红肉枇杷和白肉枇杷果实成熟不同阶段的比较转录组研究

本研究对红肉枇杷和白肉枇杷在果实转色到成熟间的4个时期(授粉后第171天,第175天,第180天,第185天)样本进行转录组测序。除去低质量数据后共得到约9.5 Gb的Clean reads,组装出61 587条Unigenes。在阈值为|log2 Ratio|≥1和Probability0.8时,共检测到28 216个Unigenes(13 676个上调和14 540个下调)差异表达。Gene Ontology(GO)和KEGG分析表明有40个GO类别和121代谢通路显著富集,涉及次级代谢物合成、植物激素信号传导、氧化磷酸化、糖酵解、淀粉与蔗糖代谢、氨基糖与核糖代谢等。此外从中鉴定出21个与类胡萝卜素代谢相关的基因,大部分基因在授粉后171 d时在红肉枇杷果肉中的表达量要显著高于白肉枇杷。研究结果为枇杷果肉颜色形成机制的阐明和枇杷遗传改良育种提供了理论依据。     

枇杷EjAO基因的克隆与表达分析

果实的成熟和衰老是个复杂的生物学过程,一般认为活性氧(ROS)在其中起着重要作用。本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和RT-PCR相结合的方法,从白肉枇杷成熟期果实中成功克隆到一个编码抗坏血酸氧化酶(AO)的基因,命名为EjAO。该基因全长2 174 bp,包含了长度为1 605 bp的开放阅读框。该阅读框编码的氨基酸数目为534个,所形成的蛋白质预测分子量为59.39 kD。实时荧光定量PCR结果显示EjAO在根和果实中高丰度表达,并且在白肉枇杷成熟期果实中的表达量远远高于红肉枇杷。核苷酸多态性分析显示EjAO基因在红肉枇杷和白肉枇杷共有五处多态性位点,其中T719C和A730C均导致氨基酸发生改变,推测可能对EjAO的酶学活性产生影响。EjAO的克隆和多态性位点的鉴定为阐明枇杷果实成熟与衰老机制及枇杷遗传改良育种提供一定的理论依据。     

苹果UV-B受体基因UVR8的克隆及生物信息学分析

本研究以‘富士’苹果红色芽变品种‘烟富8’果皮为试验材料,采用RT-PCR方法,克隆获得苹果UV-B受体基因UVR8的全长序列,命名为Md UVR8。结果显示,开放阅读框长度为1 359 bp,编码452个氨基酸,相对分子质量48.487 k D,等电点(PI)为5.56。蛋白质保守域分析表明,苹果UVR8蛋白包含7个RCC1结构域。蛋白质二级结构预测显示,苹果UVR8蛋白含有10个琢-螺旋,16个茁折叠,41个茁-转角。氨基酸同源性比对分析表明,苹果UVR8与已报道的其他植物的氨基酸序列相似性在69.54%~88.94%之间。核苷酸聚类分析表明,苹果和白梨首先聚为一类,其次是梅。本研究为苹果光受体对光应答的分子机理的进一步研究奠定了基础。     

枇杷EjICE1基因的克隆及其在低温胁迫下的表达分析

本研究以‘大五星’枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)为材料,采用RT-PCR与RACE法从枇杷中分离了EjICE1基因。该基因cDNA序列全长2 134 bp,具有一个1 623 bp长的开放阅读框,编码540个氨基酸,含MYC型bHLH结构域。同源性分析表明,枇杷ICE1蛋白与其他植物ICE1蛋白具有很高的相似性,与苹果(Malus domestica)相似性高达97%。进化树分析表明,枇杷与苹果聚在一起,与苹果进化关系最近。低温胁迫处理枇杷幼果,丙二醛含量呈上升趋势,游离脯氨酸含量呈先上升后下降趋势,表明枇杷幼果膜脂过氧化程度加剧,其抵御能力存在最大阈值。qRT-PCR分析发现,低温胁迫下EjICE1基因表达量明显增加,表明低温胁迫影响枇杷EjICE1基因表达,本研究为培育抗逆性强的优质品种提供了理论依据。     

