芒果CHS基因的克隆及其表达分析

为了研究芒果CHS基因的功能及其在果实着色中的分子机理,以芒果果实的c DNA和DNA为模板,采用同源克隆的方法克隆得到了一个CHS基因,该基因的开放阅读框1 194 bp,编码397个氨基酸,等电点为6.03,分子重量为43.29 k Da。基因组扩增得到了1 315 bp的片段,通过序列比对发现该基因含有1个内含子,对其在幼嫩叶片和成熟叶片中的表达进行分析,发现该基因在不同时期的叶片中都有表达,在红色幼嫩的叶片中表达量较高,成熟叶片中表达较低,初步推断该基因可能的叶片中黄酮类物质合成有密切的关系。通过聚类分析发现该基因编码的蛋白与兜兰、白芨等的CHS蛋白序列亲缘关系较近,可以与白芨、问荆草、甘蓝等聚为一类。     

芒果GGPPS基因的克隆与表达分析

在植物中,异戊烯焦磷酸(GGPP)是赤霉素、胡萝卜素、叶绿素等异戊二烯类化合物的公共前体物质。从芒果栽培品种贵妃芒的新鲜叶片中提取DNA和RNA,根据转录组测序拼接结果设计引物扩增得到香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因(Min GGPPS1)。通过测序、多重比对和聚类分析,证实该片段属于GGPPS的全长基因并且为最大的ORF,全长为1 100 bp。与芒果Min GPS2(AFJ52722.1)氨基酸序列同源性为92%。蛋白质序列分析表明该序列含有两个DDx_(2-4)D保守基元(FARM和SARM)基元和一个Cxxx C基元。我们选取了拟南芥中12个GGPPS基因、2个FPPS基因、2个SPPS基因、一个GPS基因及其他物种的相关基因,通过聚类分析表明,Min GGPPS1属于香叶基香叶基焦磷酸合成酶大亚基。表达分析表明:Min GGPPS1在叶片中表达量最高,茎部表达量最低,青果果皮和成熟果果皮中表达量相似,在成熟果肉中的表达量大约是青果果肉表达量的5倍,暗示Min GGPPS1具有调控果肉后熟的功能。     

芒果4CL基因的克隆及其表达分析

4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)是植物类黄酮类化合物和木质素等生物合成途径的一种关键酶,为了研究其在芒果果实中的作用机理,采用RACE方法,从芒果果实克隆得到了一个类黄酮合成相关的4CL基因。该基因全长c DNA序列为1 740 bp,开放阅读框为1 653 bp,编码550个氨基酸,分子量为60.47 k Da,等电点为9.51。对基因组扩增得到了2 318 bp长度的片段分析发现,该基因含有5个内含子,分别在1 013~1 139 bp,1 330~1 415 bp,1 564~1 653 bp,1 722~1 802 bp,1 905~2 000 bp。通过在线软件对其二级结构和三级结构进行了预测,系统发育分析发现该基因编码的蛋白与水曲柳、菘蓝等植物具有较近的亲缘关系。对3种不同着色的芒果品种中的4CL基因的RTPCR进行分析发现:红色的贵妃品种中表达量较高,而绿色的桂七品种中表达量较低。研究表明4CL基因表达芒果果实着色具有密切的相关性。     

春兰AGAMOUS同源基因的克隆及表达分析

为深入探索春兰(Cymbidium goeringii)中C类MADS-box基因参与春兰花器官发育调控的分子机理,用同源克隆的方法从春兰花芽中分离出两个C类MADS-box基因CygoAG1与CygoAG2。在分析其序列结构的基础上,分别检测2者在春兰不同花器官中的表达差异。序列结构分析表明:CygoAG1序列全长为831bp,包含702 bp完整开放阅读框(open reading frame, ORF),编码233个氨基酸和1个终止密码子;CygoAG2基因cDNA序列全长996 bp,包含705 bp完整开放阅读框,编码234个氨基酸和1个终止密码子,2个基因编码的转录因子均包含保守的MADS、K-box结构域和AG基序。分子系统发生与进化树重建结果显示:春兰CygoAG1与CygoAG2与拟南芥MADS-box基因家族中AG (AGAMOUS)基因的同源性最高。实时荧光定量分析结果表明,春兰CygoAG1基因只在花粉团、合蕊柱和子房中表达,在其它花器官及营养器官叶片中不表达,其在子房中的表达量最高。CygoAG2基因在春兰的花器官如萼片、花瓣、唇瓣、花粉团、合蕊柱和子房中均有表达,但在营养器官叶片中不表达,其在合蕊柱(雌雄蕊合生结构)中的表达量最高。CygoAG1和CygoAG2基因在春兰花器官中的表达模式呈现一定的差异。     

