EMS诱导水稻一目惚(Hitomebore)表型和基因组序列变异

甲基磺酸乙酯(EMS)是常用的化学诱变剂之一,可诱导水稻产生大量基因型及表型变异,在良种培育和遗传机理的研究中被广泛应用。在本研究中,我们采用甲基磺酸乙酯诱导水稻栽培型一目惚(Hitomebore),在不同浓度下一目惚表型变异明显。同时选取突变样本M6进行表型变异检测和基因组重测序分析。实验发现:处理样本M6与对照样本野生一目惚相比,生长势、根尖活力、植株高度、分蘖数及千粒重存在明显差异;重测序的结果显示,基因组范围内有14 469个单核苷酸变异位点,并且广泛分布于水稻的12条染色体上。这些变异位点伴有不同类型的转换和颠换,在12条染色体的转座子和基因内均有分布,存在于不同基因合成途径中。本研究为深入探索EMS诱发表型变异的遗传机理研究提供了基础,并期望对影响水稻表型相关基因的探究提供依据。     

EMS诱导水稻‘辽星1号’突变体的筛选与鉴定

构建突变体库是植物基因功能研究的重要途径。为了解析优异粳稻品种‘辽星1号’高产、优质的分子机制,用化学诱变剂EMS (Ethylmethane sulphonate)对‘辽星1号’进行诱变处理,构建突变体库,M₁代单株收获,M₂代种植3 500个株系,通过全生育期调查,鉴定表型变异,M₃对变异性状的稳定性进行重复鉴定。结果表明,‘辽星1号’经EMS处理后变异类型非常丰富,M₂代共获得突变体336份,突变频率为9.6%,包括叶色、叶型、株高、茎秆、穗型、粒型和胚乳淀粉等性状。M₃代大部分突变体能够纯合且稳定遗传,只有单蘖、寡蘖突变体在M₃代仍处于分离状态。同时,株型突变常常伴随着穗部性状和分蘖性状的突变,可能存在一因多效的功能。该突变体库的构建有助于阐明水稻重要农艺性状相关基因的生物学功能,并为水稻遗传改良提供了依据。     

棉花纤维发育相关基因表达谱的比较分析

本研究通过3年4环境的田间试验,在BIL(backcross inbred lines)群体中选取断裂比强度最大的材料NMGA-062(32.5cN/tex)和断裂比强度最小的材料NMGA-144(26.67cN/tex),利用Affymetrix棉花基因芯片,比较分析NMGA-062和NMGA-144纤维发育10d时的基因表达谱。在24029条转录本中,两个基因型中差异表达的转录本6504条,占筛选转录本总数的27.07%;其中差异表达倍数在2倍或2倍以上的转录本有3461条,占筛选转录本总数的14.41%,对其进行功能分类。对8个差异表达明显的基因(Ghi.10655.1.S1_s_at,ACO1,ARF1,SAHH,TUA6,TUA7,β-tub1,β-tub10)进行实时荧光定量PCR的检测,发现表达模式均与芯片结果一致,说明芯片数据具有生物学意义上的可重复性,结果是可信的。本研究为以后克隆及功能验证纤维发育相关基因提供了重要参考。     

水稻极度分蘖突变体的分离和遗传学初步研究

通过EMS诱变处理栽培稻粳籼89(Oryza sative L.indica JX89)种子,从M2代植株中筛选得到一株突变体,其植株形态表现为叶细、色淡、植株矮化和极度分蘖.在将近一年的营养生长过程中,分蘖总数达到2000多个,命名为极度分蘖突变体(Excessive tillering mutant)ext 37.ext 37自交所得M 3和M4代植株表现同一表型.突变体自交及其与JX8     

