落叶松体细胞胚原胚团阶段差异表达基因文库的构建与分析

以日本落叶松×华北落叶松杂种无性系胚性细胞系Y35继代培养阶段胚性愈伤组织的cDNA为实验组,体细胞胚成熟阶段培养物的cDNA为对照组,利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了原胚团阶段差异表达基因文库.随机选取800个阳性克隆进行测序,共获得400个UniESTs,将其分为19类,功能分析结果表明这些UniESTs参与代谢、转录、信号转导、转运、细胞生长分裂、细胞结构、细胞命运、蛋白质合成与降解、核酸及蛋白质加工、发育、防御等诸多生物学过程.这些差异表达ESTs的获得为研究植物体细胞胚胎发生的分子机理奠定了基础.     

红光促进棉花胚性愈伤诱导的转录组分析

为探究红光促进棉花胚性愈伤组织形成的分子机理。本研究以陆地棉CCRI24为试验材料,利用RNA-seq技术对在红光、白光培养条件下的不同阶段棉花愈伤组织进行转录组测序,分析胚性愈伤形成过程的基因表达水平。对2个不同光处理愈伤组织共计8个样品进行转录组测序,共获得54.92 Gb clean data。与白光相比,5、15、20、30 d的非胚性愈伤组织中差异表达基因分别有261、58、139、44个上调,454、157、328、507个下调。GO功能富集分析表明,两种光质条件下的棉花愈伤组织差异表达基因的功能主要富集到细胞核、细胞膜等与细胞分裂有关的代谢过程。KEGG富集分析结果显示,红光与白光条件下的愈伤组织间差异表达基因主要参与光合作用-天线蛋白、玉米素合成、二萜类生物合成、类黄酮生物合成等代谢通路。研究结果表明,与胚性愈伤组织形成相关的8个基因的差异表达趋势与转录组测序分析结果一致。本研究为光质影响棉花胚性愈伤诱导的相关基因表达提供了数据,为解析棉花胚性愈伤组织诱导与形成的分子机制提供参考。     

亚麻形态发生的生理生化特性

摘 要 研究了不同基因型亚麻形态发生过程中可溶性糖、可溶性蛋白、核酸等内容物及抗氧化物酶CAT、SOD和POD酶活性变化,探讨其形态发生过程生理生化变化规律。结果表明,在两个品种亚麻各阶段中,胚性愈伤中的CAT、POD、可溶性蛋白、核酸和可溶性糖含量均高于非胚性愈伤组织,这些物质含量和组分的变化与胚性的维持和细胞的旺盛分裂分化有关,而SOD在无菌苗和不定芽期含量高,初始愈伤组织中的含量是最低的,与其抗氧化能力密切相关。     

楸树胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织的生理生化差异

在植物体胚发生过程中愈伤组织里存在着复杂的生化反应,不同的愈伤组织有着不同的生理生化特性。用MS培养基对楸树幼嫩种子进行培养,诱导产生出三种类型的胚性愈伤组织和一种非胚性愈伤组织,以此作为实验材料。对可溶性蛋白、可溶性糖和游离脯氨酸的含量进行测定分析,研究楸树胚状体形成过程中三种类型的胚性愈伤组织之间以及胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织之间的生理生化差异。结果表明,可溶性蛋白和游离脯氨酸在楸树胚性愈伤组织中的含量都远远高于其非胚性愈伤组织;而楸树胚性愈伤组织的可溶性糖含量均显著低于其非胚性愈伤组织。并且可溶性蛋白、可溶性糖和游离脯氨酸的含量在楸树不同类型的胚性愈伤组织之间存在差异。     

樟子松无性系(GS1)胚性愈伤组织的初步诱导

本研究以樟子松无性系(GS1)为研究对象,探讨合子胚不同发育时期愈伤组织的诱导情况,探索不同培养基类型及不同激素配比对其愈伤组织诱导的影响,初步建立体胚发生技术体系,为樟子松(GS1)体胚发生技术建立和获得植株再生提供一定基础。本研究对樟子松无性系(GS1)合子胚不同发育时期进行观察并进行不同时期、不同激素体胚诱导。樟子松无性系(GS1)合子胚形态变化可划分为9个阶段,将这9个阶段的合子胚分别接种到不同培养基上进行诱导。结果显示,DCR培养基比MS和LM培养基更适合GS1愈伤组织的诱导和生长。第7阶段的合子胚在DCR+2,4-D 5.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培养基上愈伤组织诱导率最高,在DCR+2,4-D 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培养基上胚性愈伤组织诱导率最高。诱导过程会产生两种类型的愈伤组织,分别为白色透明状的愈伤组织和淡黄褐色愈伤组织。经显微观察有两种结构愈伤组织,一种是近球形的薄壁细胞结构,为非胚性愈伤组织;另一类是由胚性细胞和胚柄细胞组成的胚性细胞团。樟子松无性系(GS1)合子胚第7阶段的合...     

