辣椒WRKY转录因子的鉴别及进化分析

为了深入了解WRKY转录因子调节植物生长发育的过程,以辣椒全基因组和辣椒疫病转录组测序数据为材料,利用生物信息学方法分析辣椒WRKY转录因子的数目、种类、系统发生学和保守基序特征。结果表明,辣椒基因组中至少存在40个WRKY基因,包含1~2个WRKY保守结构域,根据WRKY结构域的数量及锌指结构的特征可将其分为Ⅰ、Ⅱ( a)、Ⅱ( b)、Ⅱ( c)、Ⅱ( d)、Ⅱ( e)和Ⅲ类/亚类。辣椒WRKY基因的保守motif共有3个,motif长度最长为50,最短为21,辣椒WRKY编码的蛋白为151~747个氨基酸,平均氨基酸数量为378.1个。该研究对辣椒WRKY基因功能的研究及进化具有重要的意义。     

海岛棉GbWRKY40基因的克隆及特征分析

【目的】WRKY转录因子调控多种生物学进程,包括植物生长发育和应答多种环境胁迫。本研究旨在分析WRKY转录因子在海岛棉纤维发育中的功能。【方法】从海岛棉中克隆了1个WRKY转录因子基因GbWRKY40,进行同源性分析、多序列比对,利用荧光定量聚合酶链式反应分析其表达模式,通过构建酵母表达载体并转化酵母菌株AH109研究其转录激活活性。【结果】该基因c DNA全长1713 bp,5'非编码区长261 bp,3'非编码区长510 bp;开放阅读框长942 bp,编码313个氨基酸,预测相对分子质量约为34.138×103,等电点为8.46,包含5个外显子和4个内含子;其编码蛋白含有1个WRKY保守区(WRKYGQK)和1个锌指基序(C-X5-C-X23-H-X1-H),属于WRKY家族第Ⅱ类a组,包含3个核定位信号区,与陆地棉GhWRKY40同源性最高。GbWRKY40在根和开花后25 d纤维中表达量高,而且不具有转录激活活性。【结论】GbWRKY40可能参与调控棉纤维次生壁发育。     

樟树WRKY转录因子的克隆与表达分析

WRKY转录因子超家族在植物生物和非生物胁迫响应、生长发育、代谢过程中起着重要的调控作用。本研究基于樟树叶高通量转录组数据设计特异引物,以芳樟醇型樟树叶片为材料,克隆获得6个CcWRKY转录因子,分别命名为CcWRKY1,CcWRKY2,CcWRKY3,CcWRKY4,CcWRKY5,CcWRKY6;序列多重比对显示,CcWRKY蛋白均含有一个保守WRKYGQK氨基酸残基;系统进化分析表明,除CcWRKY2属于第Ⅱ类,其余5个基因均属第Ⅲ类WRKY转录因子亚家族;杨树原生质体瞬时表达结果显示,6个CcWRKY蛋白均定位于细胞核;实时定量PCR检测结果揭示:6个基因在不同组织的表达模式较为相似,均是嫩叶表达量高于花蕾,嫩茎和幼果;在不同化学型中,3个基因CcWRKY1,CcWRKY2,CcWRKY4在芳樟醇型樟叶中优势表达,CcWRKY3在樟脑型叶中表达量相对较高;而CcWRKY5,CcWRKY6的表达均相对较低。推测CcWRKY1,CcWRKY2,CcWRKY4可能参与单萜类化合物芳樟醇的合成调控。     

高粱WRKY家族成员鉴定及生物信息学分析

WRKY转录因子是调控植物生长发育的重要转录因子,本研究利用高粱基因组数据库(v3.1.1),通过生物信息学分析鉴定出97个高粱WRKY基因家族成员,其CDS序列长度为423～4 965 bp,编码氨基酸长度为141～1 655 aa。染色体定位发现97个基因不均匀地分布于10条染色体上,其中3号染色体上数目最多,有23个WRKY基因,6号染色体最少,只有5个WRKY基因。根据WRKY保守结构域和锌指结构的特点对97个转录因子进行分类,可将它们分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三大类,分别有11个、70个和16个成员。另外对WRKY蛋白保守基序分析发现WRKY结构域有3个保守基序组成,各组成员的保守基序基本一致。部分蛋白的WRKY保守域和锌指结构具有多样性,分析发现部分高粱WRKY蛋白的WRKYGQK结构域中‘Q’突变为‘E’、‘S’和‘K’。系统进化关系显示高粱Ⅱ、Ⅲ类WRKY转录因子类聚在Ⅰ的下级分支上,表示Ⅱ和Ⅲ类可能是由Ⅰ类进化而来的。     

