白花泡桐纤维合成酶PfCesA4基因克隆及初步表达分析

本研究的目的是克隆白花泡桐纤维素生物合成途径关键酶基因——纤维素合成酶家族基因。采用PCR和RACE技术,利用Oligo、Primer Premier 5等软件进行引物设计,从白花泡桐中克隆出纤维素合成酶基因一条,NCBI分析后,命名为PfCesA4 (NCBI登录号:MK340936)。PfCesA4基因的cDNA全长为3 735 bp,其开放阅读框(ORF)长度为3 138 bp,能够编码含有1 045个氨基酸的蛋白质,此蛋白质的相对分子质量为119 081.91 u,等电点为7.24。二级结构分析表明其以α-螺旋和无规则卷曲为主。结构域和跨膜区分析表明其在N端含有锌指结构域及2个跨膜区,在C端含有6个跨膜区,这些结构域能够表现纤维素合成酶的特征。系统进化树分析表明在所选取的物种当中,白花泡桐与芝麻的亲缘关系较近。组织特异性分析结果表明,其在茎中的表达量最高,根部次之,叶部最少;且在茎中,木质部的表达量高于韧皮部,说明其可能主要参与次生壁的建成。通过对PfCesA4基因的克隆及分析,能够为泡桐纤维素生物合成途径及后期利用分子手段对泡桐木材进行遗传改良提供基因资源。     

马尾松Aux/IAA家族相关基因克隆及初步分析

生长素信号转导途径在植物生长发育过程中起到至关重要的作用,Aux/IAA(auxin/indoleacetic acids)家族基因可以直接和生长素相连而发生作用。研究马尾松Aux/IAA家族相关基因,可为马尾松体内生长素信号转导途径提供理论支持。本研究克隆出3个Aux/IAA家族基因,分别命名为Pm IAA1、Pm IAA2和Pm IAA3。Pm IAA1基因,c DNA全长1 330 bp,包含711 bp完整的ORF,能够编码含有236个氨基酸的蛋白质,此蛋白相对分子质量为26 015.6 u,等电点为7.01;Pm IAA2基因,c DNA全长1 628 bp,包含909 bp完整的ORF,能够编码含有302个氨基酸的蛋白质,此蛋白相对分子质量为41 176.1 u,等电点为5.25;Pm IAA3基因,c DNA全长1 316 bp,包含759 bp完整的ORF,能够编码含有252个氨基酸的蛋白质,此蛋白相对分子质量为28 060.1 u,等电点为6.01。Pm IAA1蛋白与火距松IAA1蛋白同源性高达95%,Pm IAA2蛋白与火距松IAA2蛋白同源性高达97%,Pm IAA3蛋白与火距松IAA3蛋白同源性高达98%。Pm IAA1、Pm IAA2、Pm IAA3蛋白都含有Aux/IAA结构域,此结构域可以与ARFs(auxin response factors)结合而发生作用,这符合Aux/IAA家族的特点。利用实时定量技术得知,Pm IAA1、Pm IAA2和Pm IAA3在马尾松嫩根、嫩芽、嫩叶中都有表达。Pm IAA1在嫩叶中表达量最高、嫩根中次之、嫩茎中最低;Pm IAA2和Pm IAA3在嫩根中表达最高、嫩叶和嫩茎中次之。本研究可为生长素调控马尾松生长发育相关机理提供依据。     

马尾松PmCOMT基因的克隆及实时定量表达分析

在木质素生物合成里,咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid-O-methyltransferase, COMT)起重要作用。本论文以马尾松幼苗作为材料,并通过PCR技术以及RACE技术从马尾松材料中克隆出Pm COMT基因的cDNA全长。该cDNA全长为1660bp,其中预测完整ORF全长为1125bp,可编码374个氨基酸的蛋白。蛋白相对分子质量为41.81 kD;等电点(pI)为5.03,总平均亲水性为-0.311。通过生物信息学的方法对其进行分析表明,Pm COMT基因具有典型的甲基转移酶的保守结构域。通过实时荧光定量表达分析表明,COMT基因在马尾松的不同组织均有表达,其中在新梢中的表达量最高,树皮中表达量最低。     

