木薯EIL基因克隆和蛋白诱导表达及纯化

ETHYLENE INSENSITIVE3-LIKE(EIL)基因家族是乙烯信号通道重要的正调控因子,在乙烯信号传递过程中启动抗病相关基因表达参与植物免疫应答提高植物的抗性。为了研究EIL基因编码蛋白与下游靶基因特异性结合传递乙烯信号,是否参与木薯抗逆境胁迫的调控,本研究从木薯中克隆一个EIL同源基因,命名为MeEIL。分析MeEIL启动子所包含的各种功能元件,结果显示该启动子中含有G-box、W box和MYC等元件。对MeEIL基因的ORF分析结果表明该基因编码含621个氨基酸残基的蛋白质。使用同源重组的方法将MeEIL的CDS序列连接到蛋白表达载体pET32a上。SDS-PAGE检测表明在28℃和16℃都可成功诱导蛋白表达,且28℃诱导效果更佳,通过大量诱导蛋白表达并用His标签纯化试剂盒纯化,Western blot分析验证MeEIL蛋白被成功的诱导出来。     

木薯MeSWEET3b的基因克隆及功能分析

SWEET基因家族是近年新发现的一类糖转运蛋白家族,对植物的生长发育、激素平衡及植物与微生物互作等方面有着重要的调控作用。为了探索木薯SWEET基因的功能,本研究通过RT-PCR的方法从木薯主栽品种‘华南9号’(SC9)的叶片中克隆得到了木薯MeSWEET3b基因,并对其进行了生物信息学分析和功能的初步探究。结果表明,木薯MeSWEET3b蛋白具有典型的SWEET蛋白结构域的特征,含有2个Mt N3＿slv结构域和7个跨膜螺旋;MeSWEET3b与拟南芥AtSWEET3基因、水稻OsSWEET3a、OsSWEET3b基因高度同源,都属于CladeⅠ的第一分支;木薯MeSWEET蛋白定位在细胞膜上,且行使转运半乳糖的功能。此外,木薯MeSWEET3b基因还受到木薯黄单胞菌Xam的诱导而高表达。本研究明确了木薯SWEET家族成员MeSWEET3b转运半乳糖这一重要功能,且受到病原菌Xam的诱导表达。本实验结果为进一步揭示木薯体内光合产物从源到库的运输分配以及木薯与微生物互作机理提供了理论依据。     

木薯Ⅴ型几丁质酶MeCHITVb基因克隆及其表达载体构建

几丁质酶在生物逆境环境和非生物逆境环境中发挥着重要作用.为研究木薯几丁质酶在响应低温胁迫下的分子作用机制,利用RT-PCR技术,从木薯耐低温品种SC124中克隆到CHITVb基因,利用平末端连接技术构建pEASY-MeCHITVb克隆载体,用于测序确定目标基因序列,并对其序列进行分析,构建植物表达载体.结果 表明,成功克隆木薯CHITVb基因,命名为MeCHITVb.通过生物信息学分析,该基因全长1050 bp,编码349个氨基酸,理论相对分子量为38.08 kD,理论等电点为4.53,是一种稳定蛋白.经序列比对和系统进化树分析表明,MeCHITVb基因与烟草、拟南芥V型几丁质酶基因亲缘关系最近.用pEASY-MeCHITVb与植物表达载体pISV2678构建重组子pISV-MeCHITVb,利用"Golden Gate"克隆方法构建基因编辑载体CRISPR/Cas9-MeCHITVb.将植物过表达的pISV-MeCHITVb和CRISPR/Cas9-MeCHITVb载体成功转化为根状杆菌LBA4404.本研究为后续MeCHITVb基因功能研究、木薯抗寒、抗病品种的选育及木薯北移栽培提供理论依据.     

木薯MeVINV1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建及验证

液泡转化酶(vacuolar invertase, VINV)是参与植物蔗糖代谢、器官发育的关键酶之一。木薯MeVINV1在块根发育及淀粉积累阶段的表达活跃,对该基因进行编辑敲除,将有助于解析MeVINV1在木薯块根淀粉积累过程中的作用。本研究构建了MeVINV1的CRISPR/Cas9基因编辑载体,转化木薯脆性胚性愈伤组织以验证载体的编辑效果。结果发现：转化后的样品中,MeVINV1基因靶点位置出现测序多峰,而未转化样品中没有多峰出现,表明本研究构建的基因编辑载体可对MeVINV1基因进行编辑;检测分析潜在脱靶位点的序列,发现未出现脱靶现象。该研究为获得MeVINV1基因的突变体,明确其在木薯块根发育及淀粉积累过程中的功能奠定了基础。     

木薯(Manihot esculenta)AKT1基因的克隆及生物信息学分析

植物细胞中的K^+通道蛋白AKT1(Arabidopsis K^+transpoter 1)主要负责吸收K^+。本研究基于木薯基因组数据库信息,利用PCR技术从木薯中克隆一个MeAKT1基因,该基因全长2634 bp,编码877个氨基酸,生物信息学分析表明MeAKT1含有10个外显子和9个内含子,编码的氨基酸分子量为99.02 kD,等电点为8.43,属于稳定蛋白。MeAKT1包含有5个跨膜区域,N端含有1个Ion_trans结构域,C端有1个KHA结构域,其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,进化树分析发现MeAKT1与蓖麻RcAKT1的亲缘关系最近。通过对MeAKT1蛋白的生物信息学分析有助于下一步深入研究MeAKT1在木薯耐贫瘠过程中的功能。     

