泸定百合泛素基因(Ls-Ub)的克隆及表达分析

泛素(ubiquitin,Ub)与植物对外界的多种胁迫反应相关。为了研究百合中的泛素基因与百合抗镰刀菌病害的关系,本研究根据百合尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.lilii)诱导的泸定百合(Lilium sargentiae Wilson)SSH文库中筛选到的Ub EST序列,通过RACE结合RT-PCR技术从泸定百合中克隆到1个Ub基因全长c DNA序列,该基因全长996 bp,包含一个长690 bp编码229个氨基酸的开放阅读框,命名为Ls-Ub(Gen Bank登录号:KY996308)。序列比对分析结果表明Ls-Ub与其它物种Ub基因编码的氨基酸序列具有高度的相似性。Q-PCR结果显示百合镰刀菌诱导后Ls-Ub强烈上调表达,且明显高于水处理对照的表达水平。推测该基因可能与百合抗镰刀菌病害相关。本研究将为揭示百合抗镰刀菌枯萎病的分子机制提供一定理论依据。     

玉米丝氨酸羧肽酶基因(ZmSCP)的克隆及表达分析

丝氨酸羧肽酶(serine carboxypeptidases, SCP)基因在植物生长发育及抗病性方面起着重要作用。本研究在立枯丝核菌胁迫24 h后, 以RT-PCR技术和RACE技术克隆玉米丝氨酸羧肽酶基因全长cDNA序列, 命名为ZmSCP。结果显示, 该基因全长为1874 bp (GenBank登录号为JF682634), 开放阅读框为999 bp, 编码332个氨基酸, 相对分子量为36.505 kD, 等电点为4.75。ZmSCP基因编码蛋白与其他高等植物中该蛋白具有一定的同源性, 同源性比例范围为42%~81%。进化树分析表明ZmSCP基因与水稻、高粱亲缘关系较近, 属于同一进化分支。ZmSCP基因编码蛋白序列保守结构域分析显示该基因编码产物具有S10结构域, 属于S10超家族。半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR结果表明, ZmSCP基因在立枯丝核菌、ABA、JA、低温、高盐胁迫条件下, 总体均呈诱导表达的趋势。其中, 在立枯丝核菌AG1-IA诱导下, ZmSCP基因表达呈两步诱导趋势, 第1次诱导出现在接菌后24 h, 然后下降, 第2次诱导出现在接菌后60 h。在ABA、JA、低温和盐胁迫下, ZmSCP基因表达均呈现上调趋势, 表达高峰均出现在胁迫后48 h。     

甘蔗中性/碱性转化酶基因(SoNIN1)的克隆和表达分析

中性/碱性转化酶(Alkaline/Neutral Invertase)能不可逆地催化蔗糖分解为葡萄糖和果糖, 在植物生长发育中起重要作用。本研究采用RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种GT28心叶中克隆到甘蔗中性/碱性转化酶基因全长cDNA序列, 基因命名为SoNIN1。该基因全长2289 bp (GenBank登录号为JX109944), 开放阅读框为1812 bp, 编码603个氨基酸, 相对分子量为67.79 kD, 等电点为6.41。具有中性/碱性转化酶保守结构域, N-端不含跨膜结构和信号肽。其编码氨基酸序列与玉米、水稻和黑麦草的亲缘关系较近, 属于同一进化分支。利用染色体步移技术克隆到SoNIN1基因5¢侧翼启动子序列, 长度为1174 bp (GenBank登录号为KC854419)。启动子序列含有多个CAAT-box和TATA-box等基本作用元件, 参与分生组织特异性激活, 参与干旱诱导的MYB结合位点, 脱落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素响应等作用元件。利用实时荧光定量PCR技术, 在生理成熟期甘蔗茎、叶、花序和芽中均能检测到SoNIN1的表达, 其表达量在叶中最高, 芽中次之, 而在+1节间最低。苗期根和叶中SoNIN1基因都受PEG和NaCl诱导表达。     

烟草耐低温胁迫早花NtMYB15的克隆及功能分析

为研究哪些基因参与低温胁迫诱导烟草提前开花,本研究根据烟草芯片数据和PCR扩增获得烟草NtMYB15基因的全长846 bp CDS序列。蛋白序列比对结果显示该基因在进化过程中高度保守。将该基因322 bp的片段克隆至RNAi载体p Hellsgate12中,并通过叶盘法将该基因转入烟草K326中。对两个独立的转基因株系及非转基因植株进行低温胁迫处理,结果表明,与非转基因植株相比,RNAi转基因植株的开花时期被延迟。因此,本研究将为培育烟草耐早花品种提供有价值的研究信息。     

