牛病毒性腹泻病毒E0基因原核表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法,利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)C24V株接种MDBK细胞,提取病毒RNA,扩增出BVDV-E0基因,将所得片段与pET-28a表达载体连接,转化至BL-21大肠杆菌中,筛选阳性克隆,鉴定后证明pET-28a-E0原核表达载体构建成功。经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定,鉴定结果表明,目的蛋白在大肠杆菌中得以表达。     

牛病毒性腹泻黏膜病毒E2基因的原核表达与免疫原性分析

[目的]原核表达牛病毒性腹泻黏膜病毒(BVDV)E2基因编码蛋白。[方法]采用PCR方法从BVDV中扩增E2基因片段,与原核表达载体pET-32a连接,构建重组表达质粒pET-32a-E2,转化E.coli(Rosetta)感受态细胞,重组菌用1 mmol/L IPTG诱导表达E2蛋白,进行SDS-PAGE电泳,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,经Western blot分析鉴定免疫原性。[结果]重组质粒pET-32aE2经PCR及酶切鉴定证明构建正确,重组质粒能够在大肠杆菌中大量表达,表达产物的分子质量大小约为58 kDa,纯化后E2重组蛋白浓度0.521 mg/mL,Western blot分析表明,其能被BVDV阳性血清识别,具有很好的免疫原性。[结论]E2蛋白成功表达,为后续建立BVDV检测方法奠定了基础。     

鹿源牛病毒性腹泻—黏膜病病毒E_2基因的克隆与序列分析

对已发表的牛病毒性腹泻-黏膜病毒E2基因的核苷酸序列进行比较分析并设计引物,应用套武RT-PCR获得鹿源BVDV E2基因.测序分析结果表明:鹿源BVDV E2基因由1 122个核苷酸组成,编码374个氨基酸.与Oregon CV24、NADL、ZM-95、SD1、Osloss、S10、SH9、Changchun184、Shitara、Deer-GB1核苷酸和推导氨基酸同源性分析表明:鹿源DVBV分离株与Changchun 184株及Osloss株的同源性较高,分别为99.2%和92.8%;与日本Shitara株的同源性为71.2%;与国际标准毒株CV24的同源性为74.6%.     

牛病毒性腹泻病毒Core蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的Core蛋白及其多克隆抗体,根据Core蛋白的编码基因序列,设计合成一对特异性引物,利用RT-PCR扩增BVDV Core基因并定向插入Pet30a载体中,构建重组质粒Pet30a-Core,经酶切鉴定后转化大肠埃希菌TOP 10感受态细胞,筛选获得阳性重组菌,以IPTG进行诱导后成功表达出分子质量为20 ku的重组Core蛋白。将诱导表达的蛋白产物经融合蛋白的Ni柱亲和法进行纯化,利用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并利用间接ELISA法测出多克隆抗体效价达到1∶512 000。蛋白质印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验(IFA)证实,多克隆抗体可与细胞中的BVDV抗原发生反应,具有良好的免疫原性和特异性。本实验成功制备了BVDV重组Core蛋白的兔源多克隆抗体,为BVDV的检测及其Core蛋白功能研究奠定了基础。     

猪瘟病毒E2基因的克隆表达

PCR扩增猪瘟病毒(CSFV)定点突变后的E2基因,克隆至原核表达载体质粒pET-28a中,重组质粒pET28a-E2转化BL21(DE3),IPTG诱导,高效表达了E2基因,表达量达菌体总蛋白的25.3%。免疫印迹表明,所表达的蛋白是CSFV特异性的。     

抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的研制

将含有牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)囊膜糖蛋白E2编码基因的真核表达质粒pEC143免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组E2蛋白纯化产物为检测抗原,经间接ELISA法筛选和3次有限稀释法克隆,得到1株能稳定分泌抗BVDV1和BVDV2单克隆抗体的杂交瘤细胞株.该3D8株单抗能识别BVDV1标准毒株(NADL、OregonC24V)、BVDV2标准毒株(890、104)、2株BVDV1分离株和3株BVDV2分离株,而不能识别牛轮状病毒、牛疱疹病毒1型,显示出良好的特异性.阳性杂交瘤细胞的上清液、腹水ELISA抗体效价分别为2~9和10×2~7,为IgM亚类.其单克隆抗体杂交瘤细胞株的获得,为建立单抗介导的检测BVDV1和BVDV2抗原和抗体的血清学方法和实现标准化诊断奠定基础.     