木薯金属硫蛋白基因的克隆和表达分析

金属硫蛋白(metallothionein,MT)分子量小,半胱氨酸含量高,具有消除离子自由基,减弱重金属毒性和减少体内活性氧积累等功能。为探究木薯金属硫蛋白基因(MeMT)的原核表达能力和对活性氧的耐受性,本研究通过木薯cDNA克隆获取MeMT并将其连接至pET-28a,在BL21(DE3)菌株中成功诱导其表达。H2O2耐受性分析发现,与空载菌株相比,表达MeMT蛋白的DE3菌株对H2O2的耐受水平较高。RT-qPCR技术检测显示,在H2O2胁迫下,3 h时木薯叶片中MeMT的表达水平明显升高,但6 h时恢复甚至略低于对照组,证明MeMT在木薯中参与ROS应答过程。该结果对研究木薯抗逆性和产量的提高具有重要意义。     

基于木薯全基因组重测序的InDel标记开发及应用

本研究旨在开发稳定可靠、操作简便的木薯In Del分子标记,为木薯种质资源遗传多样性研究、品种鉴定等工作提供有力工具,为木薯育种发展提供保障。本研究基于22份木薯种质资源全基因组重测序分析结果随机挑选了64个In Del分子标记进行引物设计并利用琼脂糖凝胶电泳检测进行有效性验证,结果有20对引物具有多态性,多态性率为31.25%。随后将具有多态性的且扩增效果最优的18个InDel标记扩增条带数进行统计生成矩阵用于木薯种质资源遗传多样性研究,各标记的基因多样性指数于0.21～0.50之间,香农多样性指数于0.36～0.70之间。聚类结果分析将72份木薯材料在遗传相似系数0.62处划分为2大类群。且将中国的地方品种及选育品种大多划分至1#中的同一分支,其余薯肉颜色及内皮颜色相同的木薯材料大多都聚类到了一起。此外,本研究开发出的In Del分子标记IDC46具有特异性,可用于特定木薯材料鉴定。说明后期InDel引物有望成为木薯指纹图谱及分子身份证构建的有效工具,本研究结果也将对木薯育种工作后续开展具有一定的参考意义。     

木薯MeCYP79D1和MeCYP79D2基因启动子克隆及表达模式分析

MeCYP79D1和MeCYP79D2基因是调控木薯生氰糖苷合成的关键基因,研究其表达特性对低氰木薯改良具有重要意义。为了探究MeCYP79D1和MeCYP79D2基因在SC8木薯品种中的表达模式,本研究克隆获得了SC8木薯品种的MeCYP79D1和MeCYP79D2基因启动子,发现它们的启动子上具有ABA、SA、GA、Me JA及生长素等激素响应元件,同时具有低温、干旱、伤害胁迫相关元件。采用ABA、SA、GA3、MeJA、低温处理,证明MeCYP79D1和MeCYP79D2基因表达受激素和低温调控。MeCYP79D1和MeCYP79D2基因主要在须根中表达,其次为嫩叶;在块根发育过程中,MeCYP79D1和MeCYP79D2基因主要在块根形成期和膨大前期表达。此研究结果为解析MeCYP79D1和MeCYP79D2基因表达调控机理提供了新的线索。     

木薯有性四倍体遗传稳定性分析

木薯作为中国重要的经济作物,其优良品种的选育一直是木薯科研工作的重点,而多倍体的巨型性特点为其育种提供了新的思路,目前多倍体研究大多是体细胞加倍,有性多倍化研究起步较晚,而本课题组通过2n配子有性活体杂交,成功获得了首例木薯有性四倍体植株。为了研究木薯有性四倍体的遗传稳定性,本研究分别采用:田间的农艺性状观测(生长稳定期)、流式细胞术、叶片染色体计数、蛋白质含量测定/蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳以及淀粉含量测定等方法进行鉴定。结果显示:木薯有性四倍体各株系农艺性状均保持了母株器官巨型性的多倍体特征;流式细胞仪分析显示,木薯有性四倍体各株系叶片DNA含量均为二倍体亲本(SC5)的两倍,相对应的叶片染色体数目也为二倍体亲本(SC5)的两倍,且视野中四倍体细胞所占比例均在90%以上;各株系蛋白质含量均小于二倍体对照组,且有性多倍体株系电泳谱带基本相似;在淀粉含量测定中,其各株系淀粉含量均小于对照组,且各株系之间含量波动较小。本研究结果表明木薯有性四倍体植株具有较好的遗传稳定性,对木薯多倍体品种的选育具有重要意义。     