花生果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因AhFBA1的克隆与表达

以花生品种花育33为试材, 根据cDNA文库中已知的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 (fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA) 基因全长序列设计引物, 通过RT-PCR克隆到该基因, 命名为AhFBA1。AhFBA1全长为1489 bp, 开放阅读框为1200 bp, 编码400个氨基酸。预测该基因编码的蛋白含有Glycolytic保守结构域, 可能定位于叶绿体中。蛋白序列比对和进化树分析表明, 花生与大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago truncatula)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)和菜豆(Phaseolus vulgaris)等豆科植物中的FBA序列相似性最高, 亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示, 在高盐和干旱胁迫下, AhFBA1在花生叶和根中的表达均受明显诱导, 说明该基因可能参与花生对高盐和干旱胁迫的适应性调控; AhFBA1在花生根和叶中均受ABA的明显诱导, 说明该基因对花生非生物胁迫的调控可能是依赖ABA的。     

三七NAC转录因子基因PnNAC1的克隆及表达特性分析

为了揭示三七抗病防卫反应的调控机制,对三七的一个NAC转录因子的全长cDNA进行了克隆和表达特性分析。以一年生三七幼苗为材料,根据编码NAC转录因子的三七转录组Unigene设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到一个新的NAC转录因子基因,命名为PnNAC1。序列分析表明,该基因全长815 bp,含有24 bp的5'非翻译区和215 bp的3'非翻译区,以及576 bp开放阅读框,共编码191个氨基酸,具有保守的NAC结构域。实时荧光定量PCR结果显示茉莉酸甲酯预处理三七根部大幅提高了PnNAC1在根中的转录水平,接种茄腐镰刀菌后,PnNAC1的表达进一步上升,在接种后4 h转录水平达最大值;无菌水预处理的三七中,PnNAC1也快速响应茄腐镰刀菌的侵染,但表达水平明显低于茉莉酸甲酯预处理的样品。接种人参链格孢后PnNAC1在叶片的表达量受抑制。茉莉酸甲酯、乙烯利、水杨酸和过氧化氢4种信号分子处理三七根部均诱导PnNAC1的表达。表明PnNAC1响应几种逆境相关信号分子,并参与三七对茄腐镰刀菌和人参链格孢的防卫反应。     

香蕉枯萎病病原菌海藻糖合成酶基因tps1

为了解tps1基因在尖镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间及与其他镰刀菌之间的差异,分析推测tps1基因与两生理小种之间的寄主选择性差异的关系,通过比对现有镰刀菌属的海藻糖合成酶基因序列,参照尖孢镰刀菌番茄专化型的tps1基因序列设计并合成引物,采用PCR和RT-PCR方法扩增了两个生理小种的tps1基因并测序进行比较分析,同时对香蕉与粉蕉苗诱导两个生理小种后的tps1基因表达量变化进行分析。结果表明,两个生理小种tps1基因全长均为1660 bp,开放阅读框均为1605 bp,编码535个氨基酸,基因序列间仅存在两个碱基位点的差异,编码蛋白间无差异;两生理小种的tps1基因序列与镰刀菌属其他种间存在较大的差异,经寄主诱导后的两个生理小种的tps1基因表达量呈现不同的变化。从tps1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列在两生理小种之间的差异性分析结果推测,两个生理小种寄主选择性差异与tps1基因并无明显对应关系,这为进一步研究tps1基因与病菌在无寄主下的长期生存的关系奠定了基础。     

姜荷花叶绿素降解酶基因PPH的克隆与生物信息学分析

为了获得姜荷花叶绿素降解的关键酶基因PPH信息,本试验在前期通过姜荷花全长转录组测序获得大量转录组信息的基础上,进行筛选分析,获得了2条PPH基因,分别命名为PPH1和PPH2。PPH1基因(GenBank:MT077178),cDNA序列全长1 795 bp,开放阅读框1 437 bp (138～1 574 bp),编码一条478 aa的氨基酸序列。PPH2基因(GenBank:MT077179),c DNA序列全长1 393 bp,开放阅读框1 227 bp (70～1 296 bp),编码一条408 aa的氨基酸序列。采用BLAST、Translate tool (ExPASy)、Clustal Omega、Find Conserved Domains(NCBI)、ProtParam、TMHMM Server、SOPMA、SWISS-MODEL、ClustalX (1.81)、MEGA 4.1等预测和分析了这2个基因编码蛋白氨基酸的一级结构(包括氨基酸序列的组成,保守区,理化特征等)、二级结构、三级结构及分子系统进化关系。PPH1和PPH2的核苷酸与蛋白氨基酸序列与其它物种的PPH基因都具有很高的同源性,两者都包含有水解酶(Hydrolase)特征PLN02578的保守区。分子系统进化分析表明,姜荷花的PPH1和PPH2聚为一小类,然后与小果野芭蕉PPH (XP_018677219.1)的亲缘关系最为接近,而与双子叶植物的关系较远。本研究为后期通过遗传转化手段改良姜荷花不育苞片的颜色提供了分子基础。     