陆地棉体细胞胚胎发生过程中的细胞外基质研究

 研究棉花体细胞胚胎发生对于促进棉花基因工程育种具有重要意义。利用扫描电镜和透射电镜对陆地棉体细胞胚胎发生过程的研究发现,细胞外基质在棉花体细胞胚胎发生的不同阶段呈现出有规律的动态变化。当普通愈伤组织细胞发育成胚性愈伤组织时,细胞外基质就会出现;随着原胚的形成,细胞外基质就会形成发达的网络状结构;随着胚状体的进一步形成和发育,细胞外基质则逐渐降解。在愈伤组织和非胚性愈伤组织中,始终未发现细胞外基质。结果表明,细胞外基质与体细胞胚胎发生能力关系密切,是原胚形成的重要标记。     

玉米成熟胚胚性愈伤组织的诱导、高频再生及转化的研究

以玉米自交系CML295、CML304和18-599R的成熟胚为外植体, 结合幼胚离体培养方法, 探讨并优化了成熟胚来源的胚性愈伤组织诱导及继代培养方法。对其愈伤组织的形态和组织切片的研究结果显示, 继代过程可产生良好的Ⅱ型胚性愈伤组织。在分化培养中分别获得68.6%、75.4%和84.8%的高频再生率, 每愈伤组织块成苗数分别为2.45、2.43和2.75。利用基因枪法转化pCAMBIA1301质粒后的GUS瞬时表达效率分别为57.9%、62.5%和73.1%, 转化pCAMBIA1303质粒后检测GFP的瞬时表达效率分别为23.3%、40%和45.5%。以上3种基因型成熟胚来源的愈伤组织转化率与其对应的幼胚来源的胚性愈伤组织转化率相似。这一技术体系为玉米的遗传改良和功能基因组研究提供了重要的技术平台。     

橡胶树胚性愈伤组织对添加外源抗氧化剂低温冷藏的响应

为探讨低温冷藏对橡胶树胚性愈伤组织的影响,以(25±2)℃、常规增殖培养的胚性愈伤组织为对照,测定在(6±2)℃、添加外源抗氧化剂的低温保存培养基上生长25 d的胚性愈伤组织的相对生长量、抗氧化酶活性、恢复生长、体细胞胚诱导和植株再生能力。结果表明:低温冷藏胚性愈伤组织的相对生长量比对照的显著降低83.1%,但细胞活力相对强;低温冷藏胚性愈伤组织的SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶活性与对照无显著差异,但GR酶活性比对照的显著增加4.21倍;恢复(25±2)℃、正常增殖培养,胚性愈伤组织的存活率、相对生长量、体细胞胚诱导率与对照的无显著差异,但植株再生能力提高47.2%。综上所述,低温冷藏条件下,外源抗氧化剂能有效保护橡胶树胚性愈伤组织,可进一步优化保存条件以延长保存时间,为今后利用低温保存橡胶树优质胚性愈伤组织,避免因频繁继代引起胚性愈伤组织生长和胚性的衰退,妥善保存橡胶树种质资源提供理论依据和技术保障。     

棉花愈伤组织分化过程中的DNA甲基化分析

DNA甲基化是表观遗传修饰的途径之一,在维持生物基因组稳定性与调控基因转录和表达中起着重要作用。为明确棉花愈伤组织分化过程中基因组DNA的甲基化变异模式以及甲基化图谱,本研究利用全基因组亚硫酸盐测序(WGBS)技术对棉花愈伤组织分化(非胚性与胚性)过程中的DNA甲基化模式进行了全面比较。全基因组DNA甲基化分析表明,在棉花愈伤组织分化过程中非胚性愈伤组织的mCG与m CHG所占比率高于胚性愈伤组织,而不对称m CHH的比率则低于胚性愈伤组织;非胚性愈伤组织的mCG、m CHG、mCHH及mC的平均甲基化水平均低于胚性愈伤组织。基因组甲基化区域分析表明,棉花愈伤组织分化过程中基因间、启动子和基因下游(转录终止位点下游2 kb)的甲基化水平较高,同时胚性愈伤组织的基因间、启动子及基因下游的平均甲基化水平均高于非胚性愈伤组织。因此,本研究分析了棉花愈伤组织全基因组DNA甲基化水平,为进一步研究棉花体细胞胚胎发生的表观遗传机制提供了依据。     