转基因水稻品系‘Bt汕优63’微滴式数字PCR定量检测方法的建立

为进一步提升转基因水稻的定量检测效率,推动转基因定量标识制度的实施,对转基因水稻品系‘Bt汕优63’成分进行微滴式数字PCR法定量检测研究。基于转基因水稻品系‘Bt汕优63’的外源插入片段和水稻蔗糖磷酸盐合成酶基因SPS,选择、设计和合成高效特异性的内外源基因引物探针,用于微滴式数字PCR法扩增‘Bt汕优63’的内源基因和品系特异序列。引物探针优化实验表明,SPS60-F/R/P和‘Bt汕优63’品系基因-F/R/P适用于dd PCR双通道法定量检测‘Bt汕优63’成分。准确度验证试验表明,测得值与标准值相近,偏差分别为0.03、0.15、0.15、0.03。测得值的SD介于0.08~0.48之间,RSD介于4.86%~15.10%之间,小于欧盟要求25%,准确度较好。本研究建立的转基因水稻品系‘Bt汕优63’微滴数字PCR定量检测方法简便高效、准确度高,可用于农产品和食品中转基因水稻‘Bt汕优63’成分的定量检测。     

两个新的水稻Dwarf18基因强等位突变体的表型分析及分子鉴定

通过EMS诱变日本晴获得了s2-9和s1-146a两个矮秆突变体,其植株矮小,成熟期株高分别为日本晴的26.3%和19.2%;苗期叶片较宽,叶色深绿;穗型仍为散穗但穗长变短,粒型未发生改变。对水稻胚乳的α-淀粉酶诱导实验表明,这两个矮秆突变体与GA的信号传导途径无关,外源活性GA₃对水稻幼苗株高的促进实验显示它们应与赤霉素的生物合成有关。利用突变体与籼稻品种Dular分别杂交构建了F₂群体,精细定位表明这2个突变体的表型与水稻Dwarf18 (D18)基因紧密连锁。序列分析发现这两个矮秆突变体的D18基因均发生了突变：在s2-9突变体中D18基因的内含子3'' 拼接点发生单碱基突变,s1-146a中D18基因编码区的单碱基突变导致提前终止密码子的出现。RT-PCR结果显示,在s1-146a中D18基因表达明显增强,但在s2-9中未检测到D18基因的表达。     

MEF2a基因在肌肉组织中的表达研究

分别取90日龄、180日龄和270日龄大白猪心肌、背肌和腿肌,提取总RNA,设计并合成猪MEF2a引物,以β肌动蛋白作为内参,利用Real-time PCR方法检测不同日龄大白猪肌肉组织中MEF2a基因mRNA的表达。结果表明,不同日龄大白猪的心肌和背肌中,MEF2a基因mRNA的表达水平无显著差异,在腿肌中有显著差异（P<0.05）。从90日龄到270日龄,MEF2a基因在心肌、背肌和腿肌的表达水平均差异显著（P<0.05）,腿肌最高,其次是背肌,心肌最低。据此推测,MEF2a基因在猪成体后的肌肉组织中,主要是促进Ⅰ型肌纤维的生成,而不再是介导细胞分化。     

两个水稻D2基因等位突变体的表型分析及分子鉴定

通过EMS诱变粳稻品种日本晴,筛选到2个矮秆突变体s1-46和s1-96。突变体主要表现为株高降低,分别为野生型的44.7%和55.9%,且叶片直立,穗粒数减少,籽粒变短。暗处理时,野生型的中胚轴伸长,但突变体的不伸长,说明突变性状与油菜素内酯(BR)相关。外源活性BR处理后,突变体与野生型的叶夹角均变大,根长均变短,表明突变基因与BR的生物合成相关。遗传分析表明,该突变性状由1对隐性基因控制。通过与籼稻品种Dular杂交构建F₂群体,将该基因定位在第1染色体40.9 kb范围内。测序表明,该基因与参与BR生物合成的D2基因等位,其中s1-46第305位的氨基酸由脯氨酸突变成亮氨酸,而s1-96第370位的甘氨酸突变成谷氨酸。     

