木薯MeSWEET3b的基因克隆及功能分析

SWEET基因家族是近年新发现的一类糖转运蛋白家族,对植物的生长发育、激素平衡及植物与微生物互作等方面有着重要的调控作用。为了探索木薯SWEET基因的功能,本研究通过RT-PCR的方法从木薯主栽品种‘华南9号’(SC9)的叶片中克隆得到了木薯MeSWEET3b基因,并对其进行了生物信息学分析和功能的初步探究。结果表明,木薯MeSWEET3b蛋白具有典型的SWEET蛋白结构域的特征,含有2个Mt N3＿slv结构域和7个跨膜螺旋;MeSWEET3b与拟南芥AtSWEET3基因、水稻OsSWEET3a、OsSWEET3b基因高度同源,都属于CladeⅠ的第一分支;木薯MeSWEET蛋白定位在细胞膜上,且行使转运半乳糖的功能。此外,木薯MeSWEET3b基因还受到木薯黄单胞菌Xam的诱导而高表达。本研究明确了木薯SWEET家族成员MeSWEET3b转运半乳糖这一重要功能,且受到病原菌Xam的诱导表达。本实验结果为进一步揭示木薯体内光合产物从源到库的运输分配以及木薯与微生物互作机理提供了理论依据。     

木薯EIL基因克隆和蛋白诱导表达及纯化

ETHYLENE INSENSITIVE3-LIKE(EIL)基因家族是乙烯信号通道重要的正调控因子,在乙烯信号传递过程中启动抗病相关基因表达参与植物免疫应答提高植物的抗性。为了研究EIL基因编码蛋白与下游靶基因特异性结合传递乙烯信号,是否参与木薯抗逆境胁迫的调控,本研究从木薯中克隆一个EIL同源基因,命名为MeEIL。分析MeEIL启动子所包含的各种功能元件,结果显示该启动子中含有G-box、W box和MYC等元件。对MeEIL基因的ORF分析结果表明该基因编码含621个氨基酸残基的蛋白质。使用同源重组的方法将MeEIL的CDS序列连接到蛋白表达载体pET32a上。SDS-PAGE检测表明在28℃和16℃都可成功诱导蛋白表达,且28℃诱导效果更佳,通过大量诱导蛋白表达并用His标签纯化试剂盒纯化,Western blot分析验证MeEIL蛋白被成功的诱导出来。     

基于木薯全基因组重测序的InDel标记开发及应用

本研究旨在开发稳定可靠、操作简便的木薯In Del分子标记,为木薯种质资源遗传多样性研究、品种鉴定等工作提供有力工具,为木薯育种发展提供保障。本研究基于22份木薯种质资源全基因组重测序分析结果随机挑选了64个In Del分子标记进行引物设计并利用琼脂糖凝胶电泳检测进行有效性验证,结果有20对引物具有多态性,多态性率为31.25%。随后将具有多态性的且扩增效果最优的18个InDel标记扩增条带数进行统计生成矩阵用于木薯种质资源遗传多样性研究,各标记的基因多样性指数于0.21～0.50之间,香农多样性指数于0.36～0.70之间。聚类结果分析将72份木薯材料在遗传相似系数0.62处划分为2大类群。且将中国的地方品种及选育品种大多划分至1#中的同一分支,其余薯肉颜色及内皮颜色相同的木薯材料大多都聚类到了一起。此外,本研究开发出的In Del分子标记IDC46具有特异性,可用于特定木薯材料鉴定。说明后期InDel引物有望成为木薯指纹图谱及分子身份证构建的有效工具,本研究结果也将对木薯育种工作后续开展具有一定的参考意义。     

木薯MeRSZ21a的克隆、生物信息学分析和表达模式分析

在非生物胁迫过程中,植物中SR蛋白(serine/arginine-rich proteins, SR)发挥着重要作用。本研究利用生物信息学分析方法,对木薯MeRSZ21a基因结构、理化性质、结构域、保守基序、系统进化等方面进行了分析,并分析MeRSZ21a在各组织中的表达,以及胁迫后其剪接模式和表达水平。我们之前的研究表明,木薯MeRSZ21a是SR蛋白家族中RSZ亚家族的成员之一。本研究结果表明MeRSZ21a基因全长为2 263 bp,编码160个氨基酸,蛋白大小为18 kD,属于亲水性碱基蛋白。MeRSZ21a含有RRM和zf-CCHC结构域,与野生大豆亲缘关系最近。在3个木薯品种‘W14’、‘Arg7’和‘Ku50’各组织中,MeRSZ21a在发育前期组织中表达量较低,在成熟的侧芽与叶组织器官中表达量较高。胁迫处理后,MeRSZ21a的转录本及表达量发生较大变化,其中叶片中转录本数均上升,并且对木薯进行不同温度(42℃,-3℃)胁迫处理后,根和叶中MeRSZ21a的表达水平显著性上调,表明在响应胁迫过程中,MeRSZ21a发挥着重要作用。这有助于进一步探索木薯MeRSZ21a在植物响应非生物胁迫中的功能。     

