GbTCP10基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

TCP转录因子广泛参与植物细胞生长和增殖调控,本研究构建海岛棉GbTCP10基因沉默和过量表达植物表达载体。以GbTCP10基因pGEM-T Easy-GbTCP10质粒为模板进行PCR扩增,连接至植物表达载体pCAMBIA3301中,再利用冻融法和热激法转到农杆菌GV3101菌株中,通过农杆菌浸染法转化拟南芥植株,初步证明已获得海岛棉GbTCP10基因的拟南芥。利用重叠PCR方法替换拟南芥At-MIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiRTCP10前体的植物表达载体amiRTCP10-pCAMBIA3301,本试验结果有助于进一步研究海岛棉GbTCP10基因的生物学功能和棉花纤维发育机制。     

蒺藜苜蓿CIM基因的克隆及转化

CIM (Cytokinin induced massage)是expansin-B2家族的基因，该基因的主要功能是影响植物细胞壁的松弛程度，从而影响植被由幼苗长成成熟植株的过程以及对各种环境胁迫的抵抗。本研究选取蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)品种R108作为试验材料，采用PCR技术克隆出CIM基因。CIM基因的长度为828 bp，能够编码275个氨基酸。生物信息学分析显示：与蒺藜苜蓿CIM基因表达的expansin蛋白亲缘性相近的是鹰嘴豆(Cicer arietinum) expansin-B2蛋白。利用DNA重组技术构建植物表达载体35Spro::CIM，然后通过农杆菌侵染的方法将35Spro::CIM整合到紫花苜蓿叶片的基因组中，经过一段时间的组织培养，最终成功获得了20株转基因植物。本试验为以后探究CIM基因对植物发育进程的作用给出了数据参考和试验材料。     

拟南芥DUF647家族成员RUS4植物表达载体的构建及亚细胞定位

ROOT UV-B SENSITIVE4 (RUS4)是拟南芥DUF647蛋白家族的一个功能未知的成员。RUS1和RUS2曾经报道和根UV-B-感应途径相关联,并在拟南芥早期幼苗形态发生和发育中发挥重要作用。为了探究RUS4的分子功能,本研究对RUS4蛋白进行了亚细胞定位分析。首先,我们通过Gateway TOPO载体系统,构建了融合蛋白表达载体pMDC83-RUS4;然后,通过农杆菌介导的花苞转化法,获得了转化pMDC83-RUS4的转基因拟南芥株系;对转基因植物叶肉原生质体的荧光显微镜观察显示,RUS4-GFP信号与叶绿体的自发荧光共定位,说明RUS4蛋白定位叶绿体中。该结果为进一步研究RUS4的分子功能奠定了良好的基础。     

拟南芥AtCYS6基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为了筛选与拟南芥半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因AtCYS6相互作用的蛋白,构建其酵母双杂交诱饵表达载体。本研究利用PCR方法扩增得到拟南芥AtCYS6的基因片段,与诱饵载体pGBKT7连接构建诱饵表达载体,经双酶切以及测序检测验证重组载体构建成功后,通过醋酸锂法将诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6与空载体pGBKT7分别转化到Y2HGold酵母菌株,检测其是否有自激活能力以及对宿主酵母菌株是否有毒性作用。结果表明:经PCR扩增后得到了AtCYS6基因,成功构建了无自激活和没有毒性的诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6。本研究结果可进一步为筛选与AtCYS6相互作用的蛋白质及功能研究提供科学依据。     

基于Gateway技术的拟南芥雄性不育GHF 基因表达载体的构建

随着模式植物拟南芥全基因组测序工作的完成更多雄性不育相关基因功能需要阐明。利用拟南芥突变体库,从反向遗传学角度进行突变基因的功能研究需要构建相应的载体进行互补实验。Gateway技术是一种高效,快速的克隆系统。笔者利用Gateway克隆技术成功构建拟南芥GHF基因表达载体,并遗传转化拟南芥,为进一步阐明该基因功能奠定了基础。     

一个假定微管相关蛋白PEMAP1的克隆和亚细胞定位

微管骨架通过导向纤维素微纤丝的合成来影响细胞壁的结构,在植物生长发育和细胞形态建成过程中发挥着重要作用.微管相关蛋白(microtubule-associated protein,MAP)参与调节微管蛋白亚基的组装、微管的动态稳定以及周质微管的排列方式.因此,对微管相关蛋白的研究有助于更好地理解微管骨架的生物学功能.本...     

