龙血树血竭生物合成相关基因分离与分析

龙血树是热带、亚热带地区所特有的珍稀植物,是著名民间药物“血竭”的重要原料。该药在我国中药材市场中占有重要的地位。目前血竭的生产是从多年生的龙血树上取其带脂茎杆提炼而成,该法需要大量的原材料,不断的砍伐已使其资源面临枯竭的威胁,现其己被列为国家三级保护的濒危植物。如何有效地开发和利用龙血树这一宝贵的资源,使其得到可持续和高效的利用是目前研究的一个重要方向。本研究以经诱导物诱导处理刚产生血竭和未经诱导物处理的海南龙血树（Dracaena cambodiann Pierre ex Gagnep）组培苗为材料,利用抑制消减杂交（supression subtractive hybridization,SSH）技术构建了龙血树血竭生物合成相关基因的差减cDNA文库,采用PCR方法筛选差减文库获得431个重组子。随机挑取200个克隆经Reverse Northern Blot筛选剔除假阳性后,共获得59个差异较明显的阳性克隆,测序后得51条差异片段,通过BLASTn和BLASTx进行比较分析,结果表明：分离到与信号转导相关的cDNA片段5个,转录翻译相关蛋白cDNA片段5个,物质能量代谢酶类cDNA片段12个,另外有23个克隆在GenBank中均未发现显著相关的同源序列,推测它们可能是功能未知的新基因或是靠近3--末端的基因片段,因保守性较低,难以通过同源比较推测其功能。     

白木香良种‘热科2号’的DNA条形码分子鉴定

奇楠沉香为极具收藏及药用价值的上品沉香,其鉴定目前以化学方法为主,但其种苗从苗期至采香之间则难以用传统分类和化学方法进行鉴定,DNA条形码的发展为这一产业难题的解决提供了新的思路。本研究在明确白木香良种‘热科2号’可产奇楠沉香的基础上,采用11对植物DNA条形码通用引物对‘热科2号’和普通白木香两个沉香品种进行分子鉴定探索,发现改良的CTAB法更适合白木香叶片样本的DNA提取,继而发现ITS、ITS2和源自叶绿体的8个DNA条形码在两个品种均无变异,而ITS1序列的第159个碱基在‘热科2号’中为T,在普通白木香中为A,多样本实验证明该变异位点可以作为‘热科2号’和普通白木香种苗鉴定的分子标记。本研究结果为白木香良种‘热科2号’及其幼苗的鉴定提供分子水平的技术支持,也为白木香良种的溯源提供新的思路。     

中药材白及分子鉴定研究进展

白及(Bletilla striata)的干燥块茎是一味传统的中药，具有较高的药用价值。由于其价格逐步走高，市场上充斥着各种白及混伪品。相对于传统的形态、理化、显微鉴定，分子鉴定较为快速、准确、客观。分子鉴定方法根据生物间的分子特征差异进行鉴定，不受自然环境、生长发育阶段等外部因素影响。本研究综述了分子标记、DNA条形码策略在白及鉴定上的应用：分子标记可鉴定白及及其近源物种，主要涉及ISSR、SCAR、SSR、SNP等标记；采用ITS2序列结合二级结构分析、ITS+ycf1序列可以鉴定白及属内及其他混伪品。本综述旨在为白及分子鉴定方法的深入研究提供有价值的参考和借鉴。     

稗属植物DNA条形码研究

为评估DNA条形码在稗属植物鉴定中的有效性,选取核DNA条形码序列ITS和ETS及叶绿体DNA条形码序列psbA、trnL-F和matK作为候选序列进行了分析。本研究对无芒稗、稗、长芒稗和细叶旱稗4种稗属植物的不同DNA条形码序列进行了扩增、测序,并分析了不同候选条形码序列的特征。结果显示,matK序列变异位点占比最高(3.6%),ETS序列最低(1.7%);psbA序列种间变异最大,matK序列种内变异最大;邻接树分析显示,条形码序列ITS、ETS、psbA、trnL-F和matK均可以区分出长芒稗,支持率均大于80%;此外,ITS序列将无芒稗和稗聚于同一支,可以区分出细叶旱稗。因此,建议ITS作为鉴别稗属植物潜在的DNA条形码序列。     

