论】GZV013与台湾分离物M2的亲缘关系最近,ZC29与南京分离物NJ-1的亲...