木薯金属硫蛋白基因的克隆和表达分析

金属硫蛋白(metallothionein,MT)分子量小,半胱氨酸含量高,具有消除离子自由基,减弱重金属毒性和减少体内活性氧积累等功能。为探究木薯金属硫蛋白基因(MeMT)的原核表达能力和对活性氧的耐受性,本研究通过木薯cDNA克隆获取MeMT并将其连接至pET-28a,在BL21(DE3)菌株中成功诱导其表达。H2O2耐受性分析发现,与空载菌株相比,表达MeMT蛋白的DE3菌株对H2O2的耐受水平较高。RT-qPCR技术检测显示,在H2O2胁迫下,3 h时木薯叶片中MeMT的表达水平明显升高,但6 h时恢复甚至略低于对照组,证明MeMT在木薯中参与ROS应答过程。该结果对研究木薯抗逆性和产量的提高具有重要意义。     

木薯Ⅴ型几丁质酶MeCHITVb基因克隆及其表达载体构建

几丁质酶在生物逆境环境和非生物逆境环境中发挥着重要作用.为研究木薯几丁质酶在响应低温胁迫下的分子作用机制,利用RT-PCR技术,从木薯耐低温品种SC124中克隆到CHITVb基因,利用平末端连接技术构建pEASY-MeCHITVb克隆载体,用于测序确定目标基因序列,并对其序列进行分析,构建植物表达载体.结果 表明,成功克隆木薯CHITVb基因,命名为MeCHITVb.通过生物信息学分析,该基因全长1050 bp,编码349个氨基酸,理论相对分子量为38.08 kD,理论等电点为4.53,是一种稳定蛋白.经序列比对和系统进化树分析表明,MeCHITVb基因与烟草、拟南芥V型几丁质酶基因亲缘关系最近.用pEASY-MeCHITVb与植物表达载体pISV2678构建重组子pISV-MeCHITVb,利用"Golden Gate"克隆方法构建基因编辑载体CRISPR/Cas9-MeCHITVb.将植物过表达的pISV-MeCHITVb和CRISPR/Cas9-MeCHITVb载体成功转化为根状杆菌LBA4404.本研究为后续MeCHITVb基因功能研究、木薯抗寒、抗病品种的选育及木薯北移栽培提供理论依据.     

木薯钾离子通道蛋白MeAKT1的基因克隆及转基因拟南芥构建

钾元素参与植物体多种重要的生理功能。AKT1作为钾离子(K+)通道中的重要组分,介导拟南芥根对钾离子的吸收,然而木薯中的AKT1基因尚未被克隆。为探究木薯AKT1基因的功能,本研究通过qRT-PCR检测低钾处理后木薯中AKT1基因的表达量,发现木薯中AKT1基因的表达量在低钾处理后升高,可知木薯AKT1基因在木薯响应低钾胁迫中发挥作用。通过PCR扩增获得木薯AKT1基因的目的片段,将该片段连接到过表达载体pEGAD中,转化到拟南芥,获得转基因植株,并对木薯AKT1基因的启动子区域进行分析。这将为进一步研究木薯中AKT1基因的生理功能及其在木薯抗低钾胁迫中的作用机制提供帮助。     

木薯(Manihot esculenta)AKT1基因的克隆及生物信息学分析

植物细胞中的K^+通道蛋白AKT1(Arabidopsis K^+transpoter 1)主要负责吸收K^+。本研究基于木薯基因组数据库信息,利用PCR技术从木薯中克隆一个MeAKT1基因,该基因全长2634 bp,编码877个氨基酸,生物信息学分析表明MeAKT1含有10个外显子和9个内含子,编码的氨基酸分子量为99.02 kD,等电点为8.43,属于稳定蛋白。MeAKT1包含有5个跨膜区域,N端含有1个Ion_trans结构域,C端有1个KHA结构域,其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,进化树分析发现MeAKT1与蓖麻RcAKT1的亲缘关系最近。通过对MeAKT1蛋白的生物信息学分析有助于下一步深入研究MeAKT1在木薯耐贫瘠过程中的功能。     

木薯MeVINV1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建及验证

液泡转化酶(vacuolar invertase, VINV)是参与植物蔗糖代谢、器官发育的关键酶之一。木薯MeVINV1在块根发育及淀粉积累阶段的表达活跃,对该基因进行编辑敲除,将有助于解析MeVINV1在木薯块根淀粉积累过程中的作用。本研究构建了MeVINV1的CRISPR/Cas9基因编辑载体,转化木薯脆性胚性愈伤组织以验证载体的编辑效果。结果发现：转化后的样品中,MeVINV1基因靶点位置出现测序多峰,而未转化样品中没有多峰出现,表明本研究构建的基因编辑载体可对MeVINV1基因进行编辑;检测分析潜在脱靶位点的序列,发现未出现脱靶现象。该研究为获得MeVINV1基因的突变体,明确其在木薯块根发育及淀粉积累过程中的功能奠定了基础。     