甜菜NAC转录因子BvNAC46基因的克隆及植物表达载体的构建

以干旱处理的强抗旱甜菜品种HI0466为材料,通过RT-PCR技术克隆到一个甜菜NAC类转录因子基因的cDNA序列,命名为BvNAC46(GenBank登录号:XM_010689163.2)。序列分析表明,该基因序列全长1 047 bp,包含一个576 bp的开放阅读框(ORF),编码191个氨基酸,为稳定的疏水性蛋白,推测理论分子量为88.725 kD,亚细胞定位于细胞核中。含有一个NAM保守结构域,具有NAC转录因子的典型特征。将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301中,成功构建了甜菜BvNAC46基因的植物表达载体pCAMBIA2301-BvNAC,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能提供参考。     

甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因的克隆及菌核病菌诱导表达

依据拟南芥、芥菜型油菜和白菜已知超氧化物歧化酶(SOD)保守序列设计引物,用同源序列法和RT-RACE技术克隆甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因,经序列分析和基因片段拼接,得到Cu/ZnSOD和FeSOD基因的全长cDNA,分别为756 bp (GenBank登录号AY970822)和1 037 bp (GenBank登录号EF634058)。以cDNA序列设计引物,获得1 322 bp的Cu/ZnSOD基因组DNA (GenBank登录号DQ431853)和1 659 bp的FeSOD基因组DNA (GenBank登录号EF634057)。生物信息学分析表明,Cu/ZnSOD基因ORF框长459 bp,编码152个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有7个外显子和6个内含子。而FeSOD基因ORF框长792 bp,编码263个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有8个外显子和7个内含子。二者外显子和内含子交接处完全符合GT/AG规则。利用获得的Cu/ZnSOD的cDNA片段作探针,对菌核病菌诱导甘蓝型油菜叶片的mRNA进行Northern blotting分析,结果显示在同一品种(系)中菌核病菌诱导后Cu/ZnSOD mRNA表达量比诱导前升高,抗(耐)型油菜Cu/ZnSOD mRNA表达量明显高于感病型。油菜叶片SOD酶活性分析结果也获得了完全一致的结果。以上结果表明,甘蓝型油菜SOD基因与菌核病抗性相关。     

地黄己糖激酶RgHXK2基因的电子克隆及生物信息学分析

己糖激酶(HXK)的主要功能是在糖酵解途径中催化己糖磷酸化,是植物体内调控呼吸代谢的关键酶之一。主要催化己糖磷酸化进入糖酵解途径,可在植物体的生长发育过程中为其提供大量的能量。己糖激酶属于hexokinase-2超家族,在植物生命活动中发挥着重要的作用。为了解地黄(Rehmannia glutinosa)己糖激酶基因RgHXK2在磷酸化过程中起到的作用,该研究基于转录组测序获得的地黄己糖激酶基因ORF的部分保守序列和地黄的SRA数据库,在NCBI中进行电子克隆获得地黄RgHXK2全长cDNA序列;采用在线网上工具ProtParam、TMHMM、SOPMA、SMART、MEME、Clustal Omega以及Jalview、MegaX等软件对其进行生物信息学分析,结果显示,地黄RgHXK2基因全长1 462 bp,包含1 194 bp的开放阅读框,编码一个含有397个氨基酸、相对分子质量为43.75 kD、等电点为6.34的蛋白质。在线软件预测该蛋白含有Hexokinase-1和Hexokinase-2保守结构域,无信号肽与跨膜结构,为亲水性非分泌蛋白,主要分布于线粒体和叶绿体中,参与碳...     

甘蔗乙烯信号转导途径关键基因CTR1的克隆与表达分析

为了研究CTR1基因与甘蔗糖分积累的关系,本研究利用同源克隆的方法,以甘蔗品种‘桂糖28’(GT28)幼嫩叶片的cDNA为模板,成功克隆得到2103 bp的甘蔗CTR1基因(ScCTR1;GenBank登录号为MK158246)。ScCTR1基因的开放阅读框(ORF)序列长1656 bp,编码551个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为62.78 kD。ScCTR1蛋白具有CTR1同源蛋白典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域。实时荧光定量PCR结果表明,ScCTR1基因在茎和叶中都有表达,在茎中其表达量呈先增加后降低的趋势,在未成熟叶、成熟叶和老叶中,其基因表达呈降低的趋势。本研究结果对阐明乙烯调控甘蔗茎糖分积累和叶发育的机理提供了重要的参考依据。     

