干旱胁迫下油菜消减文库的构建及分析

以抗旱能力强的油菜Holiday为材料,以干旱处理的样品为Tester,正常水分管理(对照)为Driver构建干旱诱导的甘蓝型油菜叶片正向抑制性消减杂交 (SSH)文库。随机挑选24个阳性克隆进行PCR验证,结果表明,其中23个含有插入片段,平均大小在750 bp左右。将96个阳性克隆测序,并拼接和去除冗余,获得重叠群4条,单拷贝序列82条,平均长度为542 bp。经BlastX程序比对蛋白数据库发现,11条EST没有找到同源性序列,75条有同源序列。KOBAS分析发现,28条EST被定位到67条代谢途径中,根据P值推测,光合中的碳固定、有氧呼吸的电子供体、氮代谢、乙醛酸和二羧酸代谢在植物干旱胁迫中发挥着极为重要的作用。这些EST涉及到的功能中所占比例最大的分别是细胞器(58.82%)、结合(30.77%)和新陈代谢过程(43.72%),表明甘蓝型油菜面对干旱胁迫时,细胞器组件上的功能发挥了重要的作用,结合基因和蛋白被激活,加强了新陈代谢。     

外源6-BA和BR对干旱胁迫下水稻分蘖期光合色素含量及抗氧化系统的影响

为明确6-苄氨基嘌呤(6-BA)和油菜素内酯(BR)对干旱胁迫下水稻分蘖期生理特性的调控机制,本研究以三系杂交中熟晚稻品种‘H优518’为试验材料,通过喷施25 mg/L 6-BA和BR溶液,研究其对干旱胁迫下水稻分蘖期光合色素含量、抗氧化酶活性、丙二醛含量及可溶性蛋白含量等的影响。结果表明,随着干旱胁迫加剧,水稻分蘖期生长受到明显抑制。喷施6-BA和BR溶液后,在干旱胁迫第9天的水稻分蘖期叶片总叶绿素含量和类胡萝卜素含量相比对照分别显著增加28.1%～32.66%和25.27%～27.47%,而抗氧化酶活性也受到不同程度的促进,丙二醛含量降低了19.99%～34.53%,可溶性蛋白含量增加了13.72%～23.04%,并且喷施6-BA溶液的整体效果要好于BR溶液。由此可见,叶面喷施6-BA和BR能有效缓解干旱胁迫对水稻分蘖期生理特性的影响,对水稻抗旱栽培具有重要意义。     

三种类型油菜苗期抗旱性综合评价及抗旱指标筛选

探讨三种类型油菜苗期的抗旱性,并筛选抗旱指标,为今后抗旱性品种选育提供参考。以甘蓝型油菜Q2、芥菜型油菜‘新油9号’和白菜型油菜L14为材料,在温室中进行盆栽控水实验,设置正常供水和干旱胁迫处理,测定油菜叶片光合参数、叶绿素荧光参数、抗氧化酶、渗透调节物质等21项生理生化指标,并以各指标的抗旱系数为抗旱性评价指标,在主成分分析的基础上,利用加权隶属函数法对供试油菜品种的抗旱性进行综合评价,然后对各指标在抗旱性评价中的作用进行了比较分析。频次分析表明,三种油菜的光合参数指标(Pn, Gs, Tr, Ci)及离体叶片失水速率对干旱胁迫的反应最为敏感,可用于油菜苗期抗旱性的快速或初步鉴定;主成分分析将21个指标综合成为4个相互独立的综合指标(累计贡献率达92.259%),结合隶属函数分析得到抗旱性综合评价D值,得出三种油菜的抗旱性顺序为:‘新油9号’L14Q2;关联分析表明,水分利用效率、净光合速率、叶绿素荧光参数、离体叶片失水速率、丙二醛与油菜苗期抗旱性密切相关,可作为油菜苗期抗旱评价指标。     

甘蓝型油菜抗旱性鉴定研究进展

甘蓝型油菜抗旱育种的最终目的是培育干旱条件下节水、高产的新品种。笔者通过形态及生长发育指标、生理生化指标(光合作用、渗透调节、抗氧化酶活性、内源激素、水分利用率等)、产量和品质指标、综合评价指标等对油菜抗旱性鉴定研究进行了回顾式分析,认为水分胁迫对油菜不同时期形态及生长发育具有重要影响。通过回顾式研究,对甘蓝型油菜抗旱性鉴定研究的现存问题进行分析,并对相关指标与技术展开讨论,以期为油菜抗旱性研究和生产提供参考。同时甘蓝型油菜抗旱性分子机制的阐明必然将油菜抗旱育种研究带入一个崭新的阶段。     