牛粘膜病病毒E1基因的克隆及原核表达

参考BVDVVEDEVAC株的基因组序列及E2基因的测序结果设计一对引物,扩增出预期585 bp的目的片段。扩增产物克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列VEDE-VAC株比较,二者的核苷酸同源性为100%,推导氨基酸同源性为100%。测序结果经同源性比较,克隆得到的基因与VEDEVAC株同源性最高。系统发生树分析推测E1基因与VEDEVAC株在进化上比较接近。将E1基因定向亚克隆到表达载体pGEX-6p-1中,对阳性重组质粒转化的大肠杆菌BL21进行诱导,E1基因获得了成功表达。     

猪瘟病毒E2基因的克隆及其初步鉴定

[目的]为了研究猪瘟病毒E2蛋白的抗原性质和进一步筛选保护性抗原表位。[方法]克隆猪瘟病毒E2蛋白的部分基因片段,通过自行设计的一对引物,应用RT-PCR从猪瘟兔化弱毒株细胞培养物,扩增出一DNA片段,并对其进行鉴定。[结果]经初步鉴定,该片段大小约703 bp,核苷酸序列测定结果表明该片段为E2蛋白基因。[结论]该研究为筛选CSFV抗原奠定了基础。     

牛病毒腹泻病毒(BVDV)E2重组蛋白ELISA检测方法的初步建立

[目的]为牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测提供敏感、特异检测方法.[方法]重组质粒pET-(1-345)转化宿主菌BL21(DE),以IPTG进行诱导表达,使外源基因获得了较高水平的表达; Westem一blot检测表达产物反应原性,同时进行特异性检测;将收集的纯培养物进行超声波裂解后以His bind kit蛋白质纯化试剂盒纯化回收目的蛋白,再以纯化后的目的蛋白作为包被抗原进行方阵滴定试验,确定目的蛋白作为包被抗原的最佳稀释度.[结果]重组蛋白表达可达菌体蛋白总量的19.7;,且具有较好的反应原性和特异性,以此方法建立的间接ELISA方法对收集的约43头份血清样品进行检测, 检测阳性结果与进口试剂盒检测结果符合率达到93.55;.[结论]以BVDV E2重组蛋白作为抗原建立的间接ELISA检测方法是可行的,为其进一步的标准化莫定基础.     

猪瘟病毒E2基因乳腺特异表达载体的构建

为进一步研究基因疫苗的免疫机制与免疫效果,探讨外源基因在乳腺中的定位表达,应用重组PCR方法,将猪瘟病毒(CSFV)E2基因与牛β-乳球蛋白(BLG)5′部分调控序列连接起来,并插入到真核表达载体pEGFP-C1上,构建了含有CSFVE2基因的乳腺特异表达载体。     

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒地方株动物回归试验

【目的】自流产奶牛粪便及血液中分离得到的非细胞病变型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV),为了解分离毒株的特性,进行回归动物试验;【方法】将此分离毒回归2月龄健康犊牛,接毒25天后扑杀剖检,观察临床症状及病理变化。自犊牛体内采取脾、骨髓、肠淋巴结及血液接种MDBK细胞进行培养,分离病毒,进行细胞传代,将此细胞毒进行RT-PCR检测;【结果】犊牛表现为典型的急性病毒性腹泻症状和病变。自病料分离病毒经MDBK细胞盲传至第9代,均未出现细胞病变。将此细胞毒进行RT-PCR检测,扩增出相应的665bp的片段;【结论】将分离株接种易感犊牛以复制出BVD-MD病症,并从试验牛体内分离得到BVDV,从而进一步确证分离到的毒株属BVDV。     

