基于CRISPR/Cas9技术创制宜直播香型水稻

水稻香味可显著改善稻米品质,香稻相较于普通稻米更易获得消费者青睐。为快速创制宜直播香型水稻新种质,探索提高豫南地区籼稻稻米品质新途径。本研究以宜直播籼稻品系‘直优151’和粳稻模式品种‘日本晴’为试验材料,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在水稻香味基因Badh2第2和7外显子处分别设计靶序列,构建pC1300-Cas9-E2单敲除表达载体和pC1300-Cas9-E2-E7双敲除表达载体,并分别转化‘直优151’和‘日本晴’。经筛选鉴定共获得21株‘直优151’突变株系和32株‘日本晴’突变株系,包括纯合突变、双等位突变和杂合突变类型。与野生型相比,突变体株系的株高、有效穗数、每穗总粒数、结实率和千粒重均未发生显著变化。使用气相色谱质谱法测定突变株系稻米中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量,结果表明,与野生型相比各突变株系2-AP含量均极显著提高。本研究基于CRISPR/Cas9技术成功对水稻香味基因Badh2进行靶向编辑,快速创制了宜直播种植的香型‘直优151’突变株系,为豫南稻区直播籼稻提供了优质香型新种质。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑Badh2基因改良粳稻香味

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为水稻育种新型手段,香稻育种一直是水稻育种行业的研究热点,水稻香味主要由8号染色体上的甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制。为了改良原有品种的香味性状,促进香稻育种的发展,以非香型粳稻品种东农425为试验材料,构建了2个CRISPR/Cas9敲除载体对Badh2基因进行定点编辑,第1个载体(p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA)的2个靶点分别位于第2和第3外显子上,第2个载体(p YLCRISPR/Cas9-B2-gRNA)的2个靶点均在第2外显子上。采用农杆菌介导法对东农425进行遗传转化,成功获得了T0纯合植株,并对其衍生出的T1植株进行T-DNA元件检测,共获得8个突变类型不同且不含有转基因成分的纯合突变株系。同时采用咀嚼法和氢氧化钾浸泡法对这8个纯合突变株系的水稻籽粒进行香味检测,结果表明,8个Badh2株系均具有不同程度的香味,总体上载体p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA编辑的3个株系的香味更为浓郁。对这8个纯合突变株系的主要农艺性状进行考察,发现突变株系的穗数、穗粒数、结实率及千粒质量与野生型相比均没有明显差异。综上,本研究对东农425的Badh2基因成功地进行了编辑,并获得了香味显著提高且无转基因成分的纯合突变体材料,为加快香型粳稻品种的培育提供了技术支持。     

利用CRISPR/CAS9基因编辑技术创制香型郑稻19新种质

有特殊香味的稻米深受我国消费者欢迎,是优质水稻的重要指标之一,本研究通过基因编辑创制香型优质水稻新种质。水稻中甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2是控制香味的关键基因,以适于直播品种郑稻19为供体材料,利用CRISPR/CAS9技术定点突变水稻Badh2基因。获得T0代转基因阳性植株11株,其中9株子粒有香味,检测6个香型T1株系靶点序列,6个株系均发生突变,发现7种突变类型,5种是缺失类型,2种插入类型,其中3个株系（T1-2、T1-3和T1-7）出现双等位突变。6个T1代株系共测序22个单株,检测到纯合突变10株;T2代检测28株,其中纯合突变21株。以潮霉素抗性基因引物检测T1-2、T1-6和T1-7株系后代单株载体脱落情况,T1代3个株系未获得无载体纯合突变单株,T2代中获得8株无载体纯合突变单株,来源于T1-2株系有3株,来源于T1-7株系5株。T0代9株香型单株子粒2-AP含量1.259±0.072μg/g,T1代8个突变株系2-AP含量0.537±0.111μg/g,均显著高于对照郑稻19。考察中选T1-2、T1-7株系的农艺性状,与郑稻19无显著差异。这些无载体突变单株可作为香型种质在种质创新和育种中应用。     