花生病程诱导蛋白基因AhPIP1和启动子的克隆、序列分析及原核表达

本文采用RACE法克隆了花生病程诱导基因(pathogenesis-induced protein gene)全长,命名为AhPIP1,并在GenBank登录,登录号为EU860093.序列分析表明该基因的开放读码框579 bp,编码193个氨基酸.以YY20基因组DNA为模板PCR扩增获得AhPIP1基基因组序列长1 883 bp,包含3个外显子和长度分别为602 bp和600 bp的2个内含子.同源性比较发现AhPIP1与辣椒病程诱导蛋白CaPIP1(ABF72432,AAT35532)相似性达82%.采用Genome Walldng方法获得AhPIP1启动子,序列分析表明该启动子序列长513 bp,包含干旱胁迫、病程胁迫应答元件和生长素、赤霉素应答元件.构建pET32a-AhPIP1原核表达载体,转化表达受体菌Ecoli BL21,原核表达获得大小约40 kD AhPIPl融合蛋白,与推测的AhPIP1基因编码产物的大小一致,表明AhPIP1基因在大肠杆菌中能够表达.     

甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因的克隆及菌核病菌诱导表达

依据拟南芥、芥菜型油菜和白菜已知超氧化物歧化酶(SOD)保守序列设计引物,用同源序列法和RT-RACE技术克隆甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因,经序列分析和基因片段拼接,得到Cu/ZnSOD和FeSOD基因的全长cDNA,分别为756 bp (GenBank登录号AY970822)和1 037 bp (GenBank登录号EF634058)。以cDNA序列设计引物,获得1 322 bp的Cu/ZnSOD基因组DNA (GenBank登录号DQ431853)和1 659 bp的FeSOD基因组DNA (GenBank登录号EF634057)。生物信息学分析表明,Cu/ZnSOD基因ORF框长459 bp,编码152个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有7个外显子和6个内含子。而FeSOD基因ORF框长792 bp,编码263个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有8个外显子和7个内含子。二者外显子和内含子交接处完全符合GT/AG规则。利用获得的Cu/ZnSOD的cDNA片段作探针,对菌核病菌诱导甘蓝型油菜叶片的mRNA进行Northern blotting分析,结果显示在同一品种(系)中菌核病菌诱导后Cu/ZnSOD mRNA表达量比诱导前升高,抗(耐)型油菜Cu/ZnSOD mRNA表达量明显高于感病型。油菜叶片SOD酶活性分析结果也获得了完全一致的结果。以上结果表明,甘蓝型油菜SOD基因与菌核病抗性相关。     

冬瓜枯萎病菌核糖体rDNA ITS区的克隆与序列分析

采用镰刀菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物,PCR扩增冬瓜枯萎病菌核糖体基因ITS区,并对产物进行克隆和序列分析;利用Mega 4.1软件对序列及GeneBank中以葫芦科为寄主的镰刀菌不同专化型ITS序列进行聚类。冬瓜枯萎病菌ITS全长1 063 bp,其中包括18S rDNA一部分序列,5.8S rDNA,ITS1和ITS2全部序列及28S rD-NA部分序列。聚类结果将15个菌株ITS序列划分为2个类群,类群I包括4个菌株,分别为2个西瓜枯萎病菌株和2个甜瓜枯萎病菌株;类群II包括11个菌株,其中冬瓜枯萎病菌株就在该类群中,其余为甜瓜枯萎病菌株5个、西瓜枯萎病菌株3个、黄瓜枯萎病菌株、丝瓜枯萎病菌株和葫芦枯萎病菌株各1个。     

