玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆及TaqMan 探针实时荧光PCR

为给农业和植物检疫部门提供一种特异性强、灵敏度高，可以快速、直接检测植物病原菌的方法，将玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆测序，根据该细菌与其他细菌菌株16S rDNA序列差异，设计出对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定点突变的特异性探针，除泛菌属3个种和欧氏菌属3个种外，还对假单胞菌属1个种，黄单胞菌属1个种，棒形杆菌属1个种，短小杆菌属1个种以及5种植原体进行了实时荧光PCR检测．结果表明：只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光，其他细菌和植原体都没有荧光产生．检测的灵敏度为10^4CFU／mL的菌悬浮液，相当于4个细菌细胞的基因，灵敏度高，也就是说，反应体系中只要有2个活细菌，实时荧光PCR就能检测到．相对灵敏度为10^7CFU／mL，而且整个检测过程只需2h，由于实验采用独特全封闭反应管及光电传导系统，不用凝胶电泳，降低了污染．     

利用巢式PCR检测玉米细菌性枯萎病菌

利用通用引物扩增了玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的转录间隔区并进行了序列测定.通过序列比较,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌的专化性引物,并对所有参试菌株进行扩增.结果显示:该对引物能从参试的玉米细菌性枯萎病菌中特异性地扩增出1条299 bp的条带,而其他参试菌株没有扩增信号.与扩增细菌ITS区域的通用引物结合使用,建立了检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌的巢式PCR技术,其检测灵敏度可达到4个细菌细胞,可以准确、灵敏地检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌.     

一步双重PCR检测香蕉枯萎病菌

摘要：通过设计尖孢镰刀菌ITS区特异引物PR1/PR2和SCAR特异引物ST1/ST2,优化检测体系中反应参数,建立了双重PCR检测香蕉枯萎病菌1号生理小种和4号生理小种的方法。结果表明：引物PR1/PR2和ST1/ST2能明确鉴别香蕉枯萎病菌1号生理小种和4号生理小种,检测体系的最佳退火温度为56 ℃,检测灵敏度的最低起始DNA为20 ng。     

利用巢式PCR检测玉米细菌性枯萎病菌

利用通用引物扩增了玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的转录间隔区并进行了序列测定。通过序列比较,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌的专化性引物,并对所有参试菌株进行扩增。结果显示：该对引物能从参试的玉米细菌性枯萎病菌中特异性地扩增出1条299bp的条带,而其他参试菌株没有扩增信号。与扩增细菌ITS区域的通用引物结合使用,建立了检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌的巢式PCR技术,其检测灵敏度可达到4个细菌细胞,可以准确、灵敏地检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌。     

西瓜细菌性果斑病菌Taq Man探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

根据西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp．citrulli）与相关细菌16SrDNA序列差异，设计出对西瓜细菌性果斑病菌具有稳定点突变特异性探针Aac—probe，利用该探针对23种供试菌株进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明，只有西瓜细菌性果斑病菌能检测到荧光增强信号，其它细菌无荧光增强信号。该方法特异性强，灵敏度高，重复性好，可有效地应用于西瓜细菌性果斑病菌的检测。     

香蕉细菌性枯萎病菌超分支滚环扩增快速检测技术

根据香蕉细菌性枯萎病菌(Ralstonia solanacearum race 2)的特异插入序列ISRso19设计滚环扩增的锁式探针,并对超分支滚环扩增的反应条件进行优化,建立了香蕉细菌性枯萎病菌超分支滚环扩增技术。结果表明,该检测技术能够从供试的9种病原菌中特异性地检测出香蕉细菌性枯萎病菌,检测的DNA最低浓度为500 fg·μL-1,高于常规PCR的灵敏度。     