木薯叶芽和花芽的转录组差异分析

本研究以木薯花芽与叶芽为材料,通过Illumina HiSeqTM4000测序平台对其进行转录组测序,结果获得高质量序列45 010 506个、碱基数13.46 Gb,GC含量在43.5%以上、比对效率在78%以上。筛选得到3 782个差异表达基因(DEGs),其中上调2 409个、下调1 373个。DEGs涉及的主要功能有一般功能预测,翻译,复制、重组与修复,信号传导机制,次生产物合成、运输与代谢,翻译后修饰、蛋白质周转和分子伴侣,氨基酸运输与代谢,碳水化合物运输与代谢。DEGs显著富集的KEGG通路主要有植物激素信号传导、苯丙烷类生物合成、淀粉和蔗糖代谢、苯丙氨酸代谢、氨基酸的生物合成和碳代谢。获得植物开花相关基因47个,其中39个上调表达、8个下调表达。研究结果在一定程度上解析了木薯花芽分化的分子机制,并为后续的深入研究提供了基础数据。     

木薯低温诱导基因MeLTI6A的克隆与序列分析

为了研究木薯(Manihot esculenta Crantz)的抗逆境胁迫机制,从水稻低温诱导及抗旱基因OsLTI6A出发,同源克隆了木薯的抗逆基因MeLIT6A,并对其序列和功能进行了分析研究。MeLIT6A的基因组序列全长为273 bp,其中ORF长度为173 bp,内含子长度为99 bp;编码1个含有57个氨基酸残基的蛋白,含有1个与Pmp3超级家族同源性极高的保守区域。该基因推导蛋白MELTI6A与蓖麻的、拟南芥的、水稻的、玉米的低温诱导蛋白基因6A (LTI6A)的推导蛋白的同源性分别为：89.7%。81.0%、74.1%和87.9%。蛋白功能分类预测MELTI6A是1个非酶类的、疏水性较高的、有2个透膜区域的蛋白,可能有转运蛋白和作为受体蛋白的功能,与拟南芥的AtLTI6A的功能相似。     

烟草脱水素基因NtDEH1的克隆及研究

为研究脱水素在植物早期胚胎发育中的作用和机理,采用显微操作技术获得烟草卵细胞并构建其c DNA文库,从中筛选到一个脱水素基因NtDEH1。通过RACE技术获得该基因全长,基因组测序结合生物信息学分析表明该基因拥有一段长度为651 bp的完整开放阅读框和一段535 bp的内含子,编码由217个氨基酸残基组成的蛋白质,其理论等电点为5.27,属于酸性蛋白,且具有一定的亲水性。氨基酸序列比对分析发现在许多物种比如绒毛状烟草、林烟草、甜辣椒、番茄、马铃薯和丹参中都具有与NtDEH1蛋白非常类似的保守的同源序列,均具有SK2型脱水素特征。借助Genome walking技术获取NtDEH1基因约1 706 bp的5'侧翼序列,使用小叶烟草瞬时表达系统检测到其具有较强的启动子活性。该研究为进一步了解脱水素基因NtDEH1在植物生殖发育中的具体功能打下基础。     

结缕草CBF基因的同源克隆及其转基因拟南芥的抗寒性验证

结缕草是优良的暖季型草坪草之一, 主要用于亚热带和热带地区的草坪种植。抗冷性是结缕草栽培范围的限制因子。本研究以日本最北部原产的结缕草品系为材料, 根据其他植物的已知的抗寒基因CBF序列, 通过同源克隆的方法获得结缕草中相对应的同源基因ZjCBF;根据和其他已报告的CBF序列的比对结果, 我们确定ZjCBF基因属于CBF转录因子家族基因中CBF1型基因。利用半定量PCR和实时定量PCR分析该基因在寒冷条件下的表达情况, 发现ZjCBF基因受冷胁迫的诱导, 在4℃处理6 h时表达量最高。在此基础上, 本研究构建了该基因的过表达载体, 并将其转化到拟南芥中, 通过低温冷处理实验发现, 不论是否经过冷驯化, 转基因ZjCBF的植株由于ZjCBF的过量表达都要比野生型植株抗寒性强。     

玉米ZmGS5基因克隆、分子特性分析及对拟南芥的遗传转化

高产是玉米育种的重要目标,籽粒大小是决定籽粒产量的重要因子。基于水稻中控制籽粒大小的OsGS5基因编码序列,利用同源克隆方法,获得了玉米ZmGS5基因,其cDNA全长为1 695bp,开放阅读框1 491bp,编码496个氨基酸,含有Peptidase-S10结构域、1个信号肽和1个丝氨酸羧肽酶（serine carboxypeptidases,SCP）类蛋白所特有的催化活性中心,这些都与SCP家族结构特点相符,也与OsGS5相关研究结果相同;磷酸化位点分析结果表明,ZmGS5含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等蛋白激酶识别位点。qRT-PCR分析显示ZmGS5在雄穗和叶片中的表达量较高,而在胚及胚乳中的表达量相对较低。除此之外,采用农杆菌介导法,建立了拟南芥的遗传转化体系,得到纯合转基因株系,T₃代转基因拟南芥种子千粒重为0.0169g,较野生型千粒重（0.0139g）高。