橡胶树炭疽菌CsPbs2基因的原核表达分析

HOG MAPK途径参与植物病原真菌生长发育、致病和对杀菌剂敏感性等过程,CsPbs2基因是HOG MAPK信号通路的关键成员。为研究CsPbs2蛋白的互作蛋白及其调控机制,本研究克隆了橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense) CsPbs2基因,构建融合蛋白表达载体,利用SDS-PAGE和Western Blot检测蛋白表达。结果显示橡胶树炭疽菌(C. siamense)的CsPbs2基因全长2 051 bp,编码667个氨基酸,包含个1个内含子,具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域。CsPbs2基因在进化关系上与球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的Pbs2基因有最近的亲缘关系。构建的GST-CsPbs2蛋白融合表达载体在供试条件下(IPTG:0.6 mmol/L, 0.8 mmol/L,1.0 mmol/L温度16℃和25℃)均可较好诱导表达,GST-CsPbs2融合蛋白大小约为96 kD。用GST亲和层析柱纯化获得蛋白,经Western Blot检测显示该蛋白可与GST单克隆抗体特异性结合。本研究成功构建了GSTCsPbs2蛋白融合表达载体,纯化得到GST-CsPbs2融合蛋白,为后续利用Pull-down技术钓取Cs Pbs2的互作蛋白提供基础。     

陆地棉GhCYP1基因的分离及其表达分析

应用SSH-PCR技术,在筛选到抗旱相关基因的EST序列基础上,采用RACE技术,分离克隆到全长为801bp,含编码序列(CDS)为522 bp的棉花抗旱相关基因GhCYP1.氨基酸序列比对发现,该基因与拟南芥、水稻、人等的亲环蛋白基因高度同源,都具有由11个连续氨基酸所组成的单结构域亲环蛋白典型结构,且在保守区都具有...     

桂花查耳酮合酶chs基因的克隆及序列分析

克隆与桂花(Osmanthus fragrans)花色形成相关基因查耳酮合酶(Ofchs),并对该基因的序列特征、进化关系进行分析,为探究该基因在桂花花色形成中的功能提供理论依据。以桂花‘丹桂’品种为试材,采用RT-PCR和RACE方法克隆丹桂查耳酮合酶(chalcone synthase,chs)基因c DNA全长。利用NCBI和DNAMAN分析软件,对该基因进行核苷酸序列以及氨基酸序列的分析,利用DNAMAN软件直接构建系统进化树,以分析该基因在不同物种间的进化关系。结果表明:从‘丹桂’花瓣中成功获得了1个丹桂查耳酮合酶基因c DNA全长,该基因全长为1383 bp,包含48 bp的5′非编码区、162 bp的3′非编码区和1个长度为1173 bp编码390个氨基酸的开放阅读框。序列分析表明,该基因具有Cysl64、His303和Asn3363个活性位点及2个决定底物特异性的苯丙氨酸残基Phe215、Phe265。该基因也具有查尔酮合酶家族的2条特征多肽序列:RFMMYQQGCFAGGTVLR和GVLFGFGPGL。Blast序列分析显示,该基因与同属木犀科的油橄榄相似性达95%,与其他双子叶植物的相似性达72%~76%。克隆出的丹桂chs基因属于查尔酮合酶家族,系统进化分析表明,该基因聚类具有明显的种属特性,桂花与唇形科等植物的chs亲缘关系较近,相似性达76%以上,符合植物分类学分类,为今后探究该基因在花色行形成中的作用机制奠定了基础。     

虹鳟鱼NDK-1 基因cDNA的克隆与序列特征分析

以虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了虹鳟鱼NDK-1基因cDNA的全长序列(GenBank登录号:(FJ607868).序列全长953 bp,其中5'端非翻译区(5'-UTR)长45 bp,3'端非翻译区(3'-UTR)长284 bp,开放性阅读框(ORF)长624 bp,编码207个氨基酸.虹鳟鱼NDPK蛋白序列与几种脊椎动物台湾樱花钩吻鲑、斑马鱼、西方爪蟾、非洲爪蟾、人和黑青斑河的同源性分别为95%,72%,68%,68%,65% 和 64%,表明NDK-1基因在进化过程中是高度保守的.     

白菜型冬油菜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及其在低温条件下的表达分析

超氧化物歧化酶(SOD)是一种逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶,而铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是该酶系中最主要的活性氧清除剂,与植物的抗逆性关系密切。本研究根据已发表的十字花科植物Cu/Zn-SOD基因的编码区设计引物,采用RT-PCR克隆超强抗寒冬油菜陇油7号Cu/Zn-SOD的cDNA序列,该基因全长459 bp。生物信息学分析表明,该基因与甘蓝型油菜(Brassica napus) Cu/Zn-SOD基因同源性高达99%,编码1个亲水性稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽,具有胞质Cu/Zn-SOD超基因家族特有的序列特征和保守结构区域。半定量RT-PCR以及SOD酶活性分析表明,低温诱导条件下Cu/Zn-SOD基因差异表达,在白菜型冬油菜适应低温胁迫过程中发挥重要作用。超强抗寒冬油菜陇油6号品种低温诱导蛋白的SDS-PAGE分析以及蛋白串联质谱技术鉴定表明Cu/Zn-SOD是受低温诱导表达的抗逆基因。     

棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因的克隆及低温下的表达分析

根据棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase, SAMDC)基因已知EST序列设计引物,采用RACE和RT-PCR技术克隆获得该基因的全长cDNA序列,命名为GhSAMDC (GenBank登录号为JN020148)。生物信息学分析表明,GhSAMDCcDNA序列全长1 874 bp,涵盖tiny ORF (tORF)、upstream ORF (uORF)和main ORF (mORF) 3个植物SAMDC基因特征ORF。其中mORF长1 064 bp,编码含355个氨基酸残基的SAMDC酶原,预测分子量为38.25 kD,该酶原含有高度保守的酶原剪切位点结构域(LSESSLF)和与SAMDC蛋白快速降解有关的PEST (TIHVTPEDGFSYAS)结构域。GhSAMDC基因组DNA序列全长2 743 bp,包含3个内含子,均位于5'' UTR,其中一个位于uORF内。聚类分析表明,GhSAMDC与葡萄中该蛋白的同源关系最近,并且与其他双子叶植物聚为一类。荧光定量PCR分析结果表明,GhSAMDC表达受低温诱导,在冷敏感品种新陆早1号中基因表达水平明显高于在耐冷品种新陆早33号中。     

白菜型冬油菜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及其在低温条件下的表达

超氧化物歧化酶(SOD)是一种逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶,而铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是该酶系中最主要的活性氧清除剂,与植物的抗逆性关系密切。本研究根据已发表的十字花科植物Cu/Zn-SOD基因的编码区设计引物,采用RT-PCR克隆超强抗寒冬油菜陇油7号Cu/Zn-SOD的cDNA序列,该基因全长459 bp。生物信息学分析表明,该基因与甘蓝型油菜(Brassica napus)Cu/Zn-SOD基因同源性高达99%,编码1个亲水性稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽,具有胞质Cu/Zn-SOD超基因家族特有的序列特征和保守结构区域。半定量RT-PCR以及SOD酶活性分析表明,低温诱导条件下Cu/Zn-SOD基因差异表达,在白菜型冬油菜适应低温胁迫过程中发挥重要作用。超强抗寒冬油菜陇油6号品种低温诱导蛋白的SDS-PAGE分析以及蛋白串联质谱技术鉴定表明,Cu/Zn-SOD是受低温诱导表达的抗逆基因。     

西藏青稞LEA3蛋白新抗旱基因的克隆与序列分析

以强抗旱青稞冬青8号和弱抗旱青稞品比14为材料,将幼苗经干旱诱导处理12 h提取总RNA,RT-PCR同源克隆到2个有差异的LEA3蛋白抗旱基因的全编码框序列。冬青8号、品比14的LEA3蛋白基因序列全长分别为661 bp和694 bp,其中,来源于品比14的LEA3蛋白基因编码框全长639 bp,编码含213个氨基酸残基的蛋白质,该多肽含有9个重复的、由11个氨基酸残基组成的保守基元序列。而来源冬青8号的LEA3蛋白基因与之相比较除缺少33 bp核苷酸外,另有6个碱基的差异,所编码的蛋白质也相应地缺少第4个保守基元序列,由8个重复的保守基元序列组成。二者在DNA与氨基酸序列上的同源性分别为94.38%和92.02%。结果证实抗旱性不同的青稞品种之间LEA3抗旱蛋白保守基元拷贝数有差异,推测抗旱蛋白结构的差异可能对植物的抗旱性有影响。     

香蕉抗病基因类似序列(RGA)的克隆与分析

根据植物NBS类抗病基因保守氨基酸序列P-loop和疏水氨基酸GLPL保守序列设计简并引物,从香蕉抗镰刀菌枯萎病(4号小种)材料IN21(Musa spp.cv). 'IN21',AA)和Rose(M.spp.cv.'rose',AAA)的基因组DNA中扩增获得4个RGA,四条DNA片段长度分别为527 bp、537 bp、534 bp和547 bp,分别命名为"RGA-IN1"、"RGA-IN2"、"RGA-Rosel"和"RGA-Rose2"(GenBank Accession:EF488469、EF488470、EF488471和EF488472);同源性分析表明,均与已报道的植物抗病基因有不同程度的同源性,具有P-loop、Kinase-2、RNBS-B(Kinase-3a)以及GLPL等保守氨基酸序列,属于non-TIR-NBS类候选抗病基因.