菊花CmWRKY4基因克隆及表达分析

WRKY转录因子在植物生长发育和逆境胁迫应答中具有重要作用。本研究克隆了一个菊花WRKY基因CmWRKY4,编码区长1 344 bp,编码447个氨基酸,预测分子量约为49.69 kD,等电点为6.62。推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的WRKY结构域。亚细胞定位预测CmWRKY4蛋白定位于细胞核。进化树分析发现,CmWRKY4和拟南芥At WRKY3,AtWRKY20和At WRKY25聚在一个分支。组织特异性表达模式分析表明CmWRKY4在检测的组织中都有表达,在根中表达量最低,在叶中表达量最高。Cm WRKY4基因的表达受干旱诱导,说明菊花CmWRKY4基因可能参与菊花对干旱胁迫的应答。     

甘薯近缘野生种三浅裂野牵牛WRKY基因家族的生物信息学分析

WRKY基因家族是一类含有WRKY保守结构域的转录因子大家族,是植物中最大的转录调控因子家族之一。目前已有多种植物WRKY家族的分析鉴定报告,但关于甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)中WRKY家族的报告却很少。本研究利用生物信息学方法对甘薯近缘野生种三浅裂野牵牛Ipomoea trifida(Kunth)G.Don的基因组数据进行了详细的分析,结果显示:在三浅裂野牵牛基因组中共鉴定得到82个WRKY转录因子,其中81个不均匀分布在基因组的15条染色体上,第5号染色体上分布最多(10个基因),第8和15号染色体上分布最少(2个基因);蛋白分子大小在116~710个氨基酸之间,等电点为4.85~10.33不等;按照保守结构域分类可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组,Ⅱ组包含Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe五个亚组,其中Ⅰ组有15个ItWRKY基因、Ⅱa组4个、Ⅱb组11个、Ⅱc组23个、Ⅱd组7个Ⅱe组10个、Ⅲ组12个;82个ItWRKY基因中有8个基因的核心结构域WRKYGQK发生了单个氨基酸变化(WRKYGKK)。ItWRKY基因以组织特异性的方式表达且在不同胁迫下基因的表达量存在差异,表明ItWRKY基因参与了三浅裂野牵牛对胁迫的响应。本研究为甘薯WRKY基因的功能鉴定提供了参考作用,进一步为甘薯的分子育种提供了帮助。     

蒙古冰草WRKY转录因子基因的序列分析

WRKY转录因子是一类与植物抗逆相关的蛋白家族,通过激活植物抗逆应答基因的表达而提高其抗逆性。为挖掘蒙古冰草(Agropyron mongolicum)抗旱相关的WRKY基因,本研究在已有转录组测序数据的基础上,用Plant TFDB数据库中的Prediction和Blast对WRKY基因筛选及保守结构域分析,对筛选出的WRKY转录因子用Ex PASy Proteomics Server和MEME程序预测其分子量、等电点和基序、并用MEGA7.0.7与已报道具有抗旱功能的16个WRKY蛋白进行多序列比对分析并构建系统进化树。结果表明:蒙古冰草中筛选出14个WRKY基因,其蛋白大小在63~677 aa范围内,分子量和等电点分别介于7.1~73.3 k D和6.09~10.09之间;基序预测得到1个特征基序,2个保守基序,最长的基序含29个氨基酸。蒙古冰草WRKY转录因子蛋白基本上比较保守,WRKYGQK没有发生变异,但存在着Q残基的变异;进化树分为两大类,一类为Unigene19129、Unigene47036、Unigene50921、其C端锌指结构是C2HC,另一大类Unigene29536、Unigene43681、Unigene52656等C端锌指为C2H2;蒙古冰草中筛选出的WRKY基因与16个具抗旱功能的WRKY基因均有同源性,推测这14个WRKY转录因子参与蒙古冰草干旱逆境下的反应。     