香蕉细菌性枯萎病菌荧光 LAMP 检测体系的建立

【目的】基于香蕉细菌性枯萎病病原(Ralstonia solanacearum)2号生理小种的特异保守引物和LAMP技术建立一种实时荧光定性检测方法,解决常规PCR定性检测特异性低、灵敏度低、耗时长等问题,实现在1 h内能进行准确高效的定性检测,为加强该病害防控检测和检疫工作提供技术支持。【方法】确定被测基因靶序列,利用Primer软件设计两对内外引物。由两对引物、具有链置换特性的DNA聚合酶、模板DNA、甜菜碱、Mg_2SO_4、反应缓冲液、荧光染料等组成LAMP反应体系,采用不必在反应完开管盖检测的实时荧光LAMP方法,针对该方法对于样品DNA定性检测的灵敏度、特异性及可重复性进行试验。【结果】设计的引物能顺利扩增目标基因,实时荧光LAMP检测体系对于香蕉细菌性枯萎病病原生理2号小种有良好的灵敏度、特异性,该方法可重复性强,灵敏度比普通PCR高10倍以上。【结论】香蕉细菌性枯萎病菌荧光LAMP检测体系检测特异性强、灵敏度高、耗时短、不易污染,效果较好。     

水稻细菌性条斑病菌的实时荧光PCR检测技术研究

 水稻细菌性条斑病是我国水稻上的检疫性病害之一。设计并筛选出特异性引物对Xoc2071F/Xoc2071R(Xoc2071),其扩增片段大小为329bp,利用SYBR GreenI荧光定量PCR方法进行水稻细菌性条斑菌的实时荧光PCR检测。结果表明,引物对Xoc2071能特异性检测到目标病原菌产生荧光信号而其他菌种不产生荧光信号。检测的灵敏度是2.25fg/μL质粒DNA和1.0×102cfu/mL的菌悬液,相当于1个细菌的基因,比常规PCR电泳检测的灵敏度高约100倍。此实时荧光PCR可以检测到仅需10g的带菌种子上目标菌的存在。     

二氧化氯对香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌的消毒效果研究

研究不同浓度二氧化氯(ClO2)对土壤和水体中香蕉枯萎病菌小型分生孢子和水体中香蕉细菌性软腐病菌的杀灭效果,为控制香蕉枯萎病和软腐病的传播提供依据.通过统计分析消毒前后镰刀菌孢子和细菌的数量发现:3 mg/L以上ClO2可将待测镰刀菌孢子100％杀灭;20mg/L的ClO2淹土不能100％杀死土样中的镰刀菌孢子;800 mg/L以上ClO2浇灌粉蕉根系周边的土壤可有效减少镰刀菌数量,高于1 500mg/L ClO2消毒液可将土壤中镰刀菌100％杀灭.二氧化氯消毒显著降低土壤中细菌的数量,显著增加土壤真菌的数量,并明显减少土壤细菌和真菌的种类.5 mg/L的ClO2可将水体中香蕉细菌性软腐病菌100％杀灭.研究结果表明,高于5 mg/L的ClO2进行水体消毒可有效预防枯萎病和软腐病通过水源传播,对发病蕉穴土壤的消毒可以使用1 500 mg/L以上的C]O2处理以达到清除病原的目的.     

水稻稻瘟病菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立

依据GenBank中登录的稻瘟病菌28S rDNA保守区域设计合成了对稻瘟病菌特异的TaqMan探针,并对实时荧光PCR各反应条件进行摸索优化,得出水稻稻瘟病菌实时荧光PCR的最佳反应体系.利用该体系对其他侵染水稻常见的病原菌进行特异性检测,结果表明只有稻瘟病菌能检测到荧光信号的增加,检测的灵敏度为0.328pg/μL DNA样品.说明该方法是一种较常规PCR快速、特异性强的方法,并且可有效的用于稻瘟病菌的检测.     

