CRISPR/Cas9技术编辑RMS2基因及其利用

水稻雄性不育是杂交水稻杂种优势利用的基础.为了推动粳型第三代杂交水稻育制种技术的发展,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对普通隐性核雄性不育基因RMS2进行定点编辑.根据CRISPR/Cas9基因编辑原理,以RMS2作为靶标基因,在基因第一和第二外显子分别选择正反向靶位点,在NCBI数据库利用BLAST工具分...     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻温敏不育基因TMS

tms5是生产上应用最广泛的温敏不育基因。为创制新型水稻温敏核不育系,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将6个优异的粳稻和4个优异的籼稻的TMS5基因敲除,获得了温敏核不育系。比较发现,粳稻温敏不育系ZG75S、CYGS、YG0618S、ZG07S、T0361S、7679S的不育起点温度在28～32°C之间,籼稻温敏核不育系2537S、6150S、6379S的不育起点温度在24～28°C之间,而籼稻温敏核不育系1109S的不育起点温度低于23.5°C。说明不同遗传背景材料获得的tms5突变体的不育起点温度不一样,通过TMS5的敲除可能获得不育起点温度较低的温敏核不育系。利用1109S与优质父本8048选配出优质高产杂交稻组合1109S/8048。大田试验表明, 1109S/8048比区试对照丰两优4号增产13.1%。温敏核不育系1109S及高产杂交稻组合1109S/8048的创制为高产育种提供了新的途径。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻OsABI5突变体

在水稻种植生产上,因其种子经常发芽率不齐,导致水稻直播困难,不仅影响水稻的生产成本还影响其产量,因此水稻直播的突出问题要保持优良的种子萌发力。ABA是种子萌发的抑制因子,它通过诱导ABI5的表达来抑制种子萌发,在种子正常萌发的过程中,随着种子吸胀和GA生物合成,ABA和ABI5的含量都迅速下降,促使种子萌发。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建OsABI5突变体,以期提高种子的萌发率和萌发速度。通过农杆菌介导法将构建好的OsABI5敲除质粒转化‘日本晴’水稻的愈伤组织,经PCR和Western Blot鉴定筛选得到两株OsABI5弱表达的阳性突变株系。通过对osabi5-2突变体和‘日本晴’萌发表型的观察,发现osabi5-2突变体2 d发芽率显著高于‘日本晴’,二者4 d的萌发势也是osabi5-2突变体略高。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了OsABI5突变体,对研究水稻OsABI5调控种子萌发的分子机制具有重要意义。     

利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻过氧化氢酶基因OsCAT

过氧化氢酶(catalase,CAT)作为重要的抗氧化酶,可催化细胞内过氧化氢的分解,为了研究水稻过氧化氢酶基因OsCAT2的功能,首先根据在线软件http://crispr.mit.edu/搜寻向导sg RNA序列,选择OsCAT2基因第三外显子上的"GTGGAGAACCGAACAATAACTGG"作为目标靶序列,然后构建了OsCAT2的CRISPR/Cas9载体BGK03-OsCAT2,将目的载体转化水稻粳稻9522后共获得了7个独立的转基因株系,其中包括在PAM附近发生编辑的独立转基因株系2个,编辑方式主要表现为缺失和错配。与野生型相比,转基因植株较矮、分蘖数增加、叶片呈明显的病叶状、成熟时期育性明显降低,这为深入研究水稻OsCAT2基因的作用机制提供了帮助。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻温敏不育基因TMS5

Thermo-sensitive genic male-sterile (TGMS) gene tms5 is most widely used in the two-line hybrid breeding system in China. To develop novel rice thermo-sensitive male sterile lines, we knocked out the TMS5 genes of six elite japonica and four indica rice varieties by using CRISPR/Cas9 gene editing technology. By analyzing the critical sterility-inducing temperature (CIST) of the newly TGMS lines, it was found that the CIST of japonica TGMS lines ZG75S, CYGS, YG0618S, ZG07S, T0361S, and 7679S were between 28°C and 32°C, the CIST of indica TGMS lines 2537S, 6150S and 6379S were between 24°C and 28°C, and the CIST of indica TGMS line 1109S was lower than 23.5°C. These results indicated that the CIST of tms5 mutant from different genetic background materials was different. The TGMS lines with lower CIST could be obtained by knocking out the TMS5 from different genetic background materials. A hybrid rice combination 1109S/8048 had high quality and high yield. The yield of 1109S/8048 was 13.1% higher than that of Fengliangyou 4. The creation of the TGMS 1109S and the high-yield cross combination 1109S/8048 provides a new way for high-yield breeding.     

