巴西橡胶树HbbHLH1启动子的克隆与序列分析

bHLH转录因子在高等植物生长发育、激素应答和次生代谢调节中具有重要的功能.根据巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)HbbHLH1基因设计了2个特异性反向引物,利用GenomeWalking方法从巴西橡胶树叶片基因组DNA中克隆获得了HbbHLH1基因起始密码子上游819 bp的调控片段.序列分析表明,该片段除了含有一个典型的真核生物核心启动子区域(-60～-10bp)外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与激素和胁迫诱导相关的顺式调控元件,其中在-290 bp和-309 bp位点分别有一个应答MeJA信号反应的调控元件,但没有发现典型的乙烯响应元件.这暗示了HbbHLH1转录因子可能在橡胶树乳管分化和胶乳生物合成中具有调控作用.     

巴西橡胶树HbMADS5的克隆及表达分析

在前期巴西橡胶树胶乳转录组测序的基础上,通过PCR克隆了1个编码巴西橡胶树MADS-box转录因子的基因,命名为Hb MADS5。Hb MADS5全长1 077 bp,编码358个氨基酸,推测Hb MADS5蛋白分子量为40.75 k D,等电点为6.38。氨基酸序列比对分析表明,Hb MADS5具有MADS-box家族典型的MADS-box保守结构域,与蓖麻、葡萄、麻风树、甜橙、木本棉、蒺藜状苜蓿等物种的MADS-box家族成员具有较高的同源性,分别为79%、74%、72%、70%、65%和59%。Hb MADS5与麻风树中的1个MADS-box成员亲缘关系最近。Hb MADS5在巴西橡胶树根、茎、叶、花和胶乳等中都有表达,其中在胶乳中表达量最高,在根中表达量最低;茉莉酸甲酯和乙烯能诱导Hb MADS5的表达,茉莉酸甲酯处理12 h后Hb MADS5表达量提高了10倍,乙烯处理48 h后Hb MADS5表达量提高了2倍。本研究将为进一步研究Hb MADS5在巴西橡胶树中的功能提供了帮助。     

巴西橡胶树茉莉酸诱导胶乳cDNA文库的构建

摘要：以巴西橡胶树热研7-33-97为材料,对橡胶树割线下方施用0.1%茉莉酸,采集胶乳,提取胶乳总RNA并纯化mRNA,构建巴西橡胶树茉莉酸诱导胶乳融合表达文库。检测表明,获得的初级文库滴度为1.9×106 pfu/ml,插入片段在0.5到5kb之间,平均大小为1kb左右;表明该文库质量合格,为今后克隆胶乳中的茉莉酸信号应答基因奠定基础。     

橡胶树皮乳管组织茉莉酸诱导相关因子AP2/EREBP基因的克隆与表达分析

摘要：茉莉酸（jasmonic acid,JA）可诱导橡胶树（Hevea brasiliensis Muell.Arg.）乳管分化,是乳管分化的关键信号分子。目前,对JA诱导橡胶树乳管分化的分子机理仍然不清楚。我们在前期研究中通过筛选JA刺激乳管分化时期的橡胶树树皮组织cDNA差减文库,获得了4条与茉莉酸诱导乳管分化相关的AP2/EREBP家族转录因子基因的EST。本研究在此基础上,采用RACE法完整地克隆了这4个AP2/EREBP转录因子基因的开放阅读框,蛋白氨基酸序列分析表明其中3个属于ERF亚类,1个属于RAV亚类;表达分析发现,这4个基因在乳管分化时期的橡胶树树皮组织的表达受JA诱导,随JA处理时间的延长,其表达量先增强后减弱,推测它们可能在JA诱导橡胶树乳管分化过程中起着重要的调控作用。     