芒果HMGR家族基因的鉴定、系统进化和表达分析

羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是甲羟戊酸(MVA)途径的第一个限速酶。为了探索HMGR家族基因在芒果中的作用,本研究鉴定了芒果HMGR家族基因,并对HMGR家族基因的理化性质、系统发育及在芒果中的表达量进行了分析。结果显示,芒果HMGR家族蛋白序列均包含完整的HMG-CoA_red结构域,且HMGR家族蛋白均为疏水性蛋白。系统发育树显示,HMGR家族基因是从苔藓植物开始形成的,且芒果HMGR家族基因均聚在双子叶植物的分支,与物种进化历程一致。HMGR家族基因在芒果品种‘贵妃’和‘台农’成熟果果肉中的表达量结果显示,Mi15g11840.1和Mi19g11720.1基因在‘贵妃’中的表达量显著高于‘台农’,Mi18g12500.1基因在‘贵妃’中的表达量显著低于‘台农’,而Mi04g11220.1基因在两个品种中的表达量差异不显著。本研究为进一步研究芒果HMGR家族基因在MVA途径中的作用提供了科学依据。     

萝卜PAL全基因组家族鉴定及在不同颜色类型萝卜中的表达分析

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)是类黄酮生物合成途径中的第一个关键酶,在植物花色苷的积累过程中起着重要的作用。本研究从萝卜基因组中鉴定到了5个PAL家族成员并命名为RsPAL1～RsPAL5,以胭脂萝卜‘红心1号’为材料克隆了这5个RsPALs的开放阅读框,利用荧光定量PCR技术分析了其在红皮红肉的‘砂罐萝卜’和‘红心1号’、红皮白肉的‘砂罐1号’和‘满堂红’和白皮白肉的‘春不老’的叶片、叶柄、皮和肉中的表达水平。结果显示,5个RsPALs基因开放阅读框长度分别为2 160、2 166、2 163、2 124和2 109 bp,分别编码719、721、720、707和702个氨基酸。氨基酸序列比对和系统进化树分析发现5个Rs PALs成员都有MIO保守结构域(Ala-Gly-Ser),RsPAL1～RsPAL4与拟南芥AtPAL1和At-PAL2聚在一起,Rs PAL5与AtPAL4聚在一起。不同品种不同组织中的定量PCR结果显示,RsPAL4仅在积累花色苷的组织中表达,且与花色苷含量呈正相关,这表明RsPAL4是参与萝卜花色苷生物合成途径的关键基因;其他4个成员在不同品种和不同组织中的表达并无明显的规律,可能参与了苯丙烷类代谢的其他次生代谢途径。本研究为进一步深入研究萝卜PAL的功能奠定了基础。     

沙棘3-磷酸甘油脱氢酶基因生物信息学及表达分析

沙棘果肉和种子组织中均富含生物活性油。3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)是促进油脂合成前体甘油-3-磷酸(G3P)合成的限速酶。本研究对沙棘HrGPD1基因进行生物信息学分析(氨基酸序列,保守域,亚细胞定位等),及其在沙棘不同组织(果肉和种子)中的表达情况。研究发现:HrGPD1开放阅读框为1 143 bp,编码380个氨基酸,无信号肽和跨膜结构域,存在多个磷酸化位点,定位于质体中,蛋白高级结构以α-螺旋为主,该蛋白序列与桑、梅、烟草和拟南芥的GPD表现出较高的序列相似性。qRT-PCR分析发现,HrGPD1基因在沙棘品系‘新俄3号’成熟种子和果肉中的相对表达量分别为0.52和1.35,与二者的含油率高低规律相一致。这为进一步研究HrGPD1基因在沙棘生物活性油合成过程中的作用机理提供科学依据。     

橄榄果实氨基酸转运蛋白基因CaAAP1、CaAAP2和CaAAP4的克隆与表达分析

氨基酸通透酶(amino acid permease, AAP)参与植物氨基酸的转运、吸收、氮代谢等途径。为了解橄榄果实AAP基因在不同品种果实成熟发育过程的表达模式,本研究以呈味差异显著的两个品种普通橄榄‘长营’和清橄榄‘梅埔2号’为试验材料,通过RT-PCR方法克隆了3个APP基因的cDNA序列全长,并对其进行了生物学信息分析与亚细胞定位分析,同时利用实时荧光定量PCR技术分析了两个不同品种果实在不同发育时期的CaAAPs表达情况。结果表明：3个基因的序列长度分别为1 254 bp (CaAAP1)、405 bp (CaAAP2)、633 bp (CaAAP4),其编码的蛋白均为不稳定疏水性蛋白,分别含有7、1、5个跨膜区,保守基序差异较大;亚细胞定位结果表明,CaAAP1、CaAAP2主要在细胞质膜上表达。荧光定量结果表明随着果实的发育,CaAAP1、CaAAP2和CaAAP4在‘长营’果实的表达量均呈显著上升趋势,在‘梅埔2号’的表达量变化趋势较平缓,且在170 d时显著下降,两个品种CaAAPs家族基因表达量差异大,表明CaAAP1、CaAAP2、CaAAP4基因可能对橄榄果...     