柚FIE同源基因的克隆及表达分析

FIE基因在受精前抑制胚乳发育并在受精后通过特异位点阻碍胚发育相关基因的转录。在拟南芥中,FIE突变最终导致种子败育。本研究从马家柚中克隆到1个FIE同源基因,开放阅读框(ORF)长为1 110 bp,编码369个氨基酸,命名为CmFIE (GenBank:IDMG680456),包含一个保守的WD40 motif结构域。推测其蛋白分子质量为41.443 3 k D,等电点为6.02,属于不稳定亲水性蛋白,并以折叠结构和环状结构为主。系统进化树分析表明,与甜橙(Citrus sinensis) CsFIE亲缘关系最近。qRT-PCR分析显示,CmFIE基因在马家柚种子和幼苗根、茎、叶中均有表达,但在种子中的表达量相对更高。CmFIE在正常种子中的发育过程持续表达,并在授粉后4～7周(胚乳细胞化之前和开始时)表达量下降,另外胚乳退化型败育种子中CmFIE表达水平被发现从授粉2周后开始一直高于正常种子。结果表明CmFIE对种子发育起到重要的调控作用,这与模式植物拟南芥FIE基因的功能一致。通过探究柚FIE基因生物信息学特性及在种子中的表达情况,可以为FIE基因在种子发育过程中的功能研究提供理论基础。     

芒果GGPPS小亚基基因的克隆、进化和表达分析

香叶基焦磷酸(GPP)是香味成分单萜的前体物质,而香味是芒果重要的品质性状。本研究克隆了芒果中GPP合成关键酶基因,即香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基基因(MinGGPPSssu),并开展了系统进化分析和表达分析。从芒果栽培品种贵妃芒的新鲜叶片中提取DNA和RNA,根据转录组测序拼接结果设计引物扩增得到Min GGPPSssu全长约1 kb的c DNA序列。通过测序、多重比对和聚类分析,证实该片段属于GGPPSssu的全长基因,且为最大的ORF。与近缘物种苦楝GGPPS1(KM108317)氨基酸序列同源性为83%。蛋白质序列分析表明该序列含有1个DDx_(2-4)D保守基元和一个Cxxx C基元。我们选取了拟南芥中12个GGPPS基因、2个FPPS基因、2个SPPS基因、一个GPS基因及其他物种的相关基因,通过聚类分析,将Min GGPPSssu聚类到香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基所属的枝。表达分析表明,该基因在叶片中表达量最高,茎部表达量较低。果皮和果肉在芒果成熟前后表达量相似,但是在果皮中的表达量约为果肉表达量的3倍,推测其与果皮及叶片香味调控相关。     

蜻蜓凤梨FLD同源基因的克隆及表达分析

FLOWERING LOCUS D(FLD)是植物自主开花途径花发育基因,在植物营养生长向生殖生长转变的过程中起重要的调控作用。本研究利用同源基因克隆法结合RACE技术克隆了蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata)花发育基因FLD的类似基因AfFLD。序列分析比对表明,AfFLD所推测的氨基酸序列包含有LSD1-LIKE亚家族两个高度保守的结构域:SWIRM结构域和胺氧化酶结构域,该蛋白与玉米、拟南芥的FLD蛋白的同源性分别为72%和73%。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了乙烯处理不同时间FLD基因的表达模式,结果表明乙烯处理不同时间的各组中,处理后1d时FLD的表达量达到最高值,其中表达量最高为0h的2.5倍。本结果为开花自主途径中相关基因对乙烯处理后的响应机理的研究提供理论基础。     

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因(EU957447.1,2247 bp)核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长c DNA序列(Gen Bank登录号为KM114052)。序列分析结果表明,甘蔗Sc CIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,91~1631 bp),编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域(Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、Na Cl、ABA、SA和Me JA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。     

玉米中QM同源基因的克隆及其差异表达分析

利用cDNA-AFLP技术和5'' RACE技术在玉米自交系黄早四Ht2上分离并克隆了QM（编码核糖体蛋白L10）同源基因(命名为ZmQM)。其cDNA全长为967 bp, 开放阅读框为738 bp,。该基因编码245个氨基酸的ZmQM蛋白,分子量为27.78 kD, 等电点(pI)为10.69, 预测含蛋白酶C磷酸化位点、N-酰基化位点和酰胺化等位点。玉米ZmQM蛋白与包括人类等l3个物种QM蛋白的同源性比较发现, 氨基酸序列相似性为66%~92%。RT-PCR分析表明, 在接种玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum) 1号小种12 h后, 黄早四Ht2中ZmQM基因表达量较黄早四中明显上调,推测ZmQM基因可能参与黄早四Ht2对玉米大斑病菌1号小种的抗性反应。     