枣WRKY转录因子家族的生物信息学分析

明确枣WRKY转录因子家族生物学特征,为深入研究枣WRKY家族基因的功能提供科学依据。通过DNAMAN6、MEGA5、Mapdarw和MEME Suite 4.12.0等软件对枣WRKY转录因子的数目、基因分类、染色体定位、系统进化关系和保守基序进行了分析。结果表明:枣中包含92个WRKY基因,根据WRKY结构域数量及其锌指结构的特征可将其分为GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ,GroupⅡ又可分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe 5个亚组。枣12条假染色体上除了第7条染色体上没有查到枣WRKY基因分布外,其它11条染色体都有WRKY基因分布,其中第11条染色体上分布最多,有10个WRKY基因,第2条、第5条和第8条染色体分布最少,仅有2个WRKY基因。枣Ⅲ、Ⅱd和Ⅱe处在同一分支,Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb和Ⅱc在同一分支。枣WRKY转录因子在同一类或亚类中含有相同的保守Motif,Motif最长为50,最短为21。枣WRKY转录因子蛋白在67~758个氨基酸范围之间,平均氨基酸个数为384,等电点为4.130 8~10.221 1不等。本研究对进一步探究枣WRKY基因的功能、进化以及分子育种具有重要的现实意义。     

白菜GRF转录因子家族全基因组鉴定、进化及表达模式分析

生长调控因子是植物中一类重要的转录因子,在白菜的生长、发育过程发挥重要作用。本研究利用生物信息学技术对白菜全基因组中的GRFs进行鉴定与分析,利用生物信息学方法分析白菜基因组中的15个GRF转录因子的蛋白质理化性质、基因结构、保守基序等,进一步研究其系统进化和表达模式。结果表明,15个BraGRF蛋白长度为347～538 aa,分子量为37.99～60.83 kD;保守基序motif 1、motif 2、motif 3是GRF蛋白中最保守的基序,BraGRF02、BraGRF03、BraGRF04、BraGRF11和BraGRF13是15个白菜GRF家族中活跃度最低的成员。白菜、拟南芥和水稻的GRFs可分为4个亚类,且同属于双子叶植物的白菜和拟南芥GRF转录因子亲缘关系更近;GRF家族成员在角果和茎中表达水平较高,其中Bra000575 (BraGRF08)和Bra011781 (BraGRF09)这2个基因在茎组织中的表达活性最高。通过对白菜GRF基因家族的生物信息学分析,揭示了白菜GRF转录因子在进化中的特点以及不同组织的表达特性,为后续进一步了解白菜GRF功能验证提供依据。     

小桐子WOX基因家族全基因组鉴定与表达分析

WOX转录因子在植物的生长发育和非生物胁迫响应中起重要的调控作用。基于全基因组和转录组测序数据,本研究首次对小桐子WOX转录因子保守域、保守基序,染色体定位和不同条件下的表达模式进行了全面的分析。总共12个WOX蛋白在小桐子基因组中被鉴定。保守域分析表明,12个小桐子WOX蛋白的结构域均含有螺旋-环-螺旋-拐角-螺旋基序。染色体定位分析表明,小桐子12个WOX蛋白不均匀地分布在7个连锁群(LGs)上,然而,没有WOX蛋白定位于LG1、LG5、LG7和LG8。系统发育树的结果表明,12个小桐子WOX蛋白被分成3个组即Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ。在这12个WOX基因中,部分基因在被检测的组织中(根,茎皮层,叶和种子)显示出差异表达模式,如1个WOX基因(JcWOX1)在根中表达最高,3个WOX基因(JcWOX3, JcWOX7, JcWOX12)在种子中表达最高。此外,表达模式和qRT-PCR分析显示,3个小桐子WOX基因的表达在至少一个胁迫(干旱或者盐)条件下显示出至少2倍的增加或者降低。在这3个差异表达小桐子WOX基因中,2个WOX基因(JcWOX1, JcWOX6)在至少一个处理时间点表现出对干旱和盐胁迫响应,1个基因(JcWOX5)仅仅对干旱胁迫响应。该结果将为进一步研究WOX基因在调控小桐子生长发育和非生物胁迫响应中的作用提供一些有价值的信息,为小桐子WOX基因的功能研究与利用提供科学依据。     