剑叶龙血树疏松愈伤组织诱导技术研究

为了获取质地好且松散型的愈伤组织,为进行剑叶龙血树细胞悬浮培养提供材料.本试验以剑叶龙血树种子、芽为外植体,研究不同培养基、不同激素组合对剑叶龙血树愈伤组织诱导和质地的影响.结果表明:以MS为基本培养基,增加适当浓度的2,4-D和6-BA能促进剑叶龙血树愈伤组织诱导率的提高,长势良好,产生的疏松愈伤组织也最多,最佳疏松愈伤组织诱导培养基为MS+ 6-BA 0.5 mg/L+2,4-D1.5～2.0mg/L.     

基于nrDNA ITS序列的榧树属植物鉴定及亲缘关系分析

为评价nrDNA ITS序列对榧树属(Torreya)植物的鉴定能力,本研究利用ITS序列和4种不同的分析方法(BLAST比对, K2P遗传距离, SNP位点分析及邻近NJ树)对榧树属植物进行物种鉴定,建立系统进化树讨论其亲缘关系。结果显示,48条ITS序列长度为1 095～1 105 bp,种内平均遗传距离为0.001 6,种间平均遗传距离为0.015 0。在物种水平,BLAST比对和NJ树对榧树属植物鉴定效率最高,SNP位点分析可有效鉴定香榧和榧树。亲缘关系分析显示,榧树属其他各种均呈单系分支,但云南榧树与巴山榧树在聚类树中聚为一支,表明二者亲缘关系极近,为近年提出云南榧树并入巴山榧树提供了核基因组序列的佐证。本研究表明ITS序列可作为榧树属物种鉴定的DNA条形码,为榧树属物种鉴定和系统关系提供参考。     

基于ITS 2序列的肉苁蓉种子DNA条形码鉴定研究

本研究基于ITS 2序列，对肉苁蓉和管花肉苁蓉的种子进行鉴定研究，旨在建立肉苁蓉种子的DNA条形码鉴定方法。通过提取种子的基因组DNA,经PCR扩增和双向测序，获得ITS 2序列。应用MEGA-X软件进行序列比对，计算K 2 P遗传距离，构建系统发育树。结果表明，所有种子样本均可以成功提取DNA和扩增ITS 2序列，种子的DNA分子量为10 000 bp左右，扩增产物为500 bp左右。肉苁蓉种子的ITS 2序列长度为414～472 bp, GC含量为54.41%～55.07%;管花肉苁蓉种子的ITS 2序列长度为399～489 bp, GC含量为54.18%～55.14%。肉苁蓉种子和管花肉苁蓉种子的ITS 2序列共有61个差异位点，种内最大遗传距离小于种间最小遗传距离，二者在系统发育树中分别聚为一支。ITS 2序列可以作为肉苁蓉种子的DNA条形码鉴定序列。     

海南龙血树种子超低温保存研究

海南龙血树是传统中药资源龙血竭的主要来源物种之一,也是国家二级重点野生保护植物。为了能够长期稳定保存海南龙血树野生种质资源,本研究采用3种超低温保存方法处理不同含水量的海南龙血树种子,通过发芽率、生理生化指标及细胞结构的综合评估,筛选出适宜海南龙血树种子超低温保存方法。结果表明,6.00%的种子含水量和直接冷冻法超低温保存对海南龙血树种子的细胞结构伤害和各项生理生化活性影响较小,且具有相对较高的发芽率(73.89%),建议将此组合作为长期保存海南龙血树种子的方法。此研究结果初步解决了海南龙血树种质资源长期保存较难的问题,为保护其野生资源提供指导意义。     

濒危植物海南龙血树SSR-PCR反应体系优化

为了更好地应用SSR分子标记技术于濒危植物海南龙血树保护遗传学研究,本研究通过单因子试验与正交试验方法,优化建立海南龙血树SSR-PCR反应体系,并对优化后体系的稳定性进行了检测。研究结果表明,优化后的海南龙血树15μL SSR-PCR反应体系为:1.5μL 10×PCR buffer, Mg~(2+)浓度为2.0 mmol/L,d NTPs浓度为100μmol/L,Taq酶1.0 U,引物0.4μmol/L和DNA模板5 ng。经验证,该反应条件可用于海南龙血树遗传多样性和遗传结构分析。     