一个新的棉纤维表达蛋白cDNA的克隆、表达及功能初步分析

通过陆地棉高品质纤维种质系7235的棉纤维混合cDNA文库随机测序,得到一个开放阅读框(open reading frame,ORF)完整的棉纤维表达蛋白(GhCFE,GenBank登录号:DQ073045)cDNA序列。该cDNA序列全长1274bp,最大的ORF为996bp,编码332个氨基酸,其理论上的等电点pI=6.14,分子量Mw=37.7KD。它的N-末端存在一个长度为27个氨基酸残基的信号肽。RT-PCR分析表明,该基因在根、茎中不表达,在叶片中微弱表达,在不同发育时期的纤维细胞中均表达,且在纤维伸长期表达量最高。进化树显示GhCFE与已报导的3个棉纤维表达蛋白cDNA有很高的同源性。通过构建酵母表达载体,发现该基因对酵母细胞的伸长和细胞壁加厚没有显著影响。利用pBI121质粒构建了含35S启动子的正义表达载体和含棉纤维特异表达启动子E6的正义和反义表达载体,正在通过农杆菌介导的遗传转化,开展该基因的功能验证。     

柽柳冷适应蛋白基因

冷适应蛋白(CAP)是指生物体受到寒冷刺激后,诱导表达的一类特异蛋白质,由冷诱导有关的基因在冷诱导过程中启动转录和翻译的。低温条件下,冷适应蛋白表达量在持续不断增加,对低温条件下蛋白质合成的调节以及mRNA的折叠起重要作用。是一类重要的与细胞耐寒相关基因。我们从构建的紫杆柽柳(Tamarixandrossowii)cDNA文库中分离得到了冷适应蛋白基因片段,并应用RACE技术获得其全长cDNA序列,该基因cDNA序列长度为1176bp,其中开放读码框(ORF)从49到663碱基位置,长度为615bp,编码204个氨基酸组成的多肽,预测其蛋白质分子量为23kD,预测其理论等电点为9.23。该基因已经在GenBank上注册,其基因序列登录号AY587773,氨基酸序列登录号为AAT01418。该基因的克隆为植物分子育种提供了新的基因资源。     

菊花CgF3’H基因克隆及表达特性分析

根据菊花花器官表达序列标签序列设计引物,采用PCR和5’-RACE技术对类黄酮3'-羟化酶(F3’H)基因进行全长cDNA克隆.克隆获得F3'H cDNA全长为1 760 bp,其开放阅读框(ORF)为1 524 bp,编码一条包含508个氨基酸残基的多肽,GenBank登录号为AB523844.预测该基因编码的蛋白分...     

果子蔓凤梨Actin基因的克隆与序列分析

持家基因Actin常被用作定量、半定量PCR试验的内参,以确定目标基因的相对表达量。基于前期从全长cDNA文库中获得Actin基因的EST单克隆,进行Primer Walking测序,获得一个Actin基因的全长cDNA序列,序列长1625bp,ORF为1131bp,可编码377个蛋白氨基酸,命名为Goactin1(GenBank登录号:HQ184438)。蛋白质理论分子质量为41.7kD,等电点pI为5.31,包含一个Actin superfamily保守区,二级结构主要由随机卷曲、Alpha螺旋、延伸链和Beta转角组成。此外以2BTF A链为基础建立起了Goactin1蛋白的三级结构图。系统进化树分析表明Goactin1蛋白与马铃薯、棉花、烟草、短柄草、拟南芥等的Actin蛋白聚为一类,它们的亲缘关系最近。     

茶树叶绿素合成相关基因克隆及在白叶1号不同白化阶段的表达

高等植物叶绿素的生物合成对其正常光合作用起关键作用。本文根据前期芯片杂交结果, 采用RT-PCR和RACE技术克隆了3个茶树叶绿素合成相关基因, 分别为谷氨酸-tRNA还原酶(CsGluTR)、叶绿素合酶(CsChlS)、叶绿素酸醋氧化酶(CsCAO), 对应的GenBank的登录号为HQ660371、HQ660370、HQ660369。序列分析表明, CsGluTR基因全长2165 bp, 开放阅读框长1665 bp, 编码554个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为60.6 kD, 理论等电点为8.78;CsChlS基因全长1463 bp, 其中开放阅读框长1125 bp, 编码374个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为40.5 kD, 理论等电点为8.58;CsCAO基因全长2146 bp, 其中开放阅读框长1611 bp, 编码536个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为60.8 kD, 理论等电点为8.03。比对分析表明, 3个基因编码的氨基酸序列与其他植物中同源基因的相似性均在70%以上。利用荧光定量PCR技术检测3个基因在不同白化阶段的表达,表明, CsChlS和CsCAO基因具有明显的表达协同性, 它们在叶片中的表达量与叶片的颜色变化高度同步;而CsGluTR在白化叶片和正常叶片中的表达差异相对较小, 同时在新生芽叶转绿过程中最先恢复正常表达水平。说明在白化叶片中, 叶绿素的合成机制受到较大影响, 叶绿素合成受阻导致的叶片内色素类物质含量降低或消失是叶片白化的直接原因。     