亚洲棉和雷蒙德氏棉PEBP家族基因的鉴定及该家族基因在陆地棉组织中表达分析

磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyl ethanolamine-binding proteins,PEBP)基因家族广泛存在于真核生物中,在被子植物中主要起着促进或抑制开花和控制株型的作用。利用亚洲棉(Gossypium arboreum,A2)和雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii,D5)的基因组数据库,分别搜索到8个棉花PEBP同源基因,都包含4个外显子和3个内含子,编码的蛋白都存在PEBP家族的保守基序和关键氨基酸位点,表明二倍体棉花中至少存在8个PEBP家族基因。进化分析表明,8个PEBP基因分属于3个亚家族,含FLOWERING LOCUS T(FT)-like亚家族1个、TERMINAL FLOWER 1(TFL1)-like亚家族5个(包括3个TFL1和2个BFT)、MOTHER OF FT AND TFL1(MFT)-like亚家族2个。实时荧光定量PCR分析陆地棉(Gossypium hirsutum)8个PEBP基因在根、茎、叶、幼苗顶端分生组织、花、胚珠和25 d的纤维组织中的表达,表明FT1在叶片中表达量最高,其次在纤维、胚珠和花中;MFT1在各组织中均表达,但在纤维中表达量最高,其次是花和叶片中,而MFT2以在叶片中表达为主;TFL1a、TFL1b和TFL1c均在根中表达量最高,但TFL1c在叶片、花和胚珠中也有相对较高的表达;BFT1和BFT2在叶片中表达量最高,但除幼苗顶端分生组织外,BFT1在其他各组织中的表达明显高于BFT2。这些结果表明,PEBP家族基因在棉花的生长发育中可能具有不同的功能。     

转Bt基因棉花选择标记基因nptⅡ转录后沉默分析

本研究利用病毒诱导基因沉默技术对转Bt基因棉花选择标记基因nptⅡ进行沉默,分析标记基因转录后沉默的可行性。以烟草脆裂病毒载体为骨架构建nptⅡRNAi载体,利用农杆菌浸染棉花子叶,获得nptⅡ干涉的转Bt基因棉花植株,然后涂抹卡那霉素进行检测。结果表明nptⅡ沉默植株叶片出现黄斑症状,RT-PCR和q RT-PCR检测表明叶片、根和茎中nptⅡ基因转录分别被抑制了99.25%、99.05%和98.65%,沉默后期的转录抑制也达到98%。本研究结果为解决已经在环境中释放转基因生物发生意外扩散和不可预料的生物安全事件提供了快速有效的应对方法和新思路。     

陆地棉三个WRKY基因的克隆及表达分析

WRKY转录因子可调控下游抗逆基因的表达,进而在植物生长发育以及对外界环境的反应中起着重要的调控作用,目前对棉花WRKY家族基因的研究比较少。本研究利用电子克隆的方法,从陆地棉品种山农圣杂3号中克隆得到了3个具有完整开放阅读框的棉花WRKY基因,聚类分析表明它们同属于WRKY家族中的第Ⅱ类。利用RT-PCR结果表明:250mmol/LNaCl盐胁迫和20%PEG6000干旱胁迫下同时诱导GhWRKY4的基因表达,GhWRKY5仅受干旱胁迫下的诱导,而GhWRKY6对这两种逆境胁迫都没有变化。     

基于转录组测序数据的青稞WRKY基因家族的生物信息学分析

WRKY是植物中一类重要的转录因子,广泛调控了植物的生长发育和逆境胁迫应答。基于青稞白粉病侵染幼苗的转录组测序数据,本研究鉴定得到41个青稞WRKY转录因子,被划分为3个大组:Ⅰ组(6个)、Ⅱ组(21个)和Ⅲ组(12个)。另外,Hv WRKY40和Hv WRKY41没有分组。青稞WRKY基因进化分析的聚类结果和分组结果一致,进一步支持了我们分组的正确性。包括HvWRKY2、HvWRKY8、HvWRKY13、HvWRKY34和HvWRKY41,以及HvWRKY4、HvWRKY7、HvWRKY20、HvWRKY26和HvWRKY30在内的两组WRKY基因,表现出明显的先升高(36 h和72 h),后降低(168 h)的基因表达趋势。这些WRKY基因很可能参与了调控青稞抗白粉病的分子应答机制。青稞WRKY家族的蛋白相互作用网络中,Hv WRKY3、Hv WRKY8、Hv WRKY9属于网络中的主要中心节点。此外,Hv WRKY3、Hv WRKY8、Hv WRKY9、Hv WRKY30、HvWRKY34、Hv WRKY38、Hv WRKY39彼此之间相互作用,是蛋白互作网络的核心网络。本研究挖掘了青稞的WRKY家族成员,系统分析了家族成员的分组、家族成员的WRKY保守域特点、家族成员之间的进化关系、白粉菌侵染下的基因表达水平和家族成员的蛋白互作网络。本研究可为今后青稞的抗逆研究提供优良的候选WRKY基因。     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