芒果FLC同源基因的克隆和表达分析

开花抑制基因FLC (FLOWERING LOCUS C)是春化作用中的关键基因,为探索MADS-box转录因子在芒果花器官发育中的作用,本研究利用RT-PCR克隆得到芒果MADS-box转录因子MiFLC的cDNA全长,序列分析显示该基因具有MADS_MEF2_like和K-box结构域,属于MADS-box基因家族,MiFLC基因编码区长576 bp,编码191个氨基酸,蛋白质相对分子质量22.08 kD,等电点为9.18。MiFLC的生物信息学分析表明该蛋白序列的二级结构主要由α螺旋、无规则转曲及延伸链构成,属于亲水性氨基酸。序列分析和系统进化树分析显示,MiFLC基因编码的蛋白与橙子、枳、龙眼、克莱门柚的蛋白序列同源性高,亲缘关系较近。组织特异性表达分析表明,MiFLC基因在芒果不同品种和每个品种的不同组织部位均有表达,在‘桂七’、‘金煌’、‘凯特’3个品种的表达量呈现出一致性,在营养器官中表达量最高,在花器官中表达量较低,表达量顺序依次是叶茎果花。     

桃PpATP9与PpATP4基因的克隆与表达分析

为探究桃PpATP9和PpATP4基因在自然越冬过程中的表达情况,以‘21世纪’、‘珲春’、‘中华寿桃’为试材,根据PpATP9 (MF062454.1)与PpATP4 (MF062457.1)全长序列设计引物,从三个桃品种中分别克隆得到243 bp的PpATP9全长基因序列和597 bp的PpATP4全长基因序列。三个桃品种中的PpATP9和PpATP4氨基酸序列与已知序列完全一致,序列高度保守。氨基酸理化分析表明,PpATP9与PpATP4蛋白理论分子量分别为8.051和22.122 kD,理论等电点分别为5.32和9.34,脂肪族氨基酸指数分别为99.12和104.34,均为不稳定蛋白。聚类分析表明PpATP9与苹果(Malus domestica) ATP9基因亲缘关系最近,PpATP4与扁桃(Prunus dulcis L.)和红叶李(Prunus cerasifera) ATP4基因的亲缘关系最近。RT-qPCR结果显示,PpATP9基因在三个桃品种花芽中的表达量与温度变化趋势一致,而在韧皮部中,‘21世纪’与‘中华寿桃’呈先升高后降低趋势,‘珲春’则呈现降低趋势。PpAT...     

苹果梨bHLH130基因的克隆与生物信息学分析

苹果梨套袋处理可使果实着红色,红皮梨色泽鲜艳,受到消费者及育种家的青睐,具有较高的商品价值。植物中b HLH是参与调控花青苷合成的转录因子,b HLH能够单独或与其它结构基因、调节基因作用进而促进花青苷的积累。通过前期转录组测序发现,影响花青苷的b HLH转录因子中b HLH130在不同时期表达具有差异。本试验成功克隆了b HLH转录因子家族中b HLH130基因。结果表明,b HLH130基因其全长为1 305 bp,编码434个氨基酸,理论等电点(p I)为7.00,为不稳定蛋白,含有HLH结构域。系统发育树显示,Pbb HLH130基因与梨、苹果亲缘关系最近。本试验结果为今后探究并验证b HLH130与花青苷之间的联系提供数据参考。     

苦荞漆酶基因的克隆与生物信息学分析

利用RT-PCR技术从苦荞中克隆出2条漆酶（laccase）基因,运用生物信息学技术对2个基因序列进行分析,预测结构域、二级和三级蛋白结构,进行蛋白同源比对及进化树分析。结果表明,FtLAC-1基因序列开放阅读框为1695bp,编码564个氨基酸,FtLAC-2基因序列开放阅读框为1707bp,编码568个氨基酸。FtLAC-1和FtLAC-2蛋白预测分子量分别为61.41和62.47kDa,理论等电点分别为9.45和9.41,为亲水性蛋白,2个基因序列相似性较低,氨基酸序列同源性不高。qRT-PCR分析出其在苦荞不同组织器官存在差异性表达。结论为进一步探索FtLAC-1和FtLAC-2在苦荞薄果壳形成中的功能提供理论基础。     