巴西橡胶树JAZ家族基因的克隆和表达分析

茉莉酸是调控橡胶树创伤反应及产排胶的重要激素,JAZ蛋白是茉莉酸信号途径中重要的负调控因子。目前,巴西橡胶树中已报道7个JAZ基因。本研究结合Genebank中已有的橡胶c DNA序列和本实验室转录组测序数据,通过电子克隆的方法获得5个橡胶JAZ基因全长序列,分别命名为HbJAZ3、HbJAZ4、HbJAZ5、HbJAZ6和HbJAZ12,并通过RT-PCR技术成功扩增得到HbJAZ3、HbJA5、HbJAZ6、HbJAZ12等4个基因的编码区。最后采用定量RT-PCR技术分析发现,4个橡胶JAZ基因在橡胶不同组织中的表达有明显,以及其在伤诱导和茉莉酸处理后的差异表达,发现4个橡胶JAZ基因的表达都受到茉莉酸及创伤处理的影响,说明这些JAZ蛋白参与橡胶茉莉酸调控的创伤反应,本研究为阐明橡胶产排胶调控机理打下基础。     

巴西橡胶树HbNAC55的克隆及表达分析

在前期巴西橡胶树胶乳转录组测序的基础上,利用q RT-PCR技术,从巴西橡胶树中克隆得到1个NAC转录因子基因,命名为Hb NAC55。Hb NAC55全长1 755 bp,该基因编码584个氨基酸,蛋白质分子量为65.06 ku,等电点为4.79。蛋白结构分析发现,该蛋白含有一个NAM结构域,具有典型的NAC类蛋白的结构特征,与木薯、胡杨、可可、土瓶草、梅、胡桃、甜橙等物种的NAC家族成员具有较高的同源性,分别为81%、61%、56%、57%、55%和53%。通过q RT-PCR发现Hb NAC55在橡胶树胶乳中表达量最高。茉莉酸和乙烯均能诱导胶乳中Hb NAC55表达上调,其中茉莉酸甲酯处理12 h后Hb NAC55表达量提高了近6倍,乙烯处理48 h后HNAC55表达量提高了近1.7倍。本研究将为进一步研究Hb NAC55在巴西橡胶树中的功能提供了帮助。     

巴西橡胶树小橡胶粒子蛋白（SRPP）基因启动子的克隆及其功能分析

摘要：小橡胶粒子蛋白（SRPP）是巴西橡胶树中参与橡胶生物合成的重要蛋白因子之一。SRPP的氨基酸序列与橡胶延长因子（REF）和菜豆胁迫相关蛋白（PVSRP）的同源性分别为72%和68%。为了进一步研究SRPP基因表达及其调控的机制,作者采用接头连接介导的PCR散步法（ligation-mediated PCR）,克隆了SRPP基因的启动子。序列分析表明,SRPP基因启动子中与光诱导相关的顺式元件占39%,可能属于光诱导型启动子,因此,SRPP基因的表达可能受光信号的调控。此外,SRPP基因启动子还具有热激响应元件（HSE）、干旱胁迫响应元件（MBS）、防卫和胁迫响应元件（TC-rich repeats）、脱落酸响应元件（ABRE）、赤霉素响应元件（GARE）和激发子响应元件（EIRE,W box）等,这表明橡胶树SRPP基因不仅参与调控橡胶生物合成,而且可能是橡胶树中响应逆境信号的抗性基因,在橡胶树抵御逆境胁迫的生理过程中发挥重要作用。     

HbTCTP及其截短体酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为进一步鉴定橡胶树翻译控制肿瘤蛋白(HbTCTP)与橡胶延伸因子1 (HbREF1)互作的分子区域,构建Hb TCTP及其截短体的诱饵载体。本研究利用RT-PCR技术从橡胶树胶乳中扩增出包含HbTCTP不同结构域的片段,克隆到p GBKT7表达载体,通过酶切、菌落PCR和测序鉴定后,转化酵母Y2HGold感受态细胞,检测诱饵蛋白是否具有自激活作用和毒性。结果显示,成功构建6个包含HbTCTP不同结构域的诱饵载体,且诱饵载体对酵母宿主细胞无毒性和无自主激活报告基因的功能。本研究结果为进一步筛选HbTCTP与HbREF1互作的分子区域及阐明HbTCTP的功能提供科学依据。     