不同耐旱性紫花苜蓿干旱胁迫下生理响应和转录调控的差异研究

苜蓿是最重要的豆科牧草,常被种植在干旱/半干旱地区。为研究不同耐旱性紫花苜蓿应对干旱胁迫的调控机制,本研究以中科1号紫花苜蓿(Medicagosativa‘Zhongke1’)为试验材料,以三得利紫花苜蓿(M.sativa‘Sanditi’)为对照,采用自然干旱法进行处理,比较干旱胁迫对其生长性状、光合作用、叶绿素含量、叶片相对含水量、渗透调节物质和抗氧化酶活性等指标的影响,并使用转录组测序分析2个品种响应干旱基因的差异。结果表明,干旱胁迫显著降低了2个紫花苜蓿品种的株高、地上地下生物量、叶片相对含水量、光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间二氧化碳浓度和叶绿素含量;与三得利相比,干旱胁迫下中科1号紫花苜蓿丙二醛含量和电导率更低,渗透调节物质积累和活性氧清除能力更强。中科1号和三得利分别有5308个和8053个响应干旱的基因; GO功能注释分析发现,中科1号的346个干旱响应基因被显著富集在6个GO类别,而三得利的1683个干旱响应基因被显著富集在29个GO类别;此外,我们还筛选到19个在中科1号中表达量显著高于三得利的抗旱关键基因。本研究发现紫花苜蓿可能通过上调抗旱基因SUS、P5CS、...     

牡丹PsDREB转录因子基因的克隆及亚细胞定位

DREB转录因子是一个干旱应答元件的结合蛋白,它在植物对干旱、高盐及低温胁迫的分子反应中起着非常重要的调控作用。本研究以芍药科芍药属牡丹‘洛阳红’品种叶片提取的总DNA为模板,通过PCR扩增获得一个1 661 bp的DREB(dehydration responsive element binding protein)基因的cDNA序列,包含1 089 bp的开放阅读框、448 bp的5'非编码序列和124 bp的3'非编码序列,命名为PsDREB。该基因的cDNA编码363个氨基酸,与葡萄、梧桐、杨树和咖啡的同源性分别为61%、60%、56%和55%。为进一步验证其功能,本研究通过基因枪法对该基因编码的蛋白进行了亚细胞定位检测,结果发现该蛋白定位于细胞核,符合转录因子细胞核定位的特征。研究结果为进一步研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础。     

冷胁迫下甘蓝型冬油菜表达蛋白及BnGSTs基因家族的鉴定与分析

谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases, GST)参与调节植物生长、发育和逆境胁迫反应的许多方面。本研究利用双向电泳和质谱技术分析‘16VHNTS309’在冷胁迫下差异表达的蛋白质,基于GO和KEGG分析鉴定出BE、APX、SOD、GST等参与冷胁迫反应的蛋白质。利用q RT-PCR和生理指标鉴定到响应冷胁迫的关键蛋白质GST,采用同源克隆法克隆到‘16VHNTS309’的GST基因。该基因CDS长度为642bp,编码213个氨基酸,是一个不稳定蛋白,属于GST＿N＿3谷胱甘肽S-转移酶家族,与甘蓝型油菜‘ZS11’序列相似性为99.22%,与‘ZS11’和‘Vision’两者的氨基酸序列相比较发现第127位亮氨酸(L)突变为脯氨酸(P)。基因家族分析表明,在甘蓝型油菜中共鉴定到153个Bn GSTs成员,按其功能主要分为Zeta、Phi、Theta、CHQ、DHAR、Lambda和Tau这七大类型,大部分的Bn GSTs属于Phi和Tau这2种类型。系统进化将Bn GSTs分为12个亚家族,亚家族Ⅰ和Ⅷ包含了较多的成员,Bn GSTs不均匀的分布在1...     