梨几丁质酶基因克隆及其生物信息学分析

对克隆获得的梨几丁质酶基因Lchi1进行生物信息学分析,从而为该基因的功能鉴定提供理论基础,以期为梨的抗病育种提供基因来源。根据Genbank中已克隆得到的几丁质酶基因保守区,在梨基因组数据库中进行Blast比对,调取DNA序列,从而设计引物,以高抗腐烂病品种‘小香水’(Pyrus ussuriensis cv. Xiaoxiangshui)为研究材料,克隆获得梨几丁质酶Lchi1基因cDNA全长,并对其进行初步的生物信息学分析。梨基因组数据库中调取的DNA序列2535 bp,含有3个外显子区、2个内含子区。Lchi1基因全长1300 bp,编码322个氨基酸,其蛋白的分子式为C1607H2407N415O468S17,分子量为35573.3 Da,理论等电点为7.10。二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,三级结构具有高度保守性。Lchi1编码蛋白为可溶性胞外蛋白,存在少量的潜在磷酸化位点,属于糖苷水解酶19家族,含有N-端信号肽,但是缺乏几丁质结合区。Lchi1基因属于CLASSⅡ几丁质酶基因,与其它科属植物的几丁质酶基因相似性均较高。     

Maturity and cooling rate affects browning,polyphenol oxidase activity and gene expression of ‘Yali’ pears during storage

Browning is the main physiological disorder of ‘Yali’ pear (Pyrus bretschneideri Rehd) during storage. In this study, the relationships between browning development in fruit from different harvest dates, and cooled either rapidly or slowly, with polyphenol oxidase (PPO) activity and isozymes, and PPO gene expression has been investigated. Development of browning was highest in late-harvest fruit in both core and flesh tissues and was higher in rapidly cooled than slowly cooled fruit. Mid-harvest fruit had the lowest browning incidence and PPO activity of core tissue was higher than in flesh and seeds, while the peak of PPO activity in mid-harvest fruit was the lowest. Six PPO isoenzymes were detected in fruit, three bands A, B and E in flesh and core tissues, three bands C, D and F in the seeds. The intensity of PPO isoenzyme staining of bands A and B in pulp and core was similar to that of PPO activity and browning incidence. PPO gene expression increased and then decreased in core tissues. Trends of expression were similar to those of PPO activity. Rapid cooling promoted the expression PPO. The results suggest PPO plays an important role in ‘Yali’ pear browning during storage.     

鸭梨苹果茎痘病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达

为了进一步明确苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)的分子变异及株系分化,制备相应特异性抗血清.本研究以库尔勒地区种植的感染ASPV的鸭梨(Y)枝条韧皮部为试材,采用RT-PCR技术扩增ASPV CP基因,克隆、测序,获得了鸭梨分离物外壳蛋白(ASVP CP-Y)基因,将该CP基因连...     

不同果皮颜色酿酒葡萄品种果实不同部位酚类物质含量比较及抗氧化能力分析

为筛选出酚类物质含量高且具有较高抗氧化活性的酿酒葡萄种质资源,分别以4个红色和4个白色酿酒葡萄成熟果实为材料,比色法测定果皮、果肉和种子中的总酚、单宁、总类黄酮、原花色素和黄烷醇含量,以总还原力、DPPH自由基、ABTS⁺·自由基清除能力评价其抗氧化能力。结果表明,各品种果皮、果肉和种子中各酚类物质含量具有明显差异,但均以果肉中含量最低。红色品种果皮和种子中酚类物质含量均高于白色品种（‘小白玫瑰455’除外）,其中以‘黑比诺667’中总酚、单宁和总类黄酮含量最高,而果皮原花色素和黄烷醇含量以‘蛇龙珠’最高,种子原花色素含量以‘法国蓝’最高。白色品种中,‘小芒森’果皮各酚类物质含量均最低,而种子中含量以‘小白玫瑰455’最高。各葡萄品种果皮和种子的抗氧化能力和其总酚、单宁、总类黄酮、原花色素和黄烷醇含量之间均为显著正相关,相关系数在0.8383~0.9983,而果肉中的相关性较弱。选用的3种方法对葡萄果实抗氧化活性进行评价时,测定结果在不同方法间存在协同性与差异性。     

