大蒲莲猪不同发育阶段组织RT-qPCR分析中适宜内参基因筛选

利用适宜数量且表达稳定的内参基因对目的基因的表达量进行标准化是获得准确、可靠RT-qPCR数据的重要条件。以不同日龄大蒲莲猪8种组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠组织、肌肉、血液)为试验材料,使用ge Norm、Norm Find软件对8个常用候选内参基因(ACTB、B2M、GAPDH、RPL4、SDHA、TBP、YWHAZ、PPIA)的表达稳定性进行分析,筛选适宜内参基因及其组合。ge Norm、Norm Find软件联合分析结果表明,不同日龄大蒲莲猪心脏中表达最稳定的内参基因为TBP、PPIA和YWHAZ,肝脏、肾脏、肠组织和肌肉中最稳定的内参基因均为TBP和PPIA,脾脏中表达最稳定内参基因为TBP和RPL4,肺脏中表达最稳定内参基因为TBP、RPL4、PPIA和ACTB,血液中表达最稳定内参基因为ACTB、YWHAZ和GAPDH。由于大蒲莲猪8种体组织中最适宜内参基因组合和数量不同,因此内参基因筛选是进行RT-qPCR数据分析的必要条件。结果可为研究大蒲莲猪目的基因表达时适宜内参基因的选择提供帮助。     

百合体胚诱导、发育及不同组织实时定量PCR内参基因筛选

本研究筛选观赏百合(Lilium oriental×Trumpet hybrid)体胚诱导、发育不同时期及不同组织中稳定表达的内参基因,以观赏百合品种‘Conca D'Or’为研究对象,采用实时荧光PCR分析百合8个候选内参基因(18S,ɑ-TUB,GAPDH,UBQ,b HLH,ACT,EIF,EF1)在体胚诱导不同时期、体胚发育不同阶段及不同组织中的扩增效果,并采用Genorm、Norm Finder和Best Keeper三种软件对候选内参基因在百合中的表达稳定性进行综合评价。结果表明:b HLH在体胚诱导、发育及不同组织中的稳定性优于其他基因;GAPDH及ACT在观赏百合‘Conca D'Or’上扩增效果差。将体胚诱导不同时期、体胚发育不同时期及不同组织的扩增数据放在一起分析,Ge Norm和Norm Finder软件评估最适内参基因为b HLH和EIF,Best Keeper软件评估最适内参为EF1和b HLH。本研究建立了观赏百合实时荧光定量PCR内参基因的筛选体系并选出观赏百合体胚诱导、发育及不同组织表达最稳定的前三个内参基因分别为b HLH、EIF和EF1。     

甜樱桃花芽不同发育时期内参基因的筛选与验证

为了筛选甜樱桃花芽不同发育时期均稳定表达的内参基因,以甜樱桃桑提娜和黔樱一号不同发育时期花芽为材料,通过qRT-PCR技术检测28S rRNA、EF1-a1、EF1-a2、UBC、RPL13、18S rRNA、RSP3、CYP40、ACT2和α-TUB3等10个常用看家基因的表达水平,并利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper综合评价其表达稳定性。结果表明,EF-1a2和RSP3在所有样品中稳定性最好。分别以EF-1a2、RSP3及EF-1a2+RSP3作为内参基因检测不同发育时期花芽生长素运输载体AUX1基因及生长素响应因子ARF基因的表达模式,该2个基因在不同内参基因标定下表达模式相同。表明EF-1a2、RSP3及EF-1a2+RSP3可作为甜樱桃花芽不同发育时期的内参基因。     

芍药实时定量PCR内参基因的筛选和验证

以芍药不同花发育时期和不同组织器官为研究材料,利用qPCR技术检测8个内参基因的表达水平,并利用geNorm,NormFinder,Bestkeeper和RefFinder软件综合评价它们的表达稳定性。结果表明,分析芍药花瓣不同发育时期和不同组织的基因表达时可选用UBQ,GAPDH和ACTIN作为内参基因,而PP2A和SAMS不适于作为内参基因。PlF3H基因的相对表达水平证实,在芍药花瓣不同发育时期,利用UBQ和GAPDH两个表达最稳定的组合即可获得精确的基因表达结果。     

地黄实时定量PCR内参基因的筛选

本文通过RT-qPCR分析了地黄中7个传统内参基因18S、EF-1?、ACT11、UBQ10、UBQ5、TUB5、GAPDH和4个新报道的内参基因PP2A、RPⅡ、HSP90、TIP41的mRNA表达差异情况,分别利用Ct值比较,GeNorm、NormFiner和BestKeeper软件分析它们在两个发育时期、八种不同组织器官中表达稳定性。结果表明：在地黄花器官中（花瓣、花托、雄蕊、雌蕊、子房）,TIP41和UBQ10表达稳定;在地黄生殖生长期和营养生长期不同器官中（根、茎、叶）,TIP41和UBQ5表达稳定。因此,以上两组基因分别适宜作为不同营养器官的内参基因。     