陆地棉体细胞胚胎发生过程中的mRNA差异显示分析

以未经诱导的棉花下胚轴、经愈伤诱导10d的下胚轴和胚性愈伤组织为材料,利用差异显示反转录 PCR(DDRT PCR)技术对陆地棉体细胞胚胎发生过程中的cDNA差异表达进行了初步研究。反转录获得cDNA第一链,经3个锚定引物和随机引物的DDRT PCR,产物经测序胶电泳分离,共得到约200个差异表达cDNA片段,其中51个为陆地棉胚性愈伤组织所特有,从中还获得相关基因上游或下游的调控系列,从其中一个样品中可成功分离、克隆24个cDNA片段。经Northern杂交验证,从获得的差异片段中找到了一个能稳定出现的阳性cDNA片段,该片段仅出现在胚性愈伤组织阶段。对该片段进行克隆、测序和序列同源性分析,发现该片段是一个功能未知的cDNA片段。     

Protoplast Fusion in the Genus Medicago and Isoenzyme Analysis of Parental and Somatic Hybrid Cell Lines

Leaf mesophyll protoplasts of Medicago arborea (2n = 32) were electrofused with cell suspension and/or callus protoplasts of Medicago sativa. Heterokaryons were identified in agarose beds by their dual fluorescein isothiocianate—chlorophyll fluorescence and their coordinates were recorded. Hybrid minicalli were manually picked up and grown first in nurse culture and then in callus induction medium. Hybrid nature of the selected calli was confirmed by isoenzyme analyses. In order to verify whether morphogenesis of somatic hybrid calli was affected by cell incompatibility, mesophyll and cell suspension protoplasts, derived from the same plant of M. sativa with high embryogenic capacity, were fused. Only callus tissues derived from mesophyll protoplasts retained the highly embryogenic character of the M. sativa genotype, while hybrid cell lines were non-morphogenic and showed isoenzyme patterns similar to tissues derived from cell suspension protoplasts. The achievement of somatic hybrid plants in the genus Medicago is discussed.     

甘蔗与抗旱性相关差异蛋白质组分析

采用桶栽方式,对抗旱性强的F172和抗旱性弱的YL6甘蔗品种在苗期进行重度干旱胁迫处理后,应用蛋白质双向电泳技术进行差异蛋白质分析,分别找出差异显著的28和20个差异蛋白点,其中部分呈现上调表达,部分呈现下调表达,还有部分新增的蛋白点,因品种抗性不同而表现各异,F172叶片中的差异蛋白主要表现为上调表达,而YL6中大多表现为下调表达。在重度干旱胁迫下,抗旱性不同的甘蔗品种蛋白质丰度变化有显著差异。采用MALDI-TOF-TOF/MS鉴定所获得的差异蛋白,从YL6、F172中分别鉴定出18、14个蛋白的氨基酸序列,对所鉴定的蛋白质根据功能分为8类。YL6中参与自由基清除的2个,参与光合作用的6个,参与细胞生长和分裂的1个,参与基础代谢的6个,参与防卫反应的2个,未知功能蛋白1个。F172中参与自由基清除的1个,参与光合作用的2个,参与细胞生长和分裂的2个,参与基础代谢的4个,参与信号转导的2个,参与蛋白加工的1个,未知功能蛋白2个,其中22 k D干旱诱导蛋白的丰度明显提高,而在YL6中则检测不到此蛋白。这说明在干旱胁迫下抗旱性不同的甘蔗品种在蛋白质组成上有很大差异,推测这是不同甘蔗品种间抗旱性差异的重要分子基础。     

甘薯胚性细胞悬浮培养系的建立

地甘薯胚性细胞悬浮增减系的进行了研究。将１２个基因的长约０．５ｍｍ的茎尖培养在含有０．２ｍｇ／Ｌ或２．０ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ的ＭＳ培养基上，形成了胚性愈伤组织。胚性愈伤组织的形成率因基因型和２，４－Ｄ深度不同而很大差异，为０－７５．７％。一方面，将胚性愈伤组织继续增减在含有２，４－Ｄ的ＭＳ培养基上，它们形成了处于各发育时期的体细胞胚。将具有体细胞胚的胚性愈伤组织转移到ＭＳ基本培养基上，体细胞胚发育成     

Identification of proteins related to microspore embryogenesis responsiveness in anther cultures of winter triticale (×<Emphasis Type="Italic">Triticosecale</Emphasis> Wittm.)