新疆棉花根际细菌TaqMan探针实时荧光定量 PCR的建立及时空动态分析

【目的】 建立快速检测棉花根际细菌的TaqMan探针实时荧光定量PCR,对新疆棉花不同生育时期根际细菌数量进行检测以及时空动态分析。【方法】 根据棉花根际细菌16S rDNA基因序列,设计、合成特异性引物和TagMan探针,以构建的重组质粒作为阳性标准品,建立标准曲线,并对实际样品进行检测。【结果】 新疆棉花不同生育时期根际细菌数量变化不尽相同:库尔勒、阿拉尔和哈密的棉花根际细菌数量变化趋势在苗期至花期之间相同,而花期至絮期之间变化各不相同;石河子、乌苏和图木舒克的棉花在整个生育时期内根际细菌数量变化趋势基本相同;精河的棉花根际细菌从苗期开始缓慢增加,蕾期至花期之间变化不大,花期之后快速增加。新疆不同采样地点棉花根际细菌数量变化也不尽相同:根际细菌数量变化趋势是东疆、南疆、北疆依次减少。其中,棉花根际细菌数量最多的是东疆地区的哈密,吐絮期达到1.7×10⁷ copies/g(FRW),最少的是北疆地区的精河,苗期仅为8.5×10⁴ copies/g(FRW)。【结论】 建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法可以快速检测棉花根际细菌的数量,新疆棉花根际细菌数量在时间和空间上变化不尽相同,其中,根际细菌数量最多的是哈密的吐絮期,最少的是精河的苗期。     

用实时荧光PCR方法定量检测Bt176转基因玉米

以实时荧光PCR技术鉴定商业化种植的转基因玉米Bt176品系。根据转基因玉米Bt176中内源基因Zein和外源基因cry1Ab设计引物及TaqMan荧光探针,成功建立了检测转基因玉米Bt176品系的实时荧光PCR方法。结果表明,应用实时荧光PCR方法检测转基因作物,不仅可以达到品系鉴定的作用,而且可以用于转基因成分的检测。该方法简便迅速,降低了污染机会,为转基因作物及产品的品系检测提供了新方法。     

检测猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR方法的建立

针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2的序列设计两对特异性引物及TaqMan探针,以感PCV2的PK-15细胞培养上清的DNA提取物为模板,分别扩增499 bp和131 bp的片段,建立了检测PCV2的TaqMan荧光PCR方法。结果表明:TaqMan荧光PCR检测PCV2的最佳探针浓度为0.5 pmol·μL-1;TaqMan荧光PCR两步法操作快捷,扩增131 bp的引物PCF1101/PCR1232检测敏感性高(3.17×102拷贝·μL-1),重复性好。在诸多检测样品中,除检测到PCV2检测指标出现阳性外,猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV),日本乙型脑炎病毒(JEV),猪伪狂犬病毒(PRV),猪瘟病毒(CSFV)及PK-15细胞等检测指标均为阴性,表明特异性强;与普通PCR的检测结果(2/10)比较,本法的敏感性和对临床样品的阳性检出率(3/10)更高。上述研究表明,本方法快速、敏感、特异,具有很高的重复性,且可实时监测,能有效检测PCV2。     

辣椒青枯病菌的分离及其PCR检测

从辣椒上分离的青枯病菌用TTC、523平板划线培养可得到典型的单菌落(中央粉红色或红色,具流动性),共分离到20个纯培养物。实验不需要提取青枯病菌的DNA,可直接利用细菌粗悬液进行PCR扩增反应,并克隆到281 bp的分子片段。实验结果为鉴定辣椒青枯病菌株提供了一种快速特异的检测手段。     

中草药青蒿(Artemisia annua L.)的实时荧光PCR检测

中草药青蒿,学名黄花蒿(Artem isia annuaL.),属于中国独有的抗疟药用植物资源之一。根据蒿属植物rDNA ITS序列多态性设计TaqM an探针及引物,通过实时荧光PCR方法对黄花蒿进行检测。结果表明:该组探针-引物对黄花蒿有很强的特异性,除黄花蒿外,其余8种对照蒿属材料均未检测到荧光信号。该方法快速、简便、安全、准确,适用于黄花蒿的出入境检验。     