建兰花香物质合成相关基因RT-qPCR内参基因筛选

为筛选适用于建兰(Cymbidium ensifolium)花香物质合成相关基因表达分析的内参基因,本研究从建兰‘小桃红’转录组测序结果中筛选出ACT、GAPDH、EF1α、TUA、TUB、CYP、UBQ和ADF这8个常用的内参基因作为候选内参基因。以建兰‘小桃红’的不同花期(小蕾期,中蕾期,大蕾期,初开期,盛花期,衰败期)和盛花期不同花器官(萼片,花瓣,唇瓣,合蕊柱)为实验材料,利用RT-qPCR技术分析候选内参基因在不同样品中的表达量,并结合内参基因稳定性分析软件对候选基因表达稳定性进行分析。结果表明：在候选内参基因中,TUB的稳定性最高,可作为建兰‘小桃红’花香物质合成相关基因表达分析的最适内参基因。     

沙地云杉种子内参基因的筛选与验证

为筛选出沙地云杉(Picea mongolica)种子成熟过程中均可稳定表达的内参基因,本研究以沙地云杉种子不同发育时期的样本为研究对象,采用RT-qPCR技术,检测沙地云杉种子转录组数据库中GAPDH、EF1α、CYC、Actin等8个候选内参基因在种子发育过程中呈现的综合表达水平,并通过内参基因分析软件(geNorm, NormFinder, BestKeeper)对其稳定性统一评估。结果表明,候选内参基因中稳定性最好的是CYC、EF1α和GAPDH。分别以CYC、EF1α和GAPDH作为内参基因对沙地云杉胚胎发育关键调控基因LEA1(Late embryogenesis abundant protein)和WOX9 (WUSCHEL related homebox)进行了定量分析,其表达趋势基本一致。本研究结果将对沙地云杉及近缘物种的分子育种研究提供参考。     

文冠果实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选适用于文冠果(Xanthoceras sorbifolium Bunge)性别分化过程研究和不同器官的内参基因,本研究以文冠果性别分化关键期的顶芽和侧芽、根、茎、叶、种仁、雌能花和雄能花为材料,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)鉴定7个候选内参基因(Actin,UBQ,EF-1α,TUB,eIF-4α,18S rRNA和GAPDH)在各样品中的表达量,并评价7个基因的表达稳定性。结果表明,7个候选内参基因在不同样品中的表达量存在明显差异,各基因在雌能花中的表达均显著高于其他材料,在雄能花中的表达处于较低水平;适用于文冠果性别分化过程的最优内参基因为UBQ和eIF-4α,适用于不同器官的最优内参基因为EF-1α和GAPDH。研究结果将对今后进行文冠果性别分化过程研究和不同器官中的基因表达分析提供参考。     

铁线莲属萼片荧光定量PCR内参基因的筛选和评价

以不同花色的铁线莲属(Clematis L.)栽培品种‘恬美’(C.‘Sympatia’)、‘罗兰’(C.‘Rooran’)、‘仙女座’(C.‘Andromeda’)‘、阿拉贝拉’(C.‘Arabella’)‘、普鲁吐斯’(C.‘Proteus’)以及‘路易斯罗维’(C.‘Louise Rowe’)初花时期的萼片为研究材料,利用RT-qPCR技术检测Atpb、Arp7、Ubc34、Wit1、Cxip4、Cyp71a1和Cyp35a1等7个候选内参基因的mRNA表达情况,并利用软件geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder对7个候选内参基因的稳定性进行综合评估。结果表明,内参基因表达差异显著;利用geNorm软件计算结果为基因Atpb与Cxip4最稳定;利用NormFinder软件计算结果为基因Cxip4最稳定;而BestKeeper软件计算出的最稳定的候选内参基因为Arp7,其次为Atpb;按这3个软件的计算结果,Cyp71a1与Cyp35a1的稳定性均最差,不适合作为内参基因;RefFinder软件分析的最佳的候选内参基因为Arp7。经综合分析,这几...     

花椰菜花球中花青素合成相关基因RT-qPCR内参基因的筛选

花椰菜收获过程中花球变紫的现象与花青素含量密切相关,目前针对花椰菜花球里花青素合成途径中相关基因表达分析的内参基因尚未报道。本研究以花椰菜始终不变紫色的白色花球组织和变紫花球中的未变紫、浅紫和深紫花球组织为研究材料,采用RT-qPCR技术测定了6个候选内参基因在不同颜色花椰菜花球组织中的表达水平,用ΔCt法以及GeNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件分析候选内参基因的稳定性。结果表明：花椰菜不同颜色花球组织中,6个候选内参基因的稳定性综合排名为SKIP16>ACT>PP2A>TUB>UBQ>EF1α。SKIP16基因综合稳定性排名第一,其次是ACT基因,均适合作为花椰菜花球组织中花青素合成途径相关基因研究的理想内参基因;geNorm软件通过计算配对变异值分析最适内参基因组合的数量为2个,综合选用SKIP16和ACT基因。本研究结果可作为分析花椰菜花球花青素合成途径中相关基因准确测定的参考依据。     