For a better understanding of the physiological background of microspore embryogenesis (ME), the protein profile was analyzed in four winter triticale DH lines, which show extremely different embryogenic potential. The analysis were conducted with anthers at the phase of development optimal for ME induction and then after low temperature (LT, 3 weeks at 4 °C) ME-inducing tillers treatment. The sub-proteome of anthers was mapped by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE). The protein species significantly more abundant (at least 2-fold) in responsive DH lines after LT treatment were chosen for identification by MALDI-TOF/TOF analysis. In total, 31 protein species were successfully identified as involved in the determination of microspore competence, stress response and in the regulation of ME induction. Microspore competence required sufficient energy supply and efficient system of cell protection that determine survival under prolonged LT stress treatment. LT stress was associated with increased accumulation of proteins typical for cell defence against oxidative stress (e.g., l-ascorbate peroxidase), chaperons (e.g., HSP70) and other enzymes/factors ensuring protein biosynthesis, stability and active cell divisions. Also here, effective cell defence required undisturbed energy supply. Among proteins that accumulated differentially in accordance with microspore embryogenic potential again the most important role seems to be played by the enzymes ensuring energy production and determining ability of plant stress adaptation. Two protein species (enolase, 12S storage protein), proposed earlier as candidates for markers of embryogenesis in other in vitro plant culture systems confirmed their utility for triticale anther cultures.     

籼稻体细胞胚胎发生特异性蛋白质研究

以籼稻Oryza sativa L.subsp. indica品种“广陆矮4号”幼穗和种子为外植体，在含有2，4-D2.0mg/L的MS培养基上，分别形成胚性和非胚性愈伤组织，建立体细胞胚胎发生实验系统。应用Native/SDS双向凝胶电泳分析，结果表明，非胚性愈伤组织分化培养前后均存在一种分子量为45kD的非胚性蛋白质N1，另一种非胚性蛋白质N2（54kD）仅     

温度对龙眼体胚发生早期POD活性及同工酶的影响

以龙眼品种红核子LC2胚性细胞系诱导获得的体胚发生早期过程中不同发育阶段的同步化胚性培养物为材料,2个温度梯度（20℃、30℃）处理,以25℃为对照,初步研究了POD活性及同工酶在龙眼体胚发生早期的变化规律。结果表明：不同温度处理的胚性培养物,随着胚性细胞的分化,POD活性总体呈下降趋势,且无论高温（30℃）或低温（20℃）处理后龙眼体胚发生早期各阶段胚性培养物的POD活性均明显大于对照（25℃）;温度处理对龙眼体胚发生早期POD同工酶谱影响也较大,表现为新谱带的出现。推测POD活性与同工酶谱的规律变化与龙眼体胚发生早期细胞分化以及维持体胚正常发育有密切关系。     

棉属G染色体组野生棉种的体细胞胚胎发生与植株再生研究

通过培养基激素配比、碳源种类等培养条件的筛选，对2个G染色体组棉种（纳尔逊氏棉，Gossypium nelsonii Fryx.；澳洲棉，Gossypium australe F. Muell.）进行体细胞培养并获得了体细胞胚，其中纳尔逊氏棉获得了再生植株，澳洲棉获得了大量的胚状体。与D染色体组棉种克劳茨基棉（Gossypium klotzschianum Anderss）相比，G染色体组棉种再生时间长，且体细胞胚畸形严重、萌发困难，但通过培养条件的调控可以得到大量胚状体和少量再生植株。激素组合0.1 mg L^-1 KT+0.1 mg L^-1 2, 4-D诱导的愈伤组织较松软，分化潜力高；胚性愈伤组织的增殖使用0.2 mg L^-1 KT+0.5 mg L^-1 IBA的激素组合；组合0.25 mg L^-1 IBA＋0.3 mg L^-1 KT有利于体细胞胚胎发生，而含激素组合MSB5+0.15 mg L^-1 KT+0.5 mg L^-1 NAA的培养基适合体细胞胚胎的萌发和植株再生。此外，愈伤组织诱导宜用葡萄糖作为碳源，而在胚性愈伤组织的增殖及保存和胚状体的萌发过程中用麦芽糖作碳源的效果更佳。     

Genetic analysis of in vitro wheat somatic embryogenesis

Summary A spring wheat genotype which produces somatic embryos in vitro, after short and long-term culture, was tested for its ability to sexually transmit this embryogenic trait. Reciprocal crosses were performed between a embryogenic line and a nonembryogenic variety.Immature embryos were cultured on Murashige and Skoog medium plus 2 mg/l 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, gelled with 5.5 g/l agarose. Somatic embryogenesis was not expressed in the F₁'s. In contrast, from several hundred immature embryos of the F₂ generation of one cross, 10.7% and 1.6% expressed somatic embryogenesis in short and long-term cultures respectively. These percentages of embryogenic: non-embryogenic fits a model of a few complementary genes. The embryogenic capacity of the F₂ genotypes depends on the presence of recessive alleles at these gene loci. The long-term wheat somatic embryogenesis capacity requires a more complex mechanism than the short-term one.Abbreviations CS Chinese Spring - Aq Aquila - E Embryogenic - NE Nonembryogenic - SC Subculture