砂藓干旱胁迫相关转录因子基因RcTIFY1的克隆及表达分析

TIFY是植物特有的转录因子,可以调控植物分生组织的分裂,控制果实成熟度,也能提高植物抗旱性,并且减少机械损伤造成的伤害。本研究以砂藓(Racomitrium canescens)为材料,从砂藓干旱胁迫转录组数据库中筛选获得1个在干旱胁迫处理中具有显著差异表达的TIFY基因的m RNA序列,将该序列命名为RcTIFY1。我们对RcTIFY1基因全长CDS序列进行了克隆,并对RcTIFY1基因进行生物信息学分析,同时分析了砂藓在干旱和高温胁迫处理下RcTIFY1基因的表达变化。结果表明,该基因cDNA全长为1 326 bp,包含1 287 bp的开放阅读框,编码含有428个氨基酸残基的多肽片段。预测RcTIFY1基因编码的蛋白质有TIFY家族的保守结构域。预测RcTIFY蛋白质分子质量为46.14 kD,理论等电点为9.31,具有亲水性,不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。本研究可为进一步探索RcTIFY1基因在苔藓植物中的抗逆机制提供数据基础。     

DOF转录因子AtDof1.7 RNA干扰载体的构建及拟南芥的遗传转化

DOF (DNA binding with one finger)转录因子是植物特有的转录因子家族,含有一个独特的富含Cys残基的单锌指DNA结合区域,在植物生长发育中参与多种生物学过程。本研究根据拟南芥AtDof1.7基因(GenBank登录号为AT1G51700)序列设计含有不同酶切位点的特异性扩增引物,以拟南芥总DNA为模板,扩增AtDof1.7基因片段,将AtDof1.7基因正向反向分别插入表达载体的相应位置,构建成AtDof1.7基因的RNA干扰载体pADOF1。利用改良的floral-dip方法将干扰载体pADOF1成功转入野生型拟南芥,经草甘膦抗性筛选和PCR检测获得5株阳性转基因植株。利用RT-PCR技术和气相色谱法分别分析了AtDof1.7基因的表达和种子脂肪酸组成,结果表明5株转基因植株中AtDof1.7基因的表达量不同程度低于野生型植株,种子油酸含量明显上升,亚麻酸含量明显下降,说明AtDof1.7转录因子与拟南芥种子脂肪酸代谢途径有一定的关系,为进一步研究其在脂肪酸代谢过程中的调控作用以及在油菜中研究该类转录因子的功能奠定了基础。     

拟南芥芥子酶基因TGG4的克隆、表达和酶活性鉴定

芥子酶是一类水解硫代葡萄糖苷的酶,广泛存在于十字花科植物中。人们在拟南芥中已经发现了3个芥子酶基因,分别是TGG1、TGG2和TGG3。通过对拟南芥基因组数据库的搜索,发现3个新的芥子酶基因TGG4、TGG5和TGG6。本研究克隆了TGG4基因全长cDNA序列,构建酵母表达载体,转化毕氏酵母GS115,进行甲醇诱导表达,重组蛋白用离子交换层析柱纯化。纯化的重组蛋白经测定具有芥子酶活性,而且其活性被低浓度的维生素C激活,具有芥子酶的典型特征。芥子酶系统发生树分析进一步表明,TGG4代表一个芥子酶基因新亚家族。     