棉花转录因子GhSNAC3启动子的克隆与表达分析

为研究棉花NAC转录因子基因GhSNAC3启动子的结构和功能,以鲁棉研32号基因组为模板,用PCR扩增的方法得到棉花基因GhSNAC3的启动子序列,利用分析网站PlantCARE、PLACER和BDGP对启动子上存在的顺式作用元件进行了预测与分析,在此基础上利用该启动子及GhSNAC3基因构建植物表达载体,并通过烟草遗传转化进一步研究启动子的转录活性。结果表明GhSNAC3启动子除含有CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有茉莉酸、赤霉素和脱落酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件。采用不同胁迫处理转基因烟草并进行表达分析,结果显示GhSNAC3在盐胁迫下植株根部有高水平的表达,而在茎和叶中表达量极低,表明GhSNAC3在逆境胁迫应答过程中可能具有重要功能,其启动子是一个盐诱导型启动子,具有组织特异性。研究结果为棉花NAC信号通路研究和耐盐基因工程改良提供了理论依据。     

巴西橡胶HbWRKY55启动子的克隆及功能初步分析

为深入研究巴西橡胶树HbWRKY55调控天然橡胶生物合成机制,本研究根据已克隆的巴西橡胶树HbWRKY55的序列和橡胶树基因组序列信息设计引物,通过PCR技术获得了HbWRKY55起始密码子ATG上游1 587 bp的序列,利用Plant CARE数据库对该序列的调控元件进行分析。分析结果表明该启动子序列除具有多个典型的真核生物启动子基本元件如增强子元件CAAT-box、启动子核心序列TATA-box等外,还存在赤霉素反应元件GARE-motif、P-box以及水杨酸响应元件TCA-element等参与激素调控的应答元件,同时光应答元件BoxⅠ、Gap-box、Ⅰ-box、L-box、GAG-motif和GT1-motif,胚乳表达的调控元件GCN4-motif、Skn-1_motif和厌氧诱导元件ARE等顺式作用元件也包含其中。构建了该序列的4个5'端缺失片段和荧光素酶基因融合的表达载体,瞬时表达结果表明赤霉素(GA)、水杨酸(SA)可以抑制HbWRKY55启动子的活性,脱落酸(ABA)、茉莉酸甲脂(MeJA)可以加强HbWRKY55启动子的活性。在HbWRKY55启动子的-641~-455和-237~+1可能存在抑制ABA的元件;HbWRKY55启动子的-454~-238和-66~+1存在JA应答增强元件。本研究为深入了解HbWRKY55的调控机理提供帮助。     

巴西橡胶树WRKY转录因子基因HbWRKY41的克隆与表达分析

为阐明巴西橡胶树WRKY转录因子基因Hb WRKY41的分子特征及表达特性,利用RT-PCR方法从巴西橡胶树中克隆了该基因。Hb WRKY41开放阅读框1 020 bp,编码339个氨基酸,预测蛋白分子量为38.48 k Da,理论等电点为5.52。Hb WRKY41含有1个WRKY保守结构域和1个C_2HC型锌指结构,与蓖麻、棉花、大豆及拟南芥WRKY41蛋白聚为一类,属于Ⅲ类WRKY转录因子家族成员。实时荧光定量PCR检测结果表明,Hb WRKY41在巴西橡胶树根、树皮、胶乳、叶和花等组织中均有表达,以在衰老叶片中的表达最高,而在胶乳和树皮中的表达相对较低。干旱、低温及高盐胁迫均可上调Hb WRKY41的表达,其中以低温或盐胁迫下Hb WRKY41的表达持续升高。Hb WRKY41可能在巴西橡胶树叶片衰老和非生物胁迫应答中起着重要调控作用。     