甘蓝型油菜TIP4;1基因的克隆与表达分析

水孔蛋白是位于质膜和液泡膜等生物膜上主要负责水分跨膜运输的通道蛋白。为了分析甘蓝型油菜种子萌发过程水分调控的分子机制,采用RT-PCR法从甘蓝型油菜种子中克隆了液泡膜内在蛋白(Tonop last intrinsic proteins,TIPs)TIP4;1基因片段序列,并对甘蓝型油菜种子TIP4;1基因在种子萌发过程及干旱、低温和盐胁迫下的表达进行了qRT-PCR(Quantitative Real-time PCR)分析。结果表明,TIP4;1基因在干种子中表达水平很低,但是在种子萌发过程中表达量增加。此外,在干旱、低温及盐的胁迫处理下,TIP4;1基因的表达上调,结果暗示着该基因可能参与了甘蓝型油菜种子萌发和逆境响应过程。随着研究的深入,水孔蛋白的水分调控机制将进一步被揭示,这对于解决干旱胁迫和盐胁迫等实际问题具有重大现实意义。     

花生蔗糖合酶基因AhSuSy的克隆和干旱胁迫表达分析

蔗糖合酶(sucrose synthase, SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶, 在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要的作用。本研究利用同源克隆、RACE和TAIL-PCR相结合的方法从花生叶片中分离了蔗糖合酶基因, 命名为AhSuSy (GenBank登录号JF346233)。该基因cDNA序列全长2 790 bp, 包含一个2 421 bp的开放阅读框(ORF), 5′端非编码区57bp, 3¢端非编码区为312 bp。根据编码区预测AhSuSy编码806个氨基酸, 与大豆、拟南芥、玉米等植物中相关蛋白的氨基酸序列同源性达75%以上; 成功构建了该基因的原核表达载体pET32a-AhSuSy, 在IPTG诱导下得到92 kD左右的蛋白, 与理论值一致。半定量RT-PCR分析表明AhSuSy在花生根、茎、叶中均有表达。利用10%PEG模拟干旱处理花生幼苗, 分析胁迫后AhSuSy的转录水平, 同时测定蔗糖合酶活性和蔗糖含量, 发现三者均表现为处理后4~12 h逐渐升高, 相关性分析显示花生中蔗糖含量与蔗糖合酶活性的相关系数达0.993(P=0.007<0.01), 处理后12~24 h逐渐降低。推测该基因响应干旱调控, 在花生抗旱胁迫中可能起着一定的作用。     

油菜柠檬酸合酶基因的克隆及在逆境下的表达

柠檬酸合酶是植物多种代谢途径的限速酶, 及代谢变化的标志酶。为了解油菜柠檬酸合酶基因的生理功能, 以甘蓝型油菜叶片cDNA为模板, 设计特异性引物, 获得一编码柠檬酸合酶基因的cDNA序列, 全长1 659 bp, ORF区含476个氨基酸残基, 序列比对显示其蛋白序列与拟南芥有较高的同源性(96.0%), 氨基末端含一线粒体靶信号。聚类分析表明, 油菜柠檬酸合酶基因与其他植物内该基因高度同源。对油菜幼苗进行植物生长调节物质、高温和低温、强光照和弱光照、盐、菌核病、干旱和水渍等处理, 采用半定量PCR法对油菜叶片柠檬酸合酶基因的表达模式进行检测, 发现在盐胁迫、暗光和强光的处理下, 柠檬酸合酶基因的表达基本没有变化;在水渍、干旱、IAA和6-BA胁迫下, 其表达有所升高, 但出现峰值的时间不同, ABA对表达模式的影响与IAA相反;感染菌核病后其表达降低;对GA₃的应答呈鞍型。对部分处理采用荧光定量PCR验证, 其结果与半定量PCR结果基本一致。     

甘蓝型油菜含MATH结构域基因BnaM154过表达载体的构建与转化

编码含MATH结构域(Meprin and TRAF homology domain)的基因目前在油菜中研究较少。本研究以甘蓝型油菜‘湘油15’(XY15)种子发育35 d抑制差减(suppression subtractive hybridization, SSH)文库为基础,进一步筛选获得实际编码中有两个连续MATH结构域的功能未知基因,该基因全长DNA序列为1 800 bp,我们将其命名为BnaM154。将目的片段克隆后插入表达载体pFGC5941-Nap中,成功构建了pFGC5941-Nap::BnaM154过表达载体。利用农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传转化方法,成功获得8株稳定遗传的转基因苗,为进一步研究BnaM154基因在甘蓝型油菜中的功能提供了科学依据。     