利用基因编辑技术培育糯性水稻

为建立糯稻品种培育新体系,本试验研究了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对Waxy(Wx)基因定向突变进而培育糯稻的效果。在Wx基因的第2、第7、第8、第10、第11和12外显子区域设计6个靶位点,构建CRISPR/Cas9基因编辑表达载体,采用农杆菌介导法将基因编辑载体转入粳稻品种哈勃601,获得11~88株转基因再生植株。突变分析表明,转基因株突变率总体偏低(0%~30.77%),仅在第2、第7和第11外显子上发生突变,以1~2 bp的插入缺失为主,都为纯合或双等位突变。5份纯合T2突变体的稻米呈蜡质状,直链淀粉含量为由亲本的15.5%降至2.0%~2.6%,接近或达到糯稻水平,其RVA谱与糯稻对照相仿,淀粉粘滞性较亲本哈勃601显著下降。上述结果表明,通过利用CRISPR/Cas9可对Wx基因进行定向突变从而获得糯性材料,但在利用该技术培育新品种时,需要选择适当的靶位点并培育较多的突变体,才能从中选到符合国家标准的糯稻品种。本研究对利用基因编辑技术培育水稻新品种提供了科学依据。     

氮磷处理对‘B优268’产量及直链淀粉含量的影响

伴随米粉专用型水稻品种的推广与应用,探索通过栽培措施(肥料调节)调节其稻米中直链淀粉含量,改善稻米品质,使之更加符合米粉加工要求具有重要意义。本研究选用高直链淀粉型米粉专用稻‘B优268’为材料,采用随机区组设计,研究不同氮磷水平对杂交水稻‘B优268’产量性状及直链淀粉含量的影响。结果表明氮及氮磷互作效应对‘B优268’的产量及籽粒直链淀粉含量影响显著。足够的分蘖数和有效穗数是保证‘B优268’高产稳产的基础。优化稻田氮磷调控有利于提高‘B优268’稻谷产量和直链淀粉含量,氮肥用量为300 kg/hm~2N、磷肥用量为120 kg/hm~2P_2O_5时,‘B优268’稻谷产量和直链淀粉含量都较大。     

利用CRISPR-Cas9技术编辑Badh2基因创制优质香型籼稻三系不育系

稻米香味是水稻的重要食味品质之一,其主要受第8染色体上编码甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制,该基因突变可导致香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量增加从而促进香味的产生。本研究以三明市农业科学研究院自主选育的优质籼型杂交稻保持系明太B为受体,利用CRISPR-Cas9技术对其Badh2基因进行编辑和敲除。获得2个T₀代转基因纯合突变体植株并对其衍生的48个T₁代单株进行鉴定和分析,获得1个不含转基因载体骨架且在第2外显子插入单个碱基T的纯合突变体株系明太B-badh2。利用半定量PCR和qRT-PCR技术以及气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测Badh2基因相对表达量和2-AP含量;同时采用农业行业标准(NY/T1433-2014)推荐的48对水稻SSR引物进行指纹图谱分析。结果表明,该株系Badh2基因RNA表达水平显著下调;籽粒中香味物质2-AP的含量显著增加;指纹图谱分析发现,仅1对引物Rm571在野生型和突变体之间鉴定到等位变异,两组材料遗传差异较小。此外,本研究还对野生型和突变体T₂代植株表型性状、稻米蒸...     