李传友研究组等揭示MYC2调控茉莉酸信号终止的机制

<正>作为一种重要的植物激素,茉莉酸调控植物的防御反应和适应性生长。当植物遭遇病虫侵害或其他逆境胁迫时,活性茉莉酸被受体COI1(CORONATINE-INS ENS ITIVE 1)识别而释放核心转录因子MYC2的活性,MYC2与转录中介体亚基MED25形成功能复合物而在全基因组范围内激活茉莉酸响应基因的表达,产生防御反应。但茉莉酸信号的过度激活会大量消耗自身能     

茶树CCoAOMT基因克隆及启动子的结构分析

茶树咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是甲基化EGCG生物合成的一种重要酶,为探明CCoAOMT基因的表达调控规律,进一步解析甲基化EGCG生物合成的调控机制。本研究采用同源克隆法获得了茶树CCoAOMT的cDNA全长序列,采用染色体步移技术(Genome walking)获得了该基因的启动子序列,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明,CCo AOMT全长cDNA为1 000 bp,其中开放阅读框长735 bp,编码245个氨基酸,含有caffeoyl-CoA O-methyltransferase和SAM功能结构域;进一步分离得到CCoAOMT基因上游调控序列1 624 bp,发现其含启动子核心元件TATA-box、CAAT-box及5'UTR Py-rich stretch (高水平转录顺式作用元件)、MYB (干旱诱导时的MYB结合位点)、G-box、GAG-motif、GATA-motif、GT1-motif、Sp1 (光响应元件)、CGTCA-motif、TGACG-motif (茉莉酸甲酯响应元件)等重要顺式作用元件。由结果推测,CCoAOMT基因在转录水平受各类转录因子的调控,该结论为进一步研究CCoAOMT基因的转录调控机制提供了理论指导。     

JAZ基因家族6个成员在橡胶树上的物理定位

茉莉酸信号途径与橡胶树的防御能力及胶乳合成密切相关,JAZ蛋白是茉莉酸信号途径下游基因转录调控关键的抑制因子,目前虽已报道多个JAZ基因,但该家族基因在染色体上的具体位置尚未明确。本研究中,以巴西橡胶树的"热研7-33-97"品种作为实验材料,分别利用原位PCR技术和和荧光原位杂交技术对巴西橡胶树的JAZ家族的6个基因(jaz1,jaz2,jaz3,jaz5,jaz6,jaz7)在染色体上的位置进行了物理定位分析,结果表明:HbJAZ1、HbJAZ2、HbJAZ3、HbJAZ5、HbJAZ6和HbJAZ7基因分别位于巴西橡胶树(热研7-33-97)的第4号染色体的长臂、第4号染色体的长臂、第8号染色体的长臂、第9号染色体的短臂、第6号染色体的长臂上和第1号染色体的短臂上;信号位点距离着丝点的平均百分比距分别为:47.29、41.87、51.98、81.74、20.07和29.11。基因与其它基因间的连锁关系,并有效的应用于橡胶分子遗传育种方面的研究。     

GbTCP5与GbGL3启动子中TCP顺式作用元件的结合特性分析

TCP转录因子是参与植物生长发育的特异性家族蛋白,但是棉花TCP转录因子家族中的大多数成员功能尚不清楚。为了定位GbTCP5转录因子调控的靶基因,本研究通过Plant CARE在线网站分析棉花纤维发育基因GbGL3上游3 000 bp启动子中的顺式作用元件,构建含有TCP顺式作用元件的载体PHISII-GbGL3和酵母表达载体p GADT7-GbTCP5,通过酵母单杂交分析GbTCP5与GbGL3启动子中TCP顺式作用元件的结合特性。结果表明：GbGL3上游3 000 bp启动子中包含TCP顺式用作元件和功能各异的顺式作用元件,酵母单杂交实验结果表明GbTCP5能够与GbGL3启动子中含有的TCP顺式用作元件结合。本研究为进一步了解GbTCP5转录因子的功能提供依据。     