利用CRISPR/Cas9技术编辑Badh2基因改良粳稻香味

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为水稻育种新型手段,香稻育种一直是水稻育种行业的研究热点,水稻香味主要由8号染色体上的甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制。为了改良原有品种的香味性状,促进香稻育种的发展,以非香型粳稻品种东农425为试验材料,构建了2个CRISPR/Cas9敲除载体对Badh2基因进行定点编辑,第1个载体(p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA)的2个靶点分别位于第2和第3外显子上,第2个载体(p YLCRISPR/Cas9-B2-gRNA)的2个靶点均在第2外显子上。采用农杆菌介导法对东农425进行遗传转化,成功获得了T0纯合植株,并对其衍生出的T1植株进行T-DNA元件检测,共获得8个突变类型不同且不含有转基因成分的纯合突变株系。同时采用咀嚼法和氢氧化钾浸泡法对这8个纯合突变株系的水稻籽粒进行香味检测,结果表明,8个Badh2株系均具有不同程度的香味,总体上载体p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA编辑的3个株系的香味更为浓郁。对这8个纯合突变株系的主要农艺性状进行考察,发现突变株系的穗数、穗粒数、结实率及千粒质量与野生型相比均没有明显差异。综上,本研究对东农425的Badh2基因成功地进行了编辑,并获得了香味显著提高且无转基因成分的纯合突变体材料,为加快香型粳稻品种的培育提供了技术支持。     

利用CRISPR/Cas9技术创制烟草NtabMYC2基因的定点突变

本研究利用CRSIPR/Cas9基因编辑技术,创制了NtabMYC2的不同的定点突变材料。针对NtabMYC2基因3个敲除靶位点,设计并成功构建了相应的载体。结果表明:3个载体转化烟草后,通过测序验证NtabMYC2基因被成功敲除了,统计3个载体的敲除成功率分别是24%、2%、10%;T0突变植株经过自交重组产生T1代植株,通过测序分析T1代植株存在4种纯合的NtabMYC2基因突变类型,其分别是多一个A、T、C插入突变和一个缺失4个碱基缺失突变。为进一步研究NtabMYC2基因在烟草中的功能提供了一定的参考价值。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻OsSLR1敲除突变体

GA是种子萌发的促进因子,能解除种子休眠和刺激萌发,GA的信号通路可以通过对DELLA蛋白的去抑制作用来完成的。通过对不同物种的DELLA蛋白功能的研究,发现不同物种的DELLA蛋白的功能具有高度保守性,本实验主要研究水稻中的DELLA蛋白SLR1,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建OsSLR1基因敲除突变株。首先,通过对OsSLR1的结构和功能域进行分析比对,最终选择3个靶点;然后,利用重组法构建CRISPR/Cas9敲除载体;最后,通过农杆菌介导法,将敲除载体转染成熟的日本晴水稻愈伤,待培育出幼苗,通过PCR和Western Blot进行鉴定。最终筛选得到1株Os SLR1敲除突变株系slr1-1,通过观察突变体萌发表型,发现slr1-1突变体第2天发芽率显著高于日本晴,而且slr1-1突变体的生长速度显著快于日本晴。通过不同浓度PAC对slr1-1突变体萌发表型的影响,发现水稻的DELLA蛋白SLR1敲出的突变体种子萌发不受PAC抑制,表明OsSLR1是通过调控GA信号途径影响水稻种子的萌发,详细的调控机制和互作蛋白等还有待深入的研究。通过对SLR1调控GA信号通路控制水...     

CRISPR/Cas9编辑花生FAD2基因研究

油酸脱氢酶((35)12FAD或FAD2)是催化油酸(OA)的C12位上脱氢生成双不饱和亚油酸(LA)的关键酶,它控制油酸、亚油酸的含量及其比值(O/L)。研究表明, AhFAD2是油酸生成亚油酸的关键基因,决定花生种子中油酸和亚油酸的相对含量。本研究根据AhFAD2基因序列,设计了相应sgRNA序列,并构建了旨在敲除FAD2A和FAD2B两个花生油酸脱氢酶的CRISPR/Cas9基因编辑载体。经花生基因转化后,通过对转基因花生突变位点基因组序列分析找出基因突变体。对靶基因分析发现,16株转基因花生含有29个FAD2A基因突变,其中16个突变引起蛋白质序列变化;11株转基因花生含有30个FAD2B基因突变,其中17个突变引起蛋白质序列变化。FAD2A和FAD2B蛋白质序列的变化可影响花生油酸脱氢酶的活性,改变油酸催化脱氢,使亚油酸合成受阻,油酸含量增加。本研究为研究花生脂肪酸合成及高油酸花生育种提供了宝贵的基因突变体材料。     