利用CRISPR/Cas9技术对水稻香味品质进行遗传改良

为了获得经济价值更高的香稻品种,利用成熟的CRISPR/Cas9技术,在水稻Badh2基因上设计sgRNA-E2和sgRNA-E3 2个靶位点,对超级稻品种龙粳31的香味品质进行改良,其中靶位点sgRNA-E2跨第2个内含子和第2个外显子,靶位点sgRNA-E3位于第3外显子区。经检测共获得有碱基突变的转基因植株6株,其中2个单株为纯合突变,4个单株为双等位突变。突变类型包括碱基缺失、插入及碱基变异,其中突变单株Badh2-E2-13有大片段缺失,为双等位突变,分别缺失64,108 bp。在转录水平上发现6个突变株系的Badh2基因表达量均比野生型显著降低(P0.05)。通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术检测T_0突变体种子的香味物质2AP含量,发现5个突变单株的2AP含量相对野生型显著提高(P0.05),2个突变单株达到阳性对照(信香粳1号)水平,其中1个相比阳性对照显著提高。通过对6个突变株系的T_1主要农艺性状的调查发现,3个株系在香味物质含量提高的同时主要农艺性状和野生型没有显著差异。进一步对T_1植株进行筛选,共获得了无转基因序列的突变单株10个。综上,利用CRISPR/Cas9技术成功对超级稻品种龙粳31的香味品质进行了遗传改良,实现了香味物质含量的显著提高,为香稻和超级稻的育种提供了基础材料。     

CRISPR-Cas9系统敲除亚麻FAD2基因表达载体的构建

CRISPR/Cas9系统是一种新型基因编辑工具,准确编辑目标基因,广泛应用于动植物的基因编辑中。本实验构建了油用亚麻品种‘陇亚10号’FAD2基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体,以CRISPR/Cas9基因编辑技术为切入点,根据Gene Bank中公布的FAD2基因序列(DQ222824.1)在FAD2基因外显子部分运用sg RNA在线设计软件CRISPR-P 2.0对亚麻FAD2基因做脱靶分析,在外显子区域选取2个片段作为靶序列进行敲除。以潮霉素作为筛选标记,采用Golden Gate cloning法构建针对‘陇亚10号’FAD2基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体,命名为p YLCRISPR/Cas9-FAD2。将pYLCRISPR/Cas9-FAD2载体导入农杆菌并检测其稳定性,保存菌种以便后期利用农杆菌介导法转化‘陇亚10号’,为深入研究亚麻FAD2基因的功能提供参考。     

香型优质杂交稻‘渝香203’香味基因遗传分析

香味是水稻重要的品质性状之一。‘渝香203’是不育系‘宜香1A’与恢复系‘R2103’杂交而成的香型优质品种,具有香味浓、米质优、适口性好等特点。本研究通过‘渝香203’及其亲本香味的遗传分析发现,该品种的香味由2对不等位的隐性基因控制,且其商品粮的稻米香味比例高于普通香型杂交稻;Badh2基因的功能标记鉴定及该基因测序分析显示,‘宜香1A’的香味由其Badh2基因第7外显子的碱基变异引起的,而‘R2103’的香味不是Badh2基因控制的。因此‘R2103’是一个新香型种质资源,对其深入研究可为完善水稻香味遗传机制、高品质新材料创建与品种选育提供参考。     

利用CRISPR/Cas9技术获得水稻恢复系Bsr-d1基因突变体

为研究水稻抗稻瘟病基因Bsr-d1在杂交水稻恢复系中的功能,我们利用CRISPR/Cas9定点基因编辑方法,设计2个敲除靶标位点,构建了Bsr-d1基因编辑载体,并通过农杆菌介导的方法转化水稻恢复系品种‘GH998’,成功获得了转基因植株,并在T1代筛选到4个无转基因成分的纯合突变株系。纯合突变株系有4种突变类型,包括第199号碱基处缺失17个碱基、第212号碱基处缺失4个碱基、第216号碱基处插入1个碱基、第216号碱基处插入2个碱基突变类型。通过蛋白序列分析,发现纯合突变株系都存在移码现象导致氨基酸变化并提前终止翻译。本研究成功利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除水稻恢复系‘GH998’中Bsr-d1基因,获得无转基因成分的纯合突变株系,为进一步研究Bsr-d1基因在杂交水稻上的功能提供了理论依据和品种资源。     

Wx蛋白缺失对水稻颖果和剑叶生理活性的影响

以转反义Wx基因粳稻和籼稻为材料的研究结果表明，直链淀粉含量降低后的转基因水稻颖果的光合和呼吸活性在发育前期显著高于亲本，但下降较快，到了发育中期(花后15~18 d)以后，就低于同期的亲本。但其SOD和CAT活性比其亲本下降得慢，从花后9 d开始一直保持着比亲本高的水平。花后转基因水稻剑叶的叶绿素含量、光合速率和SOD     