水稻根系不同强度干旱胁迫下5个基因表达分析

通过不同浓度的PEG处理,模拟不同强度的干旱胁迫,研究水稻幼苗根系中5个基因的表达情况,结果表明:不同强度干旱胁迫下,根系中各基因表达也各不相同,但是在轻度干旱和中等干旱胁迫下,主要以下调为主,少数表达上调,严重干旱胁迫下情况比较复杂,有基因以上调为主的(抗坏血酸过氧化物酶4基因、核内小RNAZ274基因、甲酸四氢叶酸连接酶基因),也有基因以下调为主的(木聚糖酶抑制子蛋白1前体基因),还有基因以上调为主,但是上调倍数不大,下调倍数很大(酸性内切几丁质酶基因);5个基因表达的日变化表现出6种类型,每种类型的日表达都是上下波动的;抗旱品种的水稻根系对不同强度的干旱可能采取不同的应对策略,对轻度干旱和中等干旱可能是减少不必要的能量和物质消耗,过度干旱、严重干旱胁迫下才调动大量抗逆相关物质,抵抗干旱的伤害。     

一个新的水稻逆境响应基因OsMsr1的表达与克隆

为深入了解植物的逆境反应机理和发现新的水稻耐逆基因, 采用Affymetrix水稻表达芯片(含51 279个转录本)分析了超级稻两优培九母本培矮64S不同生长发育时期、不同组织器官全基因组在低温、干旱、高温逆境胁迫下的表达水平, 筛选出众多表达水平显著升高与降低的基因。OsMsr1 (Oryza sativa L. multiple stresses responsive gene 1, GenBank登录号为EU284112) 是其中一个受高温、低温与干旱诱导、在各生长发育时期与组织器官均显著上调的基因, 用实时定量PCR方法对其表达水平进行了进一步的分析, 所得结果与基因芯片结果基本吻合, 因此, 此基因为一多逆境响应基因。用RT-PCR方法扩增获得了包含其完整ORF (open reading frame)的cDNA克隆。根据其ORF序列进行预测, 此基因编码一个包含89个氨基酸残基的小分子蛋白, 分子量约为10 kD, pI约为5。搜索有关数据库, 在水稻、玉米、小麦与拟南芥中找到有高相似性的基因, 但功能未知, 也未发现相同与类似的已知功能的基因保守结构域。对其可能的启动子序列分析, 发现5个与逆境反应有关的顺式作用元件。因此, 我们认为该基因为一新的水稻耐逆候选基因, 进一步的研究正在进行。     

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因(EU957447.1,2247 bp)核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长c DNA序列(Gen Bank登录号为KM114052)。序列分析结果表明,甘蔗Sc CIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,91~1631 bp),编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域(Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、Na Cl、ABA、SA和Me JA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。     

花生膜联蛋白基因AhAnn1的克隆与表达分析

为挖掘花生抗逆境胁迫相关基因,克隆抗逆相关膜联蛋白Annexin基因,以花生品种花育25号为试验材料,从已知抑制消减杂交文库中获得花生膜联蛋白Annexin类似基因片段,通过RACE技术获得Annexin基因5'-RACE片段。对5'-RACE序列和抑制消减杂交文库中已知基因片段进行拼接,设计特异引物通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到该基因,命名为AhAnn1。结果表明,AhAnn1全长为1 277 bp,开放阅读框为951 bp。根据编码区预测AhAnn1编码一条316个氨基酸组成的多肽,预测分子量为36.10 k Da,等电点为7.07。预测该基因编码的蛋白含有膜联蛋白Annexin保守结构域,定位于细胞质中。蛋白序列多重比对和系统发育分析表明,花生与大豆、苜蓿、鹰嘴豆等豆科植物中的膜联蛋白相似性最高,亲缘关系最近。荧光实时定量PCR结果显示,AhAnn1在根系和叶片中的表达量随干旱胁迫程度的增加而增加。由此推测AhAnn1是一种干旱胁迫应答基因,在花生逆境调控中发挥作用。结果为进一步研究花生AhAnn1基因的功能和花生抗逆境胁迫相关分子机理提供了理论基础。     