利用CRISPR/Cas9技术创建OsCOL9水稻突变体

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑,为作物的遗传育种提供了新的方向。以感病水稻品种丽江为材料,抗病基因OsCOL9为靶基因,探索该系统对水稻内源基因定点编辑效率以及获得有研究意义的突变体。OsCOL9基因CDS序列全长1 266 bp,编码一个422 aa蛋白,分子量大小约为45.6 k Da,蛋白质结构的N端含有B-box结构域,C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1)结构域。设计4个长20 nt的guide RNAs(gRNAs)靶点,靶向编辑OsCOL9基因的CDS起始区域以及外显子的末端,分别由U3、U6a、U6b以及U6c启动子驱动,提取T1转基因植株的基因组DNA并对编辑位点附近的DNA片段进行序列分析。结果表明,T1材料中OsCOL9的碱基缺失数最多可达59 bp,突变次数最多可达11次,取得较好的基因编辑效果。同时本试验出现了脱靶效应,因此着重探讨了降低脱靶效应的方法。由于CRISPR/Cas9系统在进行基因编辑时没有外源基因的导入,加上该技术的快捷、简便,对生物技术与传统育种的结合具有重要实践意义。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术改良大粒香稻瘟病抗性

优质稻米大粒香是采用粳籼杂交方法育成的香稻品系,多年来是贵州省优质稻米企业开发生产的主推品种.但稻瘟病抗性差,限制了其大规模推广应用.本研究以大粒香为材料,根据CRISPR/Cas 9靶点设计要求设计稻瘟病基因pid3特异性靶点sgRNA序列,构建crispr-pid3双靶点载体,通过农杆菌介导遗传转化大粒香愈伤组织,...     

利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术提高贵州禾产量研究

以贵州禾糯稻黎平杂边禾为研究材料,设计水稻产量控制关键基因OsCKX2的CRISPR/Cas 9编辑特异性靶点序列,构建水稻OsCKX2基因的CRISPR/Cas 9定点编辑载体,并利用农杆菌介导法导入黎平杂边禾,通过潮霉素筛选及PCR分子检测,获得20个独立的转基因植株.对筛选获得的转基因T0代植株基因进行测序比对,...     

水稻赤霉素代谢基因 OsGA2ox4 的两种检测方法比较

针对水稻赤霉素代谢基因 OsGA2ox4,利用 PARMS 试剂盒及基于 PCR 引物 3'' 末端核苷酸双脱氧修饰两种检测方法,对 236 份水稻材料进行基因型检测,两种检测方法结果符合率为 93.18%,均可以通过 SNP 分型对水稻赤霉素代谢基因OsGA2ox4 进行基因型鉴定。对两种方法的优缺点具体说明,并且提供这两种方法的选择或使用条件,可以为 SNP 检测技术的进一步研究及两种方法在水稻其他基因 SNP 分型中的应用提供参考。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑DTH8基因改良水稻99-25的抽穗期

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为水稻育种的重要手段。为培育早熟、丰产、优质的种质资源,以农艺性状优良、迟熟粳稻品种香糯99-25为试验材料,构建了CRISPR/Cas9双靶点表达载体对抽穗期基因DTH8进行编辑,采用农杆菌介导法将构建好的表达载体转化农杆菌EHA105。用携带重组质粒的农杆菌菌液侵染水稻愈伤组织,成功获得了30株T₀转基因苗。对T₀植株利用潮霉素特异引物进行分子检测,其中阳性植株29株,阳性率高达96.7%。设计特异性引物对29株阳性苗的靶位点上下游600 bp进行PCR扩增测序,结果表明,7株转基因阳性苗在第2个靶点附近发生了碱基替换或插入突变。对这7株突变株系的抽穗期进行调查,发现DTH8-2、DTH8-5、DTH8-9、DTH8-10、DTH8-17、DTH8-21的抽穗期提前。利用实时荧光定量PCR检测发现DTH8-2、DTH8-9、DTH8-17与香糯99-25相比DTH8基因表达显著降低。成功利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对香糯99-25的DTH8基因进行了编辑,获得了抽穗期提前的DTH8突变体材...     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得水稻GRAS家族转录因子G540突变体