陆地棉两个同源基因GhBlind的克隆与表达分析

Blind同源基因对植物株型调控起着重要作用。本研究用同源克隆策略,在陆地棉(Gossypium hirsutum L.) 腋芽部位cDNA中克隆出2个Blind同源基因GhBlind1(GenBank登录号为HQ115643)和GhBlind2(登录号为HQ115644)。GhBlind1和GhBlind2由3个外显子和2个内含子组成,分别编码359个和262个氨基酸残基。组织特异性表达分析表明, GhBlind1在腋芽部位和茎尖分生组织部位优势表达,在根、叶、茎尖、幼嫩纤维表达,而在茎部不表达;GhBlind2在腋芽部位以及根、茎、叶片、茎尖表达,而在纤维不表达。通过重组PCR技术,构建表达载体Psuper-gus-b1和Psuper-gus-b2;应用根癌农杆菌EHA105介导转化棉花胚性愈伤组织进行瞬时表达分析。将棉花胚性愈伤组织共培养4 d后,2个表达载体转化的胚性愈伤组织中均能检测到GUS活性,但Psuper-gus-b2表达活性强于Psuper-gus-b1。对Blind同源蛋白的保守结构域比对发现,GhBlind1和GhBlind2与Blind同源蛋白的一致性分别达94%和91%。以Blind同源蛋白作为外参,结合NCBI已公开的23个棉花MYB蛋白构建系统发生树,发现GhBlind1和GhBlind2与棉花大多数MYB蛋白遗传距离较远,和Blind同源蛋白组成一个较小的分支。     

芸芥中DnaJ同源基因的克隆与表达分析

为研究芸芥自交亲和机理,采用mRNA差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)分析技术,从芸芥自交亲和系开花前柱头中获得1条差异片段。测序及DNA序列的生物信息学分析表明,该差异片段与拟南芥DnaJ蛋白同源基因At J3有较高同源性,暂命名为esAtJ3基因。该序列含有一个长度为297 bp的完整开放阅读框,编码98个氨基酸残基,含有一个DnaJ-C保守结构域,属于植物DnaJ超家族。esAtJ3基因编码的蛋白无信号肽,是一个亲水性蛋白,该蛋白主要由不规则卷曲和α螺旋组成。实时荧光定量PCR分析表明,esAtJ3基因在芸芥SC系开花前柱头中表达量较高,初步推测该基因可能参与芸芥亲和性调控。     

草莓CO同源基因FaCO-2的克隆及表达分析

以草莓(Fragaria×ananassa Duch.)品种花姬为试材,通过PCR和RT-PCR方法克隆出草莓CO同源基因FaCO-2的CDS和DNA全长序列,在此基础上通过实时定量PCR的方法检测了其在草莓植株各组织和花器官中的表达。结果表明,该基因DNA序列长度为1 882 bp,含1个内含子,其CDS长度为1 146 bp,编码382个氨基酸,与其他物种的CO同源基因氨基酸序列有较高的同源性,生物信息学分析表明该蛋白分子量为42 021.69 D,等电点pI=5.49。实时定量RT-PCR结果表明,在不同的组织、花器官中,FaC0-2的表达量存在差异,在充分展开的较大叶片中的表达量最高;在4轮花器官中,只在萼片中表达,而其他花器官中不表达。     

羊草脂氧合酶同源蛋白基因LcLHP的克隆与表达分析

为验证羊草脂氧合酶同源蛋白基因Lc LHP与盐胁迫的关系,利用RACE(Rapid amplification of c DNA ends)克隆技术从羊草中克隆得到抗盐碱相关基因脂氧合酶同源蛋白基因(LHP,Lipoxygenase homology protein)的c DNA全长序列,其Gen Bank登录号为KJ472894。Lc LHP基因开放阅读框为537 bp,编码178个氨基酸。Lc LHP中含有PLAT/LH2结构域,该结构域蛋白家族的许多成员受胁迫诱导。同源性分析显示,Lc LHP与互花米草PLAT/LH2家族蛋白脂氧合酶、PLAT植物胁迫结构域包含蛋白等同源性较高,蛋白功能预测显示其N端可能存在信号肽并可能具有酶功能。RT-PCR分析显示,在一定盐碱胁迫条件下,随着处理试剂Na2CO3溶液处理时间的延长,LHP基因在羊草中的表达量呈单峰趋势,在12 h时达到峰值;构建重组表达载体p GEX-Lc LHP并进行IPTG原核诱导表达培养,获得了GSTLc LHP融合蛋白并用GST抗体进行Western Blot试验得到验证。     