基于coxⅠ、ITS和rbcL基因序列的马尾藻系统进化分析

本研究以海南省青葛港马尾藻属(Sargassum spp.)为研究对象,利用coxⅠ(细胞色素C氧化酶亚基I)、ITS (内转录间隔区)序列及rbcL (1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基) 3种DNA条形码分析马尾藻属遗传进化关系。结果表明,(1)基于形态鉴定及利用coxⅠ、ITS和rbcL三种DNA条形码进行分子鉴定的方式鉴定出9种海南省青葛港常见马尾藻属物种;(2)利用rbc L基因扩增出DNA序列的GC含量最低(32%),ITS基因扩增的DNA序列GC含量最高(59%),且在不同样本间ITS扩增的DNA序列GC含量差异最大,在57%～59%之间;(3) coxⅠ条形码序列可聚为两类,其中6个几乎不存在遗传距离,且5个样本间的遗传距离均小于50;从rbcL条形码序列的聚类结果看来,除了RQL3之外,其他样品聚为一类,6个样本间的遗传距离均小于50。ITS条形码序列聚类的结果显示,9种马尾藻样本可聚为两类,马尾藻样本之间均存在一定的遗传距离。研究认为,青葛港海域马尾藻种内变异丰富,同一属的样品表现出很好的属内种间多样性;在分析青葛港马尾藻的遗传进化时利用ITS基因比其他两种...     

海南龙血树基因组DNA提取方法比较

摘 要：为选择一种简单、快速、有效的海南龙血树总DNA的提取方法,分别采用CTAB法、SDS法、SDS-CTAB法和改良CTAB法提取海南龙血树嫩叶片的总DNA,用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计和ISSR对所提取的总DNA进行检测。结果表明,改良CTAB法提取的DNA A260/A280在1.7-1.9之间,纯度高、杂质少、DNA完整性好。以该方法提取的总DNA为模板进行ISSR扩增,谱带清晰,多态性、稳定性、重复性好。该法提取的总DNA适用于PCR扩增和其他分子生物学研究是有效提取海南龙血树基因组的方法。     

富贵竹种质资源遗传多样性的ISSR分析

利用ISSR分子标记技术对10份富贵竹(Dracaena sanderiana)材料进行了遗传多样性研究。从 36个引物中筛选出 8个有效引物,共扩增出125条带,其中多态性条带为69条,多态性比率为55.2%,遗传相似性系数范围在0.64～0.95之间。根据ISSR标记的结果,采用UPGMA聚类分析方法,可将供试材料分为3大类群。研究结果表明, 供试富贵竹材料的遗传多样性相对较低,迫切需要拓宽富贵竹的遗传基础。     

基于ITS序列海带目种质资源的物种鉴定研究

为了更准确地鉴定海带目种质资源,为种质保存和保护提供依据,研究采用海带目的核糖体DNA内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer,rDNA ITS区）的通用引物,以待鉴定海带目样品的基因组DNA为模板通过PCR方法扩增出ITS序列,在测序的基础上对25棵分别采自日本和烟台海区的海带目样品进行分子鉴定。结果表明,25个待鉴定褐藻目样品和16个已知物种,通过ITS序列聚类分析,分别聚在不同的单系类群中且在物种鉴定树中种内的支持率均较高,分属于2科3属,聚类为7个不同的种,形态学观察的结果与分子鉴定结论相吻合。海带目ITS序列引物通用性强,有效扩增率高,可用于海带目物种的快速鉴定。     