GRAS转录因子是植物特有转录因子,一般由保守的GRAS结构域组成,与光信号转导、赤霉素信号转导、植物生长发育及植物逆境胁迫响应密切相关。水稻GRAS转录因子G540中含有2个RPT1结构域和2个GRAS结构域,系统进化分析和表达模式分析发现,G540属于GRAS转录因子家族中的HAM亚家族,在水稻穗早期发育阶段特异表达,推断G540可能参与穗的早期分化或形态建成。本研究利用CRISPR/Cas9技术对G540进行定点编辑,构建G540基因敲除载体并利用农杆菌介导转化水稻粳稻品种‘9522’,鉴定并获得遗传转化植株。对转化植株的靶序列进行分析发现,9522G540-1在靶序列上缺失了第4位C碱基,9522G540-4在靶序列的第3位和第4位之间插入了一个A碱基,9522G540-2在G540的双等位基因上出现了不同的突变,一条链在靶序列上缺失了第4位C碱基,另一条链在靶序列上缺失8个碱基。对G540突变后的氨基酸序列分析发现,9522~(G540-1)、9522~(G540-2)和9522~(G540-4)的RPT1和GRAS结构域完全缺失,即成功获得以‘9522’为背景的G540功能缺陷型突变体。为进一步探究该基因在穗发育进程中的生物学功能和分子机制提供遗传材料。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除OsEIL1和OsEIL2基因改良水稻耐盐性

为了培育耐盐水稻品种,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在水稻品种东农427的耐盐负调控基因OsEIL1和OsEIL2设计1个敲除靶点对其进行同时敲除。通过PCR和测序的方法,在T_0共检测出了5个突变单株,其中有1株为双基因同时突变的植株。在该植株的T_1株系中,获得了4株双基因纯合突变且不含T-DNA元件插入的植株。在T_2进行苗期耐盐性鉴定,成熟期考察农艺性状指标。结果表明,在苗期200 mmol/L NaCl溶液处理5 d后,突变体植株的鲜质量和干质量显著高于野生型植株,地上部及地下部钠离子含量均显著低于野生型植株,钾离子含量与野生型植株无明显差异。恢复7 d后,突变体植株幼苗存活率(75.0%)显著高于野生型植株(8.3%)。在成熟期,突变体的主要农艺性状未发生明显变化。综上,利用CRISPR/Cas9技术对水稻品种东农427进行了耐盐改良,为耐盐水稻品种的培育提供了理论和材料基础。     

CRISPR/Cas9基因编辑系统在水稻育种应用的研究进展

土壤退化、气候变化、生物和非生物胁迫的不利影响,对保障中国粮食生产安全和稳定提出了新的挑战.为了更快地实现水稻育种目标,在育种改良中整合分子育种新技术是当务之急.CRISPR/Cas9基因编辑技术具有时间周期短、操作简便快捷、编辑效率高等优点,已成为植物科学和水稻分子育种的重要工具,在水稻种质资源创制和遗传改良中得到广...     

利用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制新型水稻温敏雄性核不育系

为迅速获得优良的温敏雄性核不育(TGMS)系,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对一份优良的水稻品系GXU41的TMS5基因上2个靶点进行编辑,对编辑植株进行靶点突变检测,筛选无外源DNA的编辑TGMS系,并进行育性转换、农艺性状和米质分析评价。结果共获得12株T0代转基因阳性植株,其中靶点1和靶点2的纯合突变率分别为50%和58.4%,一个或两个靶点为纯合突变占83.3%,双纯合突变率达到25%,在T1代中筛选到无外源DNA的TGMS系。与野生型相比,编辑获得的TGMS系GXU41-5S随着温度升高小穗育性和花粉育性逐渐降低,在24℃时均表现完全不育;由于不育效应,GXU41-5S的株高增长和有效穗数增加显著,且GXU41-5S全部米质指标达到优质一等大米的标准要求。本研究证明了CRISPR/Cas9基因编辑系统是快速获得TGMS系有效途径,所创制的TGMS系对选育两系杂交水稻品种具有重要应用价值。