甘蔗ScWRKY4基因的克隆与表达特性分析

WRKY是植物中特有的转录因子家族之一, 在植物对生物和非生物逆境胁迫的应答反应中起重要调控作用。本研究基于课题组前期构建的甘蔗(Saccharum spp.)转录组数据库, 从新台糖22 (ROC22)中成功克隆到1个WRKY基因, 命名为ScWRKY4 (GenBank登录号为MG852087)。序列分析发现, ScWRKY4基因cDNA全长1265 bp, 包含1个741 bp的完整开放读码框, 编码246个氨基酸, 该蛋白具有1个WRKYGQK保守结构域和C₂H₂锌指结构域, 属于IIc类WRKY转录因子。生物信息学预测分析发现, ScWRKY4蛋白为碱性的不稳定亲水性蛋白, 不存在信号肽和跨膜结构域, 蛋白二级结构元件缺少β螺旋。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达中, ScWRKY4蛋白定位于细胞核。酵母杂交实验结果显示, ScWRKY4不具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明, ScWRKY4基因在甘蔗的根、叶、芽和皮中的表达量无明显差异, 在蔗肉中的表达量最高, 为对照蔗根的18.38倍; 黑穗病菌侵染0~72 h, ScWRKY4在抗病品种崖城05-179中下调表达, 在感病品种ROC22中表达较稳定; 受到外源激素脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯以及非生物胁迫因子氯化钠和聚乙二醇胁迫后, ScWRKY4基因均被诱导上调表达。上述研究结果表明, ScWRKY4基因可能不参与甘蔗对黑穗病的抗性反应或在该防御方面起负调控作用, 但积极响应甘蔗对盐和干旱胁迫的应答。     

陆地棉油菜素内酯信号基因GhBES1家族的鉴定及表达分析

BES1基因是植物激素油菜素内酯信号转导过程中的重要转录因子,为了解陆地棉油菜素内酯信号基因Gh BESI家族,通过对陆地棉异源四倍体标准系TM-1基因组数据库的全面分析和鉴定,获得21个GhBES1基因,这些基因分布在不同的亚基因组,有9对基因在A亚组和D亚组上存在对应关系,AD亚组对应基因序列一致性高于95%。根据进化分析,21个GhBES1基因分为4个亚家族,除了亚家族Ⅲ,其他3个亚家族在拟南芥中均有对应基因;除了亚家族Ⅳ基因和亚家族Ⅱ中GhBES1-1基因外,其他GhBES1基因均有2个外显子。亚细胞定位结果表明,21个GhBES1蛋白主要定位到细胞核、细胞质等部位,其中7对基因的蛋白亚细胞定位完全一致。GhBES1基因在根、茎、叶、顶端分生组织中均有表达,但不同亚家族基因在不同组织中的表达水平存在差异。研究结果为棉花GhBES1基因家族功能的深入研究奠定了基础。     

番木瓜芥子酶基因的表达调控和酶活性研究

以番木瓜为材料,通过RT-PCR方法,研究了芥子酶基因CpTGG1和CpTGG2在不同组织器官的表达情况,结果表明CpTGG1基因在番木瓜的茎、叶、花、种子中表达,在根和果实中不表达,而CpTGG2仅在根中表达,在其它器官中都没有检测到表达产物,表明两个芥子酶基因存在明确的分工。两个基因都不在果肉中表达。酶活性测定表明,除了果肉外的其它器官中都有芥子酶活性,这与RT-PCR的结果是一致的。对叶片芥子酶的活性研究结果表明,其最适pH为8.0,最适温度为45℃,高温下（80℃）酶迅速失活,最适Vc浓度为1.5mM,高盐浓度对酶活性有抑制作用。     

水稻转录因子WRKY68在Xa21介导的抗白叶枯病反应中发挥正调控作用

白叶枯病是一种严重影响水稻产量的细菌性病害。Xa21是第一个克隆的抗白叶枯病基因,具有广谱抗性,在水稻抗病育种中被广泛应用。转录因子的鉴定对解析Xa21介导的水稻抗白叶枯病分子机制具有重要意义。本研究构建了Xa21背景下的WRKY68-RNAi转基因水稻。与受体材料4021相比,转基因水稻中WRKY68蛋白质丰度下调,接种白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)后抗病性下降,证明WRKY68基因在Xa21介导的抗白叶枯病反应中发挥正调控作用。此外,转基因受体材料4021和感病对照TP309接种后不同时期和部位叶片中WRKY68的蛋白质丰度没有显著差异,表明WRKY68蛋白质的表达不受抗病基因Xa21和病原物Xoo诱导,推测其功能主要是调控下游基因的表达。WRKY68-RNAi转基因水稻接种后, PR1A、PR5、PR10A、PR-pha和PAL1等病程相关蛋白质表达丰度发生变化,表明相关基因可能在WRKY68基因的调控下参与下游抗病反应。