木薯叶芽和花芽的转录组差异分析

本研究以木薯花芽与叶芽为材料,通过Illumina HiSeqTM4000测序平台对其进行转录组测序,结果获得高质量序列45 010 506个、碱基数13.46 Gb,GC含量在43.5%以上、比对效率在78%以上。筛选得到3 782个差异表达基因(DEGs),其中上调2 409个、下调1 373个。DEGs涉及的主要功能有一般功能预测,翻译,复制、重组与修复,信号传导机制,次生产物合成、运输与代谢,翻译后修饰、蛋白质周转和分子伴侣,氨基酸运输与代谢,碳水化合物运输与代谢。DEGs显著富集的KEGG通路主要有植物激素信号传导、苯丙烷类生物合成、淀粉和蔗糖代谢、苯丙氨酸代谢、氨基酸的生物合成和碳代谢。获得植物开花相关基因47个,其中39个上调表达、8个下调表达。研究结果在一定程度上解析了木薯花芽分化的分子机制,并为后续的深入研究提供了基础数据。     

Genotypic Variability in Adaptation Responses of Selected Clones of Cassava to Drought Stress in the Sudan Savanna Zone of Nigeria

Identification of drought‐tolerant and ‐resistant varieties of cassava is of paramount importance for the maximization of productivity potential in drought‐prone areas. Nine improved cassava varieties developed in humid and subhumid agro‐ecologies were evaluated for their growth responses and adaptability in the dry savannas of Nigeria. Field trials were set up in two cropping seasons at three different locations. Parameters evaluated included fresh root yield (FRY), fresh shoot yield (FSY), cumulative leaves formed (CLF), cumulative leaf scars (CLS), root dry‐matter content (DMC), harvest index (HI), and root cyanogenic potential (CNp). Results demonstrated that varietal response differed with water table site, implying different adaptation responses of varieties to the water regime. Variations in all characters studied were significantly (P<0.05) influenced by genotype, suggesting a strong genetic basis for the phenotypic differences amongst varieties. Compared with variation attributable to location, the genotypic components were strong for FRY, FSY, CLF, CLS, HI and DMC. HI and DMC were not significantly affected by location. CNp tended to increase with increasing drought stress. The significance of genotype × environment effects for FRY suggested that genotypes may be selected for specific adaptation for drought‐prone environments. The poor adaptability responses of the majority of the varieties implied that an agro‐ecologically targeted breeding scheme for the dry savanna would be a more appropriate approach for the development of drought‐tolerant varieties.     

稻瘟病菌杂交后代致病性遗传分析

为明确稻瘟病菌杂交后代对水稻致病性的遗传规律,以亲本菌株HLJ6122和KA3杂交产生的后代群体为试验材料,将其接种于14个单基因系抗性水稻品种,对杂交后代进行毒性差异分析。结果表明,64个杂交后代菌株呈现显著的毒性分离,共出现53种毒性类型,无毒性/毒性分别表现为1∶1、1∶3、3∶1、15∶1。菌株KA3分别对IRBLi-F5、IRBLta-K1、IRBL12-M、IRBLta2-Pi持有1个无毒基因;对品种IRBLa-A、IRBLzt-T、IRBL7-W、IRBLkm-Ts、IRBL20-IR24持有2个无毒基因。64个后代菌株对品种IRBLk-Ka、IRBLz-Fu、IRBL19-M、IRBLb-B、IRBLkp-K60无毒性/毒性也符合1∶3,但2个亲本菌株HLJ6122和KA3对供试水稻品种致病性相同,因此难以判断无毒基因的来源。     

Mechlppdk基因在木薯中的表达分析及RNA干扰载体构建和遗传转化

本研究为了明确丙酮酸磷酸双激酶(ppdk)在木薯中的表达谱,创制Mechlppdk的干扰株系,以期为Mechlppdk的功能研究提供材料.本研究以栽培型木薯Arg7为材料,用qPCR的方法分析Mechlppdk在木薯根、茎、叶中的表达谱;采用RNA干扰的方法,构建Mechlppdk的干扰载体,并遗传转化木薯脆性愈伤,经...     

木薯低温诱导基因MeLTI6A的克隆与序列分析

为了研究木薯(Manihot esculenta Crantz)的抗逆境胁迫机制,从水稻低温诱导及抗旱基因OsLTI6A出发,同源克隆了木薯的抗逆基因MeLIT6A,并对其序列和功能进行了分析研究。MeLIT6A的基因组序列全长为273 bp,其中ORF长度为173 bp,内含子长度为99 bp;编码1个含有57个氨基酸残基的蛋白,含有1个与Pmp3超级家族同源性极高的保守区域。该基因推导蛋白MELTI6A与蓖麻的、拟南芥的、水稻的、玉米的低温诱导蛋白基因6A (LTI6A)的推导蛋白的同源性分别为：89.7%。81.0%、74.1%和87.9%。蛋白功能分类预测MELTI6A是1个非酶类的、疏水性较高的、有2个透膜区域的蛋白,可能有转运蛋白和作为受体蛋白的功能,与拟南芥的AtLTI6A的功能相似。