TaqMan实时荧光PCR快速检测斑点叉尾鮰病毒

根据GenBank登录的斑点叉尾鮰病毒株ORF8基因序列,设计引物和Taqman荧光探针,建立了用于检测斑点叉尾鮰(Ictalurus Punctatus)病毒的实时荧光定量PCR方法;对实时荧光定量PCR反应条件进行了优化,评估了该方法的特异性、灵敏度和重复性,并建立了绝对定量方法。特异性试验证实,该方法只能检测到斑点叉尾鮰病毒,与真鲷虹彩病毒、蛙虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒等多种常见的水生动物病毒没有交叉反应,具有高度的特异性。标准曲线表明,在3.3×10~3.3×107拷贝数之间有较好的线性关系(r=0.998 3),最少可检测到33个拷贝的阳性质粒,敏感度很高。同一样品于试验内及试验间的重复性试验发现,变异系数分别为0.7%和1.2%,重复性较好。该方法的检测时间从核酸抽提到出具结果仅需3h。试验结果表明,采用实时荧光PCR检测斑点叉尾鮰病毒方法具有特异性好、灵敏度高、检测耗时短的特点,并且能对病毒进行准确的定量分析,不仅适合口岸进出口检验检疫的需求,而且可以作为研究该病毒感染过程的有力工具。     

虹彩病毒蛙病毒属病毒实时荧光PCR检测方法的建立

在GenBank 中搜寻虹彩病毒蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)基因序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列,设计引物和Taqman探针,建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR检测方法.对荧光PCR反应条件进行优化,评估该检测方法的特异性、稳定性和重复性,利用10倍系列稀释法检验其灵敏度并与常规PCR做了比较.结果显示,该方法对虹彩病毒蛙病毒属成员(新加坡石斑鱼虹彩病毒除外)的检测有高度的特异性,与淋巴囊肿病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒等其他水生动物病毒之间均无交叉反应,有良好的特异性,检测总DNA灵敏度为4.5×10-3pg/μL,比传统PCR的敏感度高出100倍,可对低病毒含量的样品进行准确检测.制作的标准曲线有极好的线性关系,且线性范围宽,相关系数为0.998 4.组内和组间重复试验的Ct值标准偏差分别为1.2%和1.6%,有良好的重复性.与常规的PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品等优点,可用于出入境检疫和动物防疫监督部门对虹彩病毒蛙病毒属的疫情监测.     

山羊痘病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中山羊痘病毒(AY077835)gp063基因DNA序列,应用Beacon Designer 7.0软件,设计合成1对引物和1条TaqMan探针,同时制备含有靶DNA序列的pEASY-T1重组质粒标准品。通过引物、探针浓度的筛选及反应条件的优化,建立了山羊痘病毒TaqMan法实时荧光定量PCR。该方法组内和组间重复试验变异系数均低于2%,最低浓度检测极限值为1×100copies/μL,上机检测时间少于40 min。运用该方法对不同时期流行于云南局部的山羊痘临床组织病料进行定量检测,生成的标准曲线斜率(Slope)为-3.36,截距(Intercept)为41.08,相关系数(R2)为0.999 989,阳性对照及送检样品抽提DNA中病毒含量依次为:P(TK)2.70×105copies/μL,华坪(HP)毒株1.45×106copies/μL,景谷(JG)毒株5.12×105copies/μL,保山(BS)毒株2.96×105copies/μL,宣威(XW)毒株1.86×105copies/μL,永胜(YS)毒株1.36×103copies/μL。结果表明:所建立方法具有灵敏、特异、安全、快速的特点,适合于山羊痘的早期检测。     

利用实时荧光P CR技术快速检测玉米籽粒中转基因成分

[目的]利用Taq Man特异性荧光标记法快速检测玉米籽粒中转基因成分。[方法]外源基因选取具有一定代表性的Ca MV35S启动子、NOS终止子、BAR、Cry IA(b)基因,数据结果由实时荧光定量PCR反应的Ct值判定。[结果]用该方法检测玉米籽粒中未含有转基因成分,可作为结果判定。[结论]该方法在样品量大时极具优势,高效,准确,对环境污染较小。     

猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中5′端非编码区的靶序列设计了用于TaqMan荧光定量PCR的1对引物及TaqMan探针,以猪瘟活疫苗病毒为模板,在常规PCR的基础上优化了TaqMan荧光定量PCR反应条件,建立了猪瘟病毒（CSFV）TaqMan荧光定量PCR检测方法。其敏感性和特异性试验结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法对CSFV具有很高的特异性,其检测灵敏度可达5.03×10-2μg/μL。说明TaqMan荧光定量PCR适用于CSFV的快速检测。