新型香稻渝恢2103香味分子遗传特性分析

香味是优良稻米品质的重要衡量标准之一,2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)是最主要的香味物质,然而2AP生物合成机理至今仍未确凿。本研究筛选了与2AP生物合成密切相关的甜菜碱脱氢酶2基因(Badh2)在30份水稻材料中的3种突变类型,从中发现1份新的香稻材料渝恢2103,该材料Badh2基因序列编码区无突变,遗传分析显示渝恢2103与badh2-E7突变型香稻宜香1B香味基因不等位,与非香稻杂交F2香与非香分离比接近9∶7,与香稻杂交F2香与非香分离比接近7∶9,表明渝恢2103的香味受多基因控制。进一步利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)比较了与2AP生物合成相关基因在日本晴、渝恢2103和宜香1B的表达情况,结果显示,Badh2基因在日本晴和渝恢2103中表达差异不大,但在宜香1B中表达量异常高;多数脯氨酸与谷氨酸代谢途径相关基因在宜香1B中的表达水平显著高于日本晴和渝恢2103;推测宜香1B的2AP合成同时受Badh2基因以及脯氨酸与谷氨酸代谢途径相关基因的影响;渝恢2103香味形成可能与这些基因无必然联系。渝恢2103特殊的遗传特性可能为水稻香味形成机理研究提供新的突破点。     

化控措施对直播晚稻抽穗扬花期低温胁迫的缓解效应

直播晚稻抽穗扬花期易遭受寒露风危害,影响产量与品质。利用自然低温条件,以陵两优722和中早35为试验材料,设置T1（芸苔素内酯+赤霉素）、T2（芸苔素内酯+赤霉素+磷酸二氢钾）、T3（赤霉素+磷酸二氢钾）和对照（CK,清水）4个处理,研究化学调控剂对直播晚稻遭遇寒露风危害的缓解作用。结果表明,在寒露风危害下,喷施不同化学调控剂均可有效缩短水稻抽穗时间,与CK相比,陵两优722和中早35生育期平均缩短了2.5d,其中,T1生育期均缩短1d,T2分别缩短3d和5d,T3分别缩短2d和4d,喷施化学调控剂还可有效减缓叶绿素相对值（SPAD值）与净光合速率（P_n）的下降,CK的SPAD值较第1次测定最大下降幅度平均为6.55%,T1、T2和T3分别为3.50%、4.22%和3.77%;CK的P_n较第1次测定最大下降幅度平均为10.59%,T1、T2和T3分别为5.96%、1.22%和3.36%。喷施化学调控剂不仅能稳定结实率与千粒重,且产量、稻米加工品质及外观品质均优于CK,与CK相比,陵两优722与中早35在T1处理下结实率分别提高8.17%与2.31%,T2分别提高6.20%与5.36%,T3分别提高7.88%与6.31%;千粒重则仅T2有促进作用,陵两优722与中早35较CK分别提高了1.67%与2.92%;与CK相比,陵两优722和中早35在T1处理产量平均提升9.01%,T2平均提升20.69%,T3平均提升19.01%,出糙率、精米率与整精米率较CK均明显提高,垩白度与垩白粒率明显降低。总体而言,磷酸二氢钾、赤霉素和0.01%芸苔素内酯混合液（T2）对水稻低温胁迫的缓解效果最明显。     