干旱胁迫对转IrrE基因甘蓝型油菜生理生化指标的影响

以转IrrE基因与非转基因甘蓝型油菜为材料,用10%(W/V)PEG6000(聚乙二醇)进行了干旱胁迫实验,比较研究了转IrrE基因与非转基因甘蓝型油菜幼苗的耐受性应答情况。结果表明:转基因油菜植株含水量下降趋势小于非转基因油菜植株;转基因油菜植株叶绿素含量和荧光参数F0的上升趋势均明显大于非转基因油菜植株;转基因油菜植株的Fv/Fm值和可溶性蛋白含量均大于非转基因油菜植株,但丙二醛(MDA)含量小于非转基因油菜植株。以上结果从侧面证实了:在干旱胁迫下,转IrrE基因油菜植株较非转基因植株有更强的耐受能力;IrrE基因作为一种转录调节因子,广泛参与了油菜幼苗对干旱胁迫的耐受性应答过程,增强了植株的耐旱能力。     

甘蓝型油菜CBF基因家族的鉴定和表达分析

低温是影响植物生长发育的重要环境胁迫因子,ICE1(inducer of CBF expression1)-CBF(C-repeat(CRT)-binding factors)-COR(cold responsive)在植物响应低温胁迫的信号途径中具有重要作用。为探究CBF(C-repeat-binding factors)基因在甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中的进化以及在低温胁迫应答反应中的功能,本研究以4个拟南芥CBF基因为基础序列,鉴定出11个甘蓝型油菜、6个白菜和5个甘蓝CBF基因,并对它们的分子特性、蛋白保守结构域和系统进化树、基因结构及基因染色体分布、甘蓝型油菜CBF基因组织表达模式以及不同逆境和激素处理下的表达模式进行系统的比较分析。结果表明,在11个甘蓝型油菜CBF基因中,可分为亚组Ⅰ(CBF1/2/3)和亚组Ⅱ (CBF4) 2个亚组。转录组测序结果表明,所有甘蓝型油菜CBF基因受低温诱导表达,其中亚组Ib的4个基因对冷胁迫响应迅速且持续时间长,亚组Ⅱ中2个基因对冷胁迫响应表达较弱,但它们在根中表达量明显高于叶片,并且参与盐胁迫和渗透胁迫响应;甘蓝型...     

外源独脚金内酯能有效提高油菜苗期抗旱性

正为了探究外源独脚金内酯(SLs)对油菜苗期干旱胁迫的缓解效应,研究人员以甘蓝型油菜品种中双11为材料进行盆栽试验,研究了0.18μmol/L SLs灌根处理对正常供水和干旱胁迫下油菜长势、光合速率、抗氧化系统和渗透调节物质的影响。研究表明,外源SLs能有效缓解干旱胁迫对油菜苗期生长的抑制作用,与干旱胁迫相比,SLs处理后干物质积累     

模拟干旱胁迫对马铃薯组培苗发育及试管薯形成的影响

本研究以马铃薯品种(品系)‘克新一号’、‘夏坡蒂’、‘K1’和‘K2’组培苗为试验材料,以不同浓度的甘露醇和山梨醇模拟干旱胁迫,研究干旱胁迫对马铃薯组培苗生育进程及试管薯产量的影响。结果表明:在遭受干旱胁迫下,不同马铃薯品种的叶片数、株高均会随干旱胁迫而降低;不同马铃薯品种叶和茎干物质量的变化随着干旱胁迫程度的加重而出现不同程度的降低趋势;不同品种马铃薯的试管薯结薯总数与大中薯率随着干旱胁迫程度的增加出现降低趋势,低浓度(0.1 mol/L)的甘露醇和山梨醇会诱导结薯提前,推测可能是马铃薯面临干旱胁迫的一种应对机制。本研究结果可为马铃薯节水抗旱技术研究及抗旱品种筛选提供一定的理论依据。     