黄瓜ζ-胡萝卜素脱氢酶基因克隆及表达分析

以西双版纳黄瓜为试材,从黄瓜果肉中克隆ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的cDNA序列,命名为CsZds。获得目的片段长度为1805bp,该序列具有完整的开放阅读框,位于31~1761bp,编码576个氨基酸。序列比对分析结果显示,该蛋白在氨基端变化十分明显,中部较为保守,存在一个特征序列。系统进化分析表明,推测的CsZDS蛋白与南瓜中ZDS蛋白同源性最高,达到91.84%。利用实时荧光定量PCR技术分析结果显示,随着果实成熟期的延长,西双版纳黄瓜CsZds基因的表达量呈明显上升的趋势,在转色期达到最大。在果实发育过程中,西双版纳黄瓜CsZds基因的表达量高于普通黄瓜。     

干旱胁迫下枇杷叶片的转录组分析

分析干旱胁迫下枇杷叶片的转录组,挖掘功能基因并对其差异表达基因进行筛选和分析,为枇杷抗旱提供理论依据。利用新一代高通量测序技术测序,对测序结果进行de novo拼接、功能注释和ORF预测,将差异表达基因在COG、GO和KEGG数据库中进行比对注释。测序结果表明,获得转录本共88 530个,平均长度为740.64 bp,ORF41 748条。COG、GO和KEGG数据库将转录本分别划分为24,54个功能类别及291条代谢通路中。25 197个差异表达的基因在30条代谢通路中显著富集,与酶活性、激素合成代谢和信号转导等相关的差异基因积极响应枇杷干旱,其中双萜类、油菜素类固醇和类胡萝卜素3条生物合成途径中的差异基因呈现出较为一致的表达。采用实时荧光定量(qRT-RCR)对选取的差异基因进行验证,其中过氧化物酶、蛋白激酶byr2、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶、脱落酸8'-羟化酶、吲哚-3-乙酰乙酸合酶相关基因上调表达,细胞色素P450 734A1基因下调表达。为枇杷提供了较为全面的基因信息和代谢途径数据,为干旱胁迫下枇杷分子调控机制的深入研究奠定了基础。     

荸荠查尔酮异构酶基因的克隆与表达分析

查尔酮异构酶(CHI)是植物黄酮合成途径的关键酶,为了研究鲜切荸荠贮藏过程中表面黄化的机理,利用RACE技术对荸荠CHI基因编码区cDNA全长进行克隆,并分析其在不同组织和鲜切荸荠贮藏过程中的表达。结果表明,荸荠CHI基因(CwCHI)cDNA序列长度为1 003 bp(GeneBank:MG719238),含有一个744 bp的最大开放阅读框,其DNA包含3个内含子和4个外显子。Cw CHI可编码247个氨基酸,经预测其分子量为26.410 kD,理论等电点为4.89。Cw CHI蛋白的二级结构以α-螺旋为主,占38.06%。通过多重比对发现,CwCHI具有该家族特有的保守结构域,决定底物偏好性的第201位氨基酸为Ser,与其他Ⅰ型CHI蛋白相同。系统进化分析表明CwCHI与油棕榈和菠萝的CHI蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明,CwCHI基因在荸荠皮中的表达量最高,而在荸荠肉中的表达最低。鲜切荸荠黄化过程中CHI活性和CwCHI表达量快速上升,水杨酸处理抑制了CHI活性的上升和CwCHI的表达。     

海岛棉GbMFT1基因的克隆及表达分析

通过RT-PCR和RACE技术,从新疆海岛棉品种新海14中克隆得到了一个MFT (MOTHER OF FT AND TFL1)类似基因,命名为GbMFT1基因(GenBank登录号为KC513744)。GbMFT1基因的开放阅读框(ORF)为528 bp,编码175个氨基酸的蛋白,含一个磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)结构域。GbMFT1蛋白的羧基端含有MFT蛋白都含有的脯氨酸。系统进化树分析表明GbMFT1编码产物与葡萄、番茄亲缘关系较近,属于同一进化分枝。实时荧光定量PCR分析表明,GbMFT1基因在棉花的不同组织中均有表达,在花瓣中的表达量较高;在纤维发育的不同时期中均有表达,在开花后2 d的胚珠、9 d的纤维中表达量最高。半定量RT-PCR结果表明,GbMFT1基因在刚萌发的种子中表达量高,用不同浓度的ABA处理种子后其表达变化不明显,表明GbMFT1基因的表达不受ABA的调节。