小麦脂质转运蛋白cDNA结构及相应肽链构造特征的分析

根据测序获得的1条261 bp cDNA片段,通过电子延伸、设计引物,从小麦Mardler/7*百农3217(Pm2)的cDNA中扩增获得1条651 bp的cDNA片段,通过同源比对发现其包含小麦LTP1 完整的编码序列.该片段包含基因的5'非翻译区42 bp,3'非翻译区261 bp,开放阅读框348 bp,编码115个氨基酸.预计蛋白的分子量为11.2 kD,等电点为9.46.此基因有8个位置保守的半胱氨酸(C)残基及25个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因.其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY796184(基因)和AAV65513(蛋白).通过疏/亲水性分析,发现肽链分子具有较大范围的疏水面.     

甜菜nia基因的克隆及不同氮素形态诱导的差异表达

利用同源序列克隆方法从二倍体甜菜品种Ty7中获得氮素诱导nia基因片段,通过RACE技术克隆nia基因全长序列,该基因ORF长度2 718 bp,编码905个氨基酸,并已在GenBank上登录(EU163265),基因组中nia以低拷贝数存在。nia编码蛋白的等电点为6.12,推测分子量为102 kD,以NADH为电子供体。为揭示不同氮素形态和处理对甜菜nia基因表达的影响,采用半定量PCR方法检测不同氮素形态诱导nia基因mRNA的表达,同时测定酶活力。结果表明,当铵态氮诱导nia基因时,低浓度的铵离子能促进基因的表达,过高浓度的铵离子抑制基因的表达。当硝态氮诱导nia基因时,随处理浓度的增加,nia的表达加强,呈正相关关系。用30 mmol L^–1硝态氮诱导4 h后,nia基因表达达最高值,约在6 h后,表达明显下降。     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及表达分析

以苎麻 [Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.] 栽培种湘苎3号为材料, 通过简并引物RT-PCR结合RACE技术首次成功克隆苎麻纤维素合成酶基因BnCesA1 5′端450 bp序列以外的全部cDNA 序列, 序列长3 276 bp, 编码一段938个氨基酸的蛋白质。经基因比对及蛋白质结构分析确证是苎麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析显示：BnCesA1在苎麻根、茎、叶和芽组织中均有表达, 其表达量为茎＞叶＞芽＞根, 相对表达量依次为 0.791、0.381、0.319和0.183。从其表达模式可以推测该基因同时参与了苎麻细胞初生和次生细胞壁纤维素的合成。     

擎天凤梨泛素基因的克隆与序列分析

鉴于泛素与植物受高温等环境胁迫下产生的一些诱导型蛋白降解有关,本研究根据擎天凤梨Ostara早期花器的全长cDNA文库,经大规模随机测序及重叠群（contigs）内EST序列的拼接,获得了擎天凤梨多聚泛素基因全长cDNA序列（GenBank登录号：GQ890686）,序列长1896bp,开放阅读框长1323bp,编码441个蛋白氨基酸残基,蛋白质分子质量为49.3kD,等电点pI为6.59。蛋白二级结构预测显示,该蛋白主要由随机卷曲、延伸链、α螺旋和β-转角组成;系统进化树分析表明与拟南芥推定的多聚泛素UBQ10（gi｜23397122｜gb｜AAN31845.1｜）亲缘关系最近;经推断它是由5个单体泛素组成的多聚泛素。本研究有助于进一步探讨该基因在低温胁迫下的反应机理以及如何采用分子调控手段增强擎天凤梨的耐低温能力。     