基于ITS 2序列的15种淫羊藿属药用植物分类鉴定研究

为探讨内转录间隔区2(ITS2)序列及其二级结构在15种淫羊藿属(Epimedium)中的鉴定效率。利用试剂盒提取叶片总DNA,对ITS2序列进行PCR扩展与测序,计算K2P遗传距离,构建系统发育树,预测其二级结构。结果表明,ITS2序列在15种淫羊藿属植物中的通用性好,扩增成功率与测序成功率均为100%。从K2P种间和种内遗传距离看,ITS2在淫羊藿属中的种间变异较小,部分种类种内遗传距离大于种间遗传距离,鉴定成功率约为60%。采用比对法(Blast)分析,ITS2鉴定效率为75%。由ITS2系统进化树可知,淫羊藿属与鬼臼属各为一支,易于分开。除薄叶淫羊藿、竹山淫羊藿、巫山淫羊藿外,其余种类均能较好的进行聚类;除粗毛淫羊藿、保靖淫羊藿外其余均不能与NCBI下载到的序列进行较好聚类。研究表明,15种淫羊藿属植物ITS2序列在ML系统进化树中具较好的鉴别能力,但淫羊藿属各样本种内与种间遗传较为混乱,遗传距离复杂,ITS2二级结构形态结构亦较为相似,将各种间进行区分存在一定难度,不适合单独作为该属条形码使用。     

植物DNA条形码研究现状及应用前景

生物DNA条形码已成为近年来生物学研究的热点,该技术在动物研究中已得到广泛应用,在植物中研究进展缓慢,植物DNA条形码筛选区域主要集中在叶绿体和核糖体内转录间隔区(ITS),目前还未获得广泛认同的植物DNA条形码。本文主要综述了不同单片段条形码及组合条形码的研究及应用现状,并展望了植物DNA条形码应用前景。     

普通小麦rDNA的ITS区及其基因组起源

采用特异引物对普通小麦(Triticum aestivum L.) rDNA的ITS区片段进行PCR扩增并测序,通过邻接法聚类分析, 得到3种类型的扩增产物。结果表明,ITS区序列长度是602 bp,其中ITS1和ITS2分别有8个和20个变异位点,ITS区揭示的遗传分化距离变化范围为0~0.038,平均值为0.021。通过从GenBank搜索并下载普通小麦野生近缘种ITS序列与本研究获得的普通小麦ITS序列进行比对,并用MEGA、PAUP、PHYLIP软件分析,按Kimura-2参考模型计算分化距离,以旱雀麦(Bromus tectorum)为外类群邻接法构建聚类树。根据杂交后代具有亲本的ITS序列遗传特点,认为小麦形成较晚,尚未同步进化完全,从分子水平上为普通小麦是异源六倍体提供了证据。通过与其A、B、D基因组可能供体的ITS区序列进行比对分析发现各自有不同程度的变异,认为普通小麦在多倍体形成过程中发生了序列消除现象,结合我们提出的“同步进化”对于不同的基因或者说不同类型的DNA序列是不同步的假说,解释了无法找到真正供体的原因。综上所述,我们认为A、B、D基因组的原初供体可能分别是乌拉尔图小麦(T. urartu)、山羊草(T. speltoides)和节节麦(T. tauschii)。     

Production and genetic evaluation of interspecific hybrids within the genus Sambucus

Attempts were made to produce hybrids among various Sambucus species in order to change the plant structure of S. nigra, a medicinal plant of increasing agricultural importance. The first successful genetic recombination, involving four species, was conducted after the introduction of S. javanica from a South Pacific island. A series of genetic analyses of the involved species and some relatives was performed in order to obtain reliable data on genetic similarity among parental species and to confirm the hybrid nature of putative hybrids. The nuclear 2C DNA content revealed by flow cytometry of nine species showed limited variation, the greatest being in S. nigra (28.6 pg) and the smallest in S. caerulea (23.9 pg). Maximum parsimony analysis of seven Sambucus species was used to form two dendrograms, one based on the sequenced nuclear ribosomal DNA (nrDNA) internal transcribed spacer (ITS) region and the other based on the cpDNA trnT‐trnF region. The results showed similar clustering into distinct groups; on both dendrograms S. nigra and S. javanica ES were closely related. Analysis of hybrid origin was based on the sequenced cpDNA region, genome size differences and PCR–RFLP analysis of the nrDNA ITS region. The seed parent and maternal origin of cpDNA was confirmed for all hybrids, while the pollen parent was confirmed in 21 of 22 putative hybrid plants tested.