芒果 CCR 基因的克隆及其序列分析

为了研究芒果CCR基因在芒果对芒果树抗性的功能。采用传统的RT-PCR和RACE方法从芒果的枝梢中克隆得到了1个参与木质素生物合成的肉桂酰辅酶-A还原酶基因（ CCR）的全长cDNA序列,进而对得到的序列采用TMHMM、DNAMAN等软件进行生物信息学分析,发现芒果CCR基因包含编码区、3′和5′非翻译区的长度为1292 bp的cDNA序列,编码305个氨基酸;对跨膜结构域进行了预测,发现该基因无跨膜结构域;蛋白二级结构元件以无规则卷曲和β-螺旋为主;聚类分析发现,该基因与美洲山杨木、油茶等植物的亲缘关系较近,而与百合、橡胶树等亲缘关系较远。从芒果中克隆得到了一个CCR基因,并对其生物信息学进行了分析,为后续转基因工作打下了基础。     

芒果 ANS 基因的克隆及其序列分析

为了研究芒果果实中ANS基因的功能。利用同源克隆方法从芒果果实中克隆得到了一个ANS基因,该基因的cDNA长度为1252 bp,开放阅读框的长度为1056 bp,编码351个氨基酸。通过系统发育分析,发现该基因编码的蛋白与荔枝、葡萄、可可豆、桑树等聚在一类。通过序列对比分析表明,已经成功得到芒果ANS基因,并对其生物信息进行了分析,为下一步芒果ANS基因的功能研究打下了基础。     

东方百合‘Seberia’AGAMOUS同源基因的克隆及表达分析

为了解决东方百合花型单一、花粉量大、污染花瓣影响美观以及引起部分人群花粉过敏等问题,本研究以东方百合‘Siberia’为材料,提取其雌蕊总RNA,通过RT-PCR方法克隆得到2个cDNA片段,其全长分别为795 bp和678 bp,分别编码264 aa和225 aa,GC含量分别为46.7%和43.2%,这两个基因片段与其他百合属AG基因同源性分别在85%和70%以上,且发现两个蛋白均属于碱性不稳定疏水蛋白。此外,2个基因均具有保守的MADS-box区、K区及典型的AGⅠ和AGⅡ区,进一步说明2个基因均属于MADS-box基因家族的AG基因(即C类基因)。通过基因表达分析再次证明上述两个基因仅在花的雄蕊及雌蕊中表达,并完全符合经典的花发育ABC模型理论。这2个AG基因在同一部位的不同发育阶段的表达特性存在显著差异,即存在一定的时空表达差异性。本研究结果为后期百合花发育、遗传转化及无花粉百合新品种培育等研究提供了一定的基础数据和科学依据。     

芒果MinSPS1基因的克隆及表达载体的构建

蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)既是调控蔗糖合成的关键酶又是限速酶,为了研究其在芒果果实中蔗糖合成的作用机理,本研究从芒果果肉中克隆得到一个与蔗糖合成相关的基因,将其命名为MinSPS1,其cDNA全长序列为3 344 bp,开放阅读框为3 168 bp,编码1 055个氨基酸,蛋白质分子量为118.13 k D,等电点为6.08,对MinSPS1基因编码的蛋白进行系统发育分析,发现其与柑橘具有较近的亲缘关系。采用qRT-PCR对该基因在后熟处理的贵妃芒果肉中的表达量进行分析,结果显示在完熟期贵妃芒果肉中表达量较高,而在青熟期表达量较低。本研究为深入了解芒果蔗糖合成的分子机理,进一步构建了p CAMBIA1301-MiSPS1过表达载体,为MinSPS1的功能鉴定提供理论依据。     

香蕉MaCSase基因的克隆和表达分析

旨在克隆香蕉(Musa acuminata L. AAA group cv. Brazilian)半胱氨酸合成酶(cysteine synthase, CSase)基因,并进行序列特征、器官表达特异性和逆境胁迫下表达特性分析。通过对香蕉根的cDNA文库的测序和分析,获得了一段香蕉半胱氨酸合成酶基因的片段,运用RACE扩增技术获得基因全长,命名为MaCSase,并进行序列分析,最后利用荧光定量PCR技术分析该基因在香蕉不同器官中的表达特异性及在外源胁迫下的表达特性。序列分析显示,该基因全长1367 bp,存在1个完整的开放阅读框1065 bp,编码355个氨基酸。通过和已知植物的半胱氨酸合成酶基因相比,同源性达到79%以上。其中与水稻、苜蓿、葱、玉米的CSase编码的氨基酸序列的同源性分别为86%、85%、84%、84%,器官特异性分析表明,MaCSase在香蕉的根、球茎、叶片、花和果实中均有所表达,其中在球茎中表达量最高。通过对其在高盐胁迫下的表达分析显示,该基因在香蕉根中的表达随着处理时间的增加呈现上升趋势,在胁迫6 h时被大量诱导。