两种苎麻纤维素合酶基因cDNA序列的克隆及表达

从苎麻转录组数据出发, 利用Blast工具从中分析出与多种植物纤维素合酶高度相似的片段CL789和Unigene20360。根据片段信息设计特异性引物, 从苎麻[Boehmeria nivea (Linn.)Gaud.]栽培种湘苎3号中克隆纤维素合酶核心片段, 并利用5'及3'RACE技术获得2个片段的全长cDNA。两者都具有典型的纤维素合酶特征结构域, 表明为2个苎麻纤维素合酶基因CesA的cDNA序列, 分别命名为BnCesA2和BnCesA3。BnCesA2基因编码区全长度3240 bp, 编码1 079氨基酸多肽; BnCesA3基因编码区全长3120 bp, 编码1039氨基酸多肽。对BnCesA2和BnCesA3基因在湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻苎麻品种木质部和韧皮部荧光定量PCR分析显示, 2个基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部都有表达, 但表达量存在着一定差异, 整体而言BnCesA2具有更高的表达水平, 其木质部和韧皮部的表达都为BnCesA3的2~5倍。推测BnCesA2和BnCesA3都参与了苎麻细胞壁的次生合成。     

蝴蝶兰一个C3型PEPC基因的克隆及其低温胁迫下的表达分析

为研究蝴蝶兰对低温胁迫响应的分子调控机理,本研究采用RT-PCR及RACE的方法从蝴蝶兰叶片中克隆了一个C3型PEPC基因PhPEPC (登录号为:MK482383),该基因cDNA全长序列为3 448 bp,开放阅读框长度为2 898 bp,编码965个氨基酸;该蛋白包含一个PEPC酶结构域,具有2个PEPCase活性位点,86个磷酸化位点和7种motifs,为一酸性亲水性蛋白。系统进化分析显示,蝴蝶兰PhPEPC蛋白与兰科植物小兰屿蝴蝶兰、铁皮石斛、深圳拟兰等的PEPC蛋白亲缘关系最近。分析表明,PhPEPC基因在蝴蝶兰根中表达水平最高,在花器官中的表达水平次之,在叶和花梗中的表达水平最低;在13℃/8℃的昼/夜温度条件下,PhPEPC基因的表达水平先升高后降低,当恢复培养3 d时,该基因的表达水平又趋于升高。结果表明,蝴蝶兰PhPEPC基因参与了对低温胁迫的调控。本研究结果将有助于理解蝴蝶兰对低温胁迫的适应机制,并为蝴蝶兰新品种的遗传改良提供依据。     

茶树生长素响应因子基因CsARF1的克隆与表达分析

生长素响应因子(ARFs)是能够与生长素原初反应基因启动子区的生长素响应基元(TGTCTC)特异结合的一类转录因子,调控生长素应答基因的表达。采用SMART-RACE-PCR技术,获得茶树生长素响应因子基因CsARF1的全长cDNA序列(GenBank登录号为JX307853),并进行了生物信息学分析和表达分析。CsARF1基因cDNA全长3222 bp,包含2463 bp的开放阅读框(ORF),编码820个氨基酸残基。编码蛋白的分子量为49.35 kD,具有保守的N端DNA结合域B3和C端二聚化结构域IAA_ARF,中间区域富含谷氨酸、丝氨酸和亮氨酸,是一个定位于细胞质的具有激活转录功能的可溶性蛋白。相似性及系统进化分析表明,该基因编码的氨基酸序列与葡萄ARF8的相似性最高(83%),与番茄ARF8的亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR技术,检测该基因在茶树越冬芽休眠到萌发后不同时期的表达情况。结果显示CsARF1在茶树越冬芽深休眠和萌动期表达量较高,表明该基因与茶树越冬芽的休眠维持及解除密切相关。     

津田芜菁泛素化相关蛋白基因BrRUB1的克隆及表达分析

RUB1(related to ubiquitin 1)是植物和酵母中一种泛素类似蛋白质,是Cullin家族的一个成员。为阐释津田芜菁Br RUB1基因的表达特性,本研究克隆了津田芜菁RUB1基因的全长c DNA序列,命名为Br RUB1,Gen Bank登录号为KF501173。其ORF全长471 bp,编码156个氨基酸;亚细胞定位结果显示,Br RUB1-GFP定位于细胞核,表明Br RUB1蛋白可能在细胞核中发挥其功能。q RT-PCR检测Br RUB1的表达表明,该基因表达量在花蕾中最高,花瓣中次之,具有组织特异性。而且Br RUB1在芜菁根皮中的表达受长波紫外线(UV-A)诱导。