牛病毒性腹泻病毒山东株的分离与鉴定

牛病毒性腹泻病毒是牛病毒性腹泻-黏膜病的重要病原体,该病毒病是极为复杂、呈多临床类型表现的传染病,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。本研究从疑似牛病毒性腹泻-黏膜病的粪便中分离得到一株病毒能使MDBK细胞产生细胞病变,经RT-PCR检测及扩增产物测序进一步证实,该病毒为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒,TCID50测定该病毒的滴度为107.15TCID50/ml。该病毒株的分离鉴定为牛病毒性腹泻病毒疫苗的研制奠定了基础。     

BVDV-2 E2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据GenBank登录的BVDV-2 E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆SW分离株E2基因进行RT-PCR扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入华赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-E2。用SalⅠ酶切线性化重组质粒pPIC9K-E2,电转化酵母GS115,通过G418筛选重组酵母菌GS115-pPIC9K-E2,用φ=1.5%甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白分子质量为23.2ku;Western blot分析表明,该重组蛋白可与BVDV-2多克隆抗体发生特异性血清学反应,证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性。     

牛病毒性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

参照多株不同基因型和基因亚型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR相对保守的基因序列,设计3对引物,其中1对能够扩增不同基因型BVDV 5′UTR片段(288 bp),另2对分别能够扩增BVDV-1型和BVDV-2型5′UTR片段(195 bp和116 bp)。扩增片段大小与预计片段一致。对PCR反应条件进行优化,建立了一种特异、敏感的RT-nPCR检测方法。敏感性试验表明,敏感性为10-2TCID50/mL。特异性试验表明,对猪瘟兔化弱毒疫苗株、牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的检测结果均为阴性。通过对新疆部分地区无BVD临床症状的牛场208份奶牛血样检测,阳性率为50.43%,表明该方法具有快速、简便、特异性强和灵敏度高等特点,可以作为BVDV隐性感染临床诊断的有效方法。     

牛病毒性腹泻BVDV2/JZ05-1基础毒株的安全性和免疫原性研究

本试验用已分离到的牛病毒性腹泻病毒BVDV2/JZ05-1基础毒株对犊牛免疫的安全性和免疫原性进行了研究。通过对基础毒种单剂量、超剂量、单剂量重复安全试验和免疫原性试验研究证实,BVDV2/JZ05-1对犊牛免疫是安全的,对犊牛感染BVDV有很好的免疫保护效果。     

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒地方株的分离及RT-PCR鉴定

自疑似牛病毒性腹泻-粘膜病的流产奶牛粪便及血液中分离得到一株不产生细胞病变的病毒,经双抗体夹心ELISA检测及RT-PCR扩增进一步证实该病毒为牛病毒性腹泻-粘膜病病毒。     

牛病毒性腹泻病毒抗原抗体检测方法研究进展

随着现代分子生物学与免疫学技术的快速发展与应用,牛病毒性腹泻病毒新型抗原抗体检测方法不断发展和完善对近年来对牛病毒性腹泻病毒的RT—PCR、荧光定量RT—PCR、RT-LAMP、ELISA和胶体金技术等抗原抗体检测方法进行综述,以期为不同实验室寻找适合的诊断方法以及发展新型诊断方法提供参考,为我国牛病毒性腹泻病的综合防控提供合理的科学依据。     

牛病毒性腹泻病毒Real-timePCR方法的建立及其应用

本研究在牛病毒性腹泻病毒5'UTR基因的保守区设计并合成了1对引物,建立了可以定量检测牛病毒性腹泻病毒核酸的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法建立的标准曲线相关系数R2为0.999,扩增效率为95.9%,熔解曲线为单一峰值,可检测到初始模板中4.1×101copies/μL的牛病毒性腹泻病毒核酸,是常规RT-PCR方法敏感性的100倍。该检测方法与猪瘟病毒、传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型病毒等其它牛源病毒均不发生交叉反应;批内与批间重复性试验变异系数均小于2.2%。本试验建立的荧光定量PCR检测方法可用于牛病毒性腹泻病毒的临床诊断。同时,应用本方法对临床病例的各组织器官进行了病毒RNA定量检测结果表明,胸腺等淋巴组织的病毒含量最高,证实病毒主要侵害淋巴器官,此研究可为临床病例的病毒分离提供借鉴。