四种木本油料内参基因筛选及Actin基因时空表达分析

以油茶、沙棘、文冠果和油用牡丹的成熟种子为材料,利用实时荧光定量PCR分析了7个内参候选基因GAPDH、Actin、TUB、eEF1α、RPL4、UBQ和e IF4A在四种木本油料中的表达稳定性,并进一步验证了Actin基因在沙棘不同发育期种子和果肉中的表达。结果表明,6个内参候选基因GAPDH、TUB、eEF1α、RPL4、UBQ和e IF4A的表达水平在四种本油料种子间存在明显差异(p0.05),内参候选Actin基因在四种木本油料种子中的表达较稳定(p0.05)。Actin基因在沙棘种子和果实的不同发育期表达稳定(p=0.380和p=0.603),且在果肉和种子间在各个时期不存在明显差异(p0.05)。这不仅可为沙棘果实不同器官基因表达差异研究提供内参基因,而且可为四种木本油料基因表达研究内参基因的选择提供科学参考。     

干旱和盐胁迫中大麦实时定量PCR内参基因的筛选

为筛选大麦中干旱和盐胁迫条件下适宜的实时定量PCR内参基因,我们对栽培大麦23-19和野生大麦4-3进行了3种不同的胁迫处理:不浇水自然干旱、30%PEG干旱胁迫、0.4 mol/L Na Cl盐胁迫,用内参分析软件Ge Norm和Norm Finder分析比较了6种常用内参基因ubiquitin、a-tubulin 2、Actin、ARF1、EF1a、SAM在不同组织部位的表达稳定性,并以筛选到的稳定内参分析了胁迫诱导表达基因DHN1的表达情况。结果显示:筛选内参基因时,将所有实验数据综合在一起分析,未能找到稳定表达的内参基因及其组合;按根、茎、叶进行内参基因的筛选发现不同的组织部位、在不同的胁迫处理下,稳定表达的内参基因不完全相同;叶片中内参基因的表达稳定性最为一致,ubiquitin、Actin和ARF1在3种不同的胁迫处理下均有较为稳定的表达。以筛选到的内参基因ubiquitin、Actin和ARF1分析DHN1的表达情况,结果与植物的生长表现吻合。研究结果表明同时考虑太多的变量组合(如不同胁迫,不同组织)不易筛选到稳定表达的内参基因,建议在进行实时定量PCR研究之前根据具体的实验条件先对内参基因进行筛选。叶片适宜作为组织材料、ubiquitin、Actin和ARF1适宜作为内参基因组合对干旱和盐胁迫下野生大麦和栽培大麦进行实时定量PCR研究。     

高温胁迫香葱内参基因筛选与稳定表达分析

香葱(Allium fistulosum L. var. Caespitosum Makino)响应高温胁迫过程中,差异表达基因的鉴定及表达验证对深入了解香葱的高温应答分子响应机理具有重要意义。为筛选高温胁迫下香葱稳定表达的内参基因,本研究以香葱耐热品种‘AF60’和不耐热品种‘AF35’的叶片为材料,分别进行高温胁迫不同时间处理,选取13个候选内参基因(Ac18S, Af18S, Af28S, AcActin, AcActin, AfTUA, AfTUB, AsSAND, AfMYH, AfGAPDH,AfUBQ, AfEF1α, AfCYC),利用实时荧光定量RT-qPCR技术检测香葱高温胁迫处理候选内参基因的表达,采用GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件评价其稳定性,并进行综合分析。结果表明：13个内参基因在不同高温处理下的表达稳定性存在差异,综合分析香葱内参AcActin表达最稳定,其次为AfEF1α、Af28S;而AcActin表达最不稳定;同时,结果显示利用香葱转录组开发的内参基因普遍稳定性高于葱属其他作物开发的内参。该结果为香葱基因的表达分析提供了...     

翼首草实时荧光定量PCR内参基因筛选

本研究以传统藏药翼首草为材料,利用翼首草转录组数据库和RT-qPCR技术分析6个植物常用的候选内参基因(Actin,18S,TUBa,TUBb1,TUBb2和GAPDH)。选用geNorm、NormFider和BestKeeper 3款分析软件进行候选内参基因稳定性分析,以期筛选出翼首草不同组织中表达稳定的内参基因。内参基因Ct值分析、geNorm和NormFider软件分析结果表明Actin基因表达量最高,表达最稳定。BestKeeper软件分析结果表明GAPDH和Actin基因表达最稳定。综合分析结果说明,运用RT-qPCR技术研究翼首草关键基因表达量时,可选用Actin基因作为内参基因。翼首草合适内参基因的确定,可为今后其相关基因表达研究的开展提供依据。