菊芋果聚糖合成酶基因1-FFT启动子克隆与功能分析

本研究通过Tail-PCR方法分离到菊芋1-FFT基因上游长度为1 611 bp的片段(FFTP)。神经网络启动子在FFTP序列中预测到8个启动子核心结构,瞬时表达结果显示起始密码子上游400 bp的启动子核心结构域与1 611 bp的启动GUS基因表达的活性无明显差异,表明-296到-246区域就是1-FFT基因的启动子区域。PlantCARE分析表明,FFTP序列中除基本启动子元件(TATA-box和CAAT-box)外,还含有与MYB转录因子结合的元件3个,参与光调控的顺式作用元件12个,茉莉酸反应、厌氧过程、脱落酸、抗逆反应的元件各2个,昼夜节律控制、生长素和赤霉素反应的元件各1个。这些顺式作用元件的鉴定为1-FFT参与相应的生物学过程提供理论依据。     

白桦4CL基因启动子克隆及表达分析

为研究4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)在白桦木质素合成代谢过程中的组织特异性表达,利用染色体步移法克隆其启动子,用该启动子定向置换pBI121载体的35S启动子,构建重组载体P_(4CL)::GUS。利用瞬时转化法将重组载体转入白桦实生苗茎后进行GUS染色。结果显示:获得了4CL基因编码区起始密码子上游长1344 bp的启动子序列,该启动子除分布有TATA-box、CAAT-box等基本的转录起始元件外,还存在多个顺式作用元件序列位点,包括35S启动子作用元件ASF,参与脱落酸响应的顺式作用元件ABRE,参与茉莉酸甲酯响应的顺式调控元件CGTCA-motif,以及光反应元件G-Box、ACE、4CL-CMA2b等;启动子表达分析结果显示经过瞬时侵染的白桦茎段被染成蓝色。以上结果表明克隆获得的4CL基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了白桦木质部的发育。     

巴西橡胶树REF/SRPP家族基因的克隆及表达分析

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳是天然橡胶的主要来源,橡胶延伸因子(REF)和小橡胶粒子膜蛋白(SRPP)作为胶乳中的两大主要蛋白,被认为参与了橡胶的合成和调控。目前,NCBI蛋白数据库已经登录了巴西橡胶树REF/SRPP家族的6个成员,我们通过研究又获得8个新的REF/SRPP基因家族成员,Hb REF154、Hb REF221、Hb REF296、Hb REF542、Hb SRPP178、Hb SRPP203、Hb SRPP216、Hb SRPP234。这14个成员编码蛋白都具有保守的REF结构域,有两个成员还具有ATP合酶亚基结构域,一个成员具有甲基结合结构域。进化分析显示橡胶树REF/SRPP家族成员与产胶植物REF/SRPP家族成员在进化上较为接近。q PCR分析发现该家族成员都响应割胶刺激表达升高,除Hb REF138外其它成员都响应乙烯处理表达降低。通过shotgun数据分析发现,除Hb REF221外的13个成员都存在于橡胶粒子或C-乳清组分中,Hb REF138、Hb REF154、Hb REF175和Hb REF258主要存在于橡胶粒子中,Hb REF542、Hb SRPP216是橡胶粒子中所特有的,Hb REF296和Hb SRPP200是C乳清中所特有的。该研究结果揭示了REF/SRPP家族成员及其基本的表达特性,为深入研究该家族成员在巴西橡胶树产胶中的具体作用提供了一定的基础。     

樱桃番茄Cf9基因调控元件预测及同源基因系统发育分析

为探明Cf9基因的表达调控元件和同源基因进化关系,从樱桃番茄品种京番红星中克隆了Cf9上游序列,利用PlantCARE启动子预测工具对转录起始位点上游1500 bp序列进行顺式调控元件分析。结果表明,Cf9启动子不仅含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,而且含有光响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件等。Cf9基因可能受光、水杨酸和茉莉酸甲酯等诱导表达。Cf9同源基因系统进化分析结果表明,当同源指数为0.65时,番茄、马铃薯、辣椒、烟草中含有Cf9同源基因,同源基因既包括旁系同源基因,也包括直系同源基因,分析结果也进一步说明番茄与马铃薯的亲缘关系最近,其次为辣椒、烟草。