番茄NAC转录因子SlNAC80的克隆及表达分析

为进一步明确该基因的分子特征及表达特性,通过RT-PCR从番茄中克隆了低温响应NAC转录因子SlNAC80,该基因开放阅读框1 023 bp,编码340个氨基酸。Sl NAC80蛋白相对分子量为38.19 k Da,等电点为5.27,N-端具有典型的NAC保守结构域,包含A、B、C、D、E 5个亚结构域。实时荧光定量PCR(q PCR)分析表明,Sl NAC80在番茄各组织中均有表达,以在绿果和衰老叶中的表达量最高,在红熟果中的表达量最低。对启动子区序列进行预测分析发现,Sl NAC80启动子区含有许多响应激素(ABA、GA、SA及ETH)和逆境(低温、脱水及盐胁迫)的顺式作用元件,如ERELEE4、GARE1OSREP1、LTRE1HVBLT49、GT1GMSCAM4、MYB1AT、MYCATERD1、MYCATRD22、WBOXNTERF3及WRKY71OS等。q PCR分析结果也证实该基因的表达受低温、干旱、高盐、甲基紫精、ABA及乙烯处理诱导。这些结果表明,Sl NAC80可能在番茄非生物逆境应答中发挥重要调控作用。     

大白菜低温胁迫转录因子BcICE1的克隆及表达分析

本研究采用RT-PCR结合SON-PCR技术从大白菜(Brassica pekinens)中分离了BcICE1基因的cDNA序列(GenBank登录号为HQ902162).该基因全长1 591 by,含有一个1494 by长的开放阅读框,编码497个氨基酸.序列比对表明,该蛋白C端含有一个典型的bHLH结构域,与其他植...     

转梭梭HaPrxQ基因拟南芥植株的获得与检测

HaPrxQ是参与活性氧清除的重要基因。根据已发表的过氧还蛋白基因序列,设计特异引物,扩增到完整的HaPrxQ基因;构建植物表达载体pCAMBIA2300-HaPrxQ,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转化植株种子。对收获的T0代种子进行卡那霉素抗性筛选,并通过PCR对抗性苗进行检测。结果表明,构建的载体成功转化拟南芥并获得了9份转HaPrxQ基因苗。     

拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建

BRs(Brassinosteroids)是植物体内一种重要的类固醇激素,具有十分重要的生理功能.DWF 4是BRs生物合成的关键限速酶,显著影响BRs在植物体中的含量.本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料,利用同源克隆技术从A.thaliana cDNA中克隆到全长为1542 bp的特异性...     

拟南芥DREB2A基因的克隆及植物荧光表达载体的构建

以拟南芥幼苗总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增到DREB2A基因,并将其克隆到植物表达载体pCAM-BIA1304中CaMV 35 S启动子与poly(A)终止子之间。酶切鉴定及测序列结果都表明,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1304-DREB2A。另外,获得了携带DREB2A基因的根瘤农杆菌菌株,为以后转基因植物工作奠定了基础。     

拟南芥植物型PEPC基因人工小RNA表达载体的构建与遗传转化

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）是植物中具有多种生理功能的酶。为探索拟南芥中植物型PEPC基因对模式植物拟南芥脂肪酸含量以及抗逆性等方面的影响,本文构建了同时敲除拟南芥Atppc1、Atppc2和Atppc3基因的人工小RNA（amiRNA）植物表达载体pFGC-amiAtppc123,经根癌农杆菌EHA105介导,用花序浸染法转化拟南芥,成功获得转基因植株。RT-PCR半定量分析表明人工小RNA在转化植株中成功进行了超量表达。该试验为分析拟南芥脂肪酸含量以及抗逆性方面提供了基础材料。     

转录因子CBF4基因的克隆及其植物表达载体的构建

为应用转录因子CBF4基因对苜蓿进行抗逆性改良,试验利用聚合酶链式反应技术(PCR)从拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株中克隆了CBF4基因,与GenBank中基因序列同源性可达99.41%,并将该基因连接到植物表达载体PBI121中,成功构建了适于苜蓿农杆菌遗传转化的植物表达载体,为下一步利用CBF4基因快速培育耐逆性强的苜蓿新品种奠定了基础.