甘蔗CDK基因的cDNA全长克隆与表达分析

植物细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与周期蛋白(Cyclins)协同作用,是重要的细胞周期性调控因子。本研究从甘蔗受花叶病毒侵染的转录组数据库中获得一条与高粱(Sorghum bicolor)CDK基因(Gen Bank登录号为XP_002466536.1)高度同源的Unigene序列,通过RT-PCR扩增获得长度为1799 bp的甘蔗Sc CDK基因(Gen Bank登录号为KR258796)。序列分析显示Sc CDK基因含一个完整的开放阅读框(65~1603 bp),编码512个氨基酸,且具有CDK典型保守结构域,如ATP结合位点、磷酸结合位点及活化环A-loop。此外,生物信息学预测显示该基因编码的蛋白定位于细胞核,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与蛋白翻译。实时荧光定量PCR分析表明,Sc CDK基因的表达具有组织特异性,其在蔗芽上的表达量最高,其次是在蔗肉、蔗根、叶鞘和蔗皮中;在PEG、Na Cl和ABA的胁迫诱导过程中,Sc CDK均表现上调作用,且受ABA胁迫后表达量最高,约为对照组的1.9倍。推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关,同时受ABA的诱导,参与细胞周期分裂。     

羊踯躅psy基因的克隆及表达分析

[目的]为了研究羊踯躅psy基因的功能及其在花瓣着色中的分子机理,[方法]以羊踯躅花瓣的cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE方法克隆得到1 638 bp的psy基因全长cDNA序列,命名为RmPSY (GenKank登录号为KX230461)。[结果]序列分析表明,RmPSY开放阅读框为1 296bp,编码432个氨基酸。羊踯躅PSY为亲水性的不稳定蛋白,无信号肽,属于非分泌蛋白;预测的蛋白质分子量48.91 kD,等电点为8.78。RmPSY与GenBank中收录的其它植物PSY蛋白氨基酸的相似性达到81%。构建系统进化树,结果显示羊踯躅PSY与葡萄PSY蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在羊踯躅花发育的不同阶段均有表达,在花蕾期表达量较低,在初开期表达量最高,盛开期表达量有所下降。[结论]试验结果为进一步揭示RmPSY基因参与调控羊踯躅花色形成的分子机制奠定基础。     

一个新的水稻逆境响应基因OsMsr1的表达与克隆

为深入了解植物的逆境反应机理和发现新的水稻耐逆基因, 采用Affymetrix水稻表达芯片(含51 279个转录本)分析了超级稻两优培九母本培矮64S不同生长发育时期、不同组织器官全基因组在低温、干旱、高温逆境胁迫下的表达水平, 筛选出众多表达水平显著升高与降低的基因。OsMsr1 (Oryza sativa L. multiple stresses responsive gene 1, GenBank登录号为EU284112) 是其中一个受高温、低温与干旱诱导、在各生长发育时期与组织器官均显著上调的基因, 用实时定量PCR方法对其表达水平进行了进一步的分析, 所得结果与基因芯片结果基本吻合, 因此, 此基因为一多逆境响应基因。用RT-PCR方法扩增获得了包含其完整ORF (open reading frame)的cDNA克隆。根据其ORF序列进行预测, 此基因编码一个包含89个氨基酸残基的小分子蛋白, 分子量约为10 kD, pI约为5。搜索有关数据库, 在水稻、玉米、小麦与拟南芥中找到有高相似性的基因, 但功能未知, 也未发现相同与类似的已知功能的基因保守结构域。对其可能的启动子序列分析, 发现5个与逆境反应有关的顺式作用元件。因此, 我们认为该基因为一新的水稻耐逆候选基因, 进一步的研究正在进行。