干旱胁迫下外源油菜素内酯对玉米幼苗光合作用和D1蛋白的调控效应

为了揭示干旱胁迫下外源油菜素内酯对玉米幼苗光合作用的保护机制,采用溶液培养的方法,以驻玉309为试验材料,研究外源油菜素内酯(BR)预处理及20% PEG-6000模拟干旱胁迫后玉米幼苗的生长参数、叶绿素含量、光合参数、叶绿素荧光参数及D1蛋白含量的变化。结果表明,与干旱胁迫处理(PEG)相比,BR+PEG处理的玉米苗株高增加45.87%,根长增加20.56%,总干物质积累增加8.01%,叶片相对含水量提高4.50%,叶绿素a含量增加26.32%,光合参数(Pn、Gs、Ci、Tr)分别提高9.57%,38.23%,30.19%,28.12%,光合系统Ⅱ(ΦPSⅡ)活性提高了20.48%,最大光化学效率提高了0.66%,光合系统Ⅱ绝对电子传递速率(ETR(Ⅱ)和相对电子传递速率r ETR(Ⅱ))分别提高20.40%和31.02%;D1蛋白含量增加37.34%(P0.05)。说明在干旱胁迫条件下叶片喷施BR可以改善玉米幼苗的生长发育,减缓光合系统的损伤,促进D1蛋白质的稳定,从而提高玉米幼苗对干旱胁迫的适应性。     

甘蓝型油菜防御素基因的克隆与生物信息学分析

为了研究甘蓝型油菜防御素基因的结构和功能,根据白菜防御素基因序列设计引物,采用RT-PCR方法从甘蓝型油菜中克隆到4个防御素基因,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明,甘蓝型油菜防御素基因cDNA全长325~335 bp,包含231~243 bp的开放阅读框,编码76~80个氨基酸;防御素基因在长期进化过程中产生了显著的差异,但防御素含有的8个保守半胱氨酸残基均稳定存在;Bndef1、Bndef2、Bndef3与萝卜Rs-AFP1、诸葛菜Omdef亲缘关系较近,Bndef4与豇豆Vudef亲缘关系较近;4个防御素蛋白均为稳定蛋白,具有信号肽结构,可能为分泌蛋白。     

外源亚精胺对干旱胁迫下谷子幼苗光合作用及碳水化合物积累的影响

以干旱敏感的谷子品种‘狼尾巴’为试验材料,在营养液栽培模式下,采用20%聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱,研究了外源亚精胺(Spd)对干旱胁迫下谷子幼苗光合特性、碳水化合物积累以及蔗糖、淀粉合成关键酶活性的影响。结果表明,干旱胁迫显著降低了谷子幼苗光合作用和碳水化合物积累,抑制植株的发育,而外源Spd处理能在一定程度上逆转这种效果,0.1mmol/L亚精胺处理后,谷子幼苗光合参数、叶绿素荧光参数均比干旱胁迫处理显著升高,同时蔗糖磷酸合成酶、淀粉合成酶等酶活性升高,并最终促进了蔗糖、可溶性总糖以及淀粉等破水化合物的积累,缓解了干旱胁迫对谷子幼苗生长发育的抑制。以上结果表明,干旱胁迫下,外源Spd能缓解叶片气孔的关闭,促进植株对CO2的吸收,提高植物的光合作用和碳水化合物积累能力,并最终提高了谷子幼苗的抗旱性。     

人工合成甘蓝型油菜抗旱性及DNA甲基化水平分析

甘蓝型油菜是具有重要经济价值的多倍体物种,是优质食用植物油和饲料蛋白质的重要来源之一。但是其驯化历史较短,遗传背景狭窄,且在整个生命周期中都对干旱胁迫敏感,因此培育高产耐旱品种是甘蓝型油菜的重要育种目标之一。本文用15%PEG-6000模拟干旱胁迫,对人工合成甘蓝型油菜不同世代(S1～S4)及其二倍体亲本进行不同时间的胁迫处理,并结合表型观察,以及叶片中丙二醛(MDA)、可溶性蛋白含量、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等生理指标的测定,初步了解上述材料的抗旱性差异。结合表型观察和叶片中相对含水量分析,发现人工合成甘蓝型油菜S1～S4及其亲本的抗旱性表现为甘蓝 Bn-S3 Bn-S4 Bn-S1 Bn-S2白菜型油菜。干旱胁迫后Bn-S3、Bn-S4的POD及SOD活性较高,MDA含量较低,表明Bn-S3和Bn-S4能更加有效地清除活性氧(ROS),对过氧化损伤的防御能力更强。通过HPLC分析发现所有材料的甲基化水平在胁迫12 h时最高,其中亲本白菜型油菜Br的甲基化水平最高, Bn-S1和Bn-S4介于两亲本之间,而Bn-S2和Bn-S3低于两亲本。甲基化敏感多态性分析也显示人工合成甘蓝型油菜在干旱胁迫后,甲基化和去甲基化水平均发生了明显的变化,表明植物的甲基化变化可能有利于提高其抗旱能力。