贵州地方稻种Wx基因序列多样性分析

为研究贵州地方稻种资源中水稻食味品质与Wx基因型的相关性,利用特异引物对88份贵州地方稻种Wx基因进行糯/非糯基因型分析及多样性鉴定。结果表明：66份材料为WxⅠ型糯稻基因型,该型品种包含了59份贵州禾类资源;15份材料为WxⅡ型,其中包含11份贵州禾类资源;7份材料为WxⅢ型,其中包含1份贵州禾类资源。贵州禾类资源(CT)n以n=18或20两种类型为主,第一内含子+1位均为T,（AATT）n为5。表明贵州禾类资源以低直链含量品种为主,这与当地居民的饮食习惯密切相关。WxⅡ型禾类资源虽然是非糯品种,但由于CT重复在16个重复以上,第一内含子+1位为T,直链淀粉含量介于Wx I型和WxⅢ型间,可作为水稻育种的优异材料。本研究为对贵州禾资源的进一步利用奠定了基础。     

利用分子标记鉴定水稻品种的Wx等位基因及其与直链淀粉含量的关系

应用Wx基因的微卫星标记484/485和PCR-AccⅠ分子标记对93份籼、粳水稻品种（系）的Wx基因的多态性进行了研究,并探讨了不同基因型与直链淀粉含量的关系。484/485扩增结果表明,该微卫星标记表现为3种基因型,即Wx1Wx1、Wx2Wx2和Wx3Wx3,其中籼稻以Wx1Wx1和Wx3Wx3为主,粳稻以Wx2Wx2为主,具有Wx1Wx1和Wx2Wx的品种（系）直链     

无抗性选择标记转基因软米和糯稻新品系的选育及中间试验

直链淀粉含量是影响稻米品质的最重要因素之一。为培育直链淀粉含量较低的软米和糯稻新品系,在经共转化法获得的转反义Wx基因水稻自交后代中筛选获得国不含抗性选择标记基因的纯合体.对这些纯合转基因水稻的分析表明,其未成熟种子胚乳中Wx基因表达水平和成熟种子中Wx蛋白量较未转化对照有不同程度的降低。转基因水稻成熟种子中直链淀粉含量较未转化对照有不同程度的下降,2个转基因系降低至10%左右,相当于软米的直链淀粉含量,1个转基因系降到了2%以下,形成了糯稻新品系。转基因稻米中直链淀粉含量降低后,其胶稠度相应变软,而糊化温度未发生明显改变。田间试验结果表明,转基因水稻的大部分农艺性状与受体品种武香粳9号无显著差异。因此,本研究成功培育了无抗性选择标记且淀粉品质改良的转反义Wx基因水稻新品系。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻miR1866突变体构建

microRNA (miRNA)是长度为18～25个碱基的非编码单链RNA,在植物生长发育过程中起着重要的调节作用.水稻是世界上重要的粮食作物之一,近年来调控水稻生长发育的miRNA不断被发掘,但目前关于miR 1866的研究还比较少.本研究通过构建miR1866的CRISPR/Cas9表达载体,创制miR1866的突...     

直播方式与播种量组合对水稻群体发育及产量构成的影响

为优化直播稻群体质量及其产量构成,研发直播稻提质增效配套技术、挖掘新品种生产潜力,本研究采用裂区设计,主区为湿润直播与旱直播2种直播方式,副区为5个播种量,研究直播方式与播量组合对水稻群体发育及产量构成的影响.结果表明,旱直播更能显著改善直播稻的出苗状况;'华盛早香'和'中早35'在播量为45～75 kg/hm2范围内...     

不同香味等位基因粳稻的分子和香味特性研究

利用水稻甜菜碱醛脱氢酶Badh2基因的两个外显子缺失标记引物从60份优质常规粳稻中筛选到11份香稻材料,对其分子基础和香味特性进行分析。追踪香稻系谱,发现外显子7缺失的材料其香味可能与籼稻种质有关。进一步利用第8染色体上37对SSR引物分析11份材料遗传基础,结果有20对呈现多态且检测到64个等位基因变异,平均等位基因数目为3.2个。聚类分析发现苏香粳1号和苏香粳2号归为一类且与其他材料遗传距离较远;对两品种感官评价发现幼苗植株和米饭香味特性均表现突出。利用半定量RT-PCR检测幼苗植株香味基因的表达量,发现不同品种幼苗地上部表达各异,且根部有香味基因不同程度的表达。研究结果为了解粳稻品种的香味特性和香稻育种提供了一定依据。