番茄冷诱导基因SlCMYB1的克隆及其在水稻中异源表达研究

从番茄中克隆了一个编码MYB转录因子家族R2R3-MYB亚类基因SlCMYB1。不同逆境胁迫下的表达模式分析结果表明,该基因受低温、高盐、干旱和ABA胁迫诱导表达。洋葱表皮亚细胞定位研究表明,SlCMYB1为核定位蛋白。为深入了解SlCMYB1基因与非生物逆境应答的关系,我们构建了SlCMYB1基因过表达载体来转化水稻,获得了16个转基因水稻株系。SlCMYB1在水稻中异源表达能显著提高转基因水稻植株的苗期抗冷性,增加脯氨酸合成的关键酶基因OsP5CS1,膜转运蛋白基因OsWCOR413等低温胁迫应答基因的表达水平,这暗示着SlCMYB1与OsP5CS1、OsWCOR413基因处于同一低温调控信号转导路径。本研究结果为通过遗传工程操控低温信号通路的方法改良冷敏感植物抗冷性提供了理论基础。     

植物DREB转录因子及其转基因研究进展

DREB(dehydration responsive element binding protein)类转录因子是AP2/EREBP(APETALA2/an ethylene-responsive element binding protein)转录因子家族的一个亚家族,拥有保守的AP2结构域,能够特异性地与抗逆基因启动子区域的DRE顺式作用元件相结合,在低温、干旱和盐碱等条件下调节一系列下游逆境应答基因的表达,是逆境适应中的关键性调节因子.拟南芥中与逆境相关的DREB转录因子可分为DREB1/CBF和DREB2两类,其中DREB1/CBF类成员主要参与低温胁迫应答反应,DREB2类成员则主要参与干旱胁迫应答反应.根据近十年来的报道,目前已从拟南芥、水稻、玉米、小麦、黑麦、大豆、西红柿和油菜等几十种植物中分离并鉴定出调控干旱、高盐及低温耐性的DREB基因,并利用这些基因得到了抗逆性增强的拟南芥、油菜、西红柿、小麦以及杨树等转基因植株.转基因结果表明DREB转录因子家族在双子叶植物,单子叶植物,草本植物及木本植物抗逆品种改良中均具有重要的应用价值.本文总结了十多年来特别是近五年来国内外相关研究进展,并对DREB转录因子的研究前景及其在木本植物良种选育中的研究趋势进行了展望.     

拟南芥转录因子NAC103在内质网胁迫应答中的抗性分析

环境胁迫是影响粮食产量和品质的重要因素,在内质网胁迫条件下构建植物基因调控网络有利于粮食增产。为了分析拟南芥内质网胁迫应答过程中转录因子NAC103的生物学功能,本研究利用RNAi技术筛选到NAC103低量表达植株,并利用之前发表过的NAC103过量表达植株,发现低量和过量表达NAC103的转基因植株在内质网胁迫应答中具有不同的表现型。我们统计分析了含有真叶植株、只有子叶植株和没有子叶植株的百分率,结果表明:与野生型拟南芥相比,过量表达NAC103转基因植株对内质网胁迫的耐受性更高,而低量表达NAC103转基因植物对内质网胁迫更敏感。因此,拟南芥转录因子NAC103在抵御内质网胁迫的抗性应答中具有重要作用。     

马铃薯HD-Zip I家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子, 在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因, 其开放阅读框为759 bp, 编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯1号染色体, 其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水及高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达, 其根中表达量最高。qRT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、NaCl和ABA诱导, 受低温抑制。构建了由组成型表达启动子CaMV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体, 通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后, 转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P<0.05), 而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P<0.05); 转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株; 说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。     

转录因子ABP9基因过表达对植物生长发育的影响分析

【研究目的】为分析玉米ABA/逆境响应转录因子ABP9基因过量表达对植物生长发育的影响以利用该基因开展抗逆分子育种。【方法】本研究构建了35S启动子驱动ABP9组成型表达的植物表达载体，获得了过表达ABP9基因的拟南芥转基因株系，并在正常生长条件下，比较了转基因植株和野生型在种子萌发、营养生长和生殖生长阶段的形态和生理变化，分析了可能的分子机制。【结果】结果表明，正常生长条件下，转基因植株与野生型相比表现出萌发，幼苗生长以及开花阶段的生长抑制；气孔开度减小，叶片内源ABA含量降低；ABA信号传导基因表达增强，而ABA合成基因表达降低；而且这些效应在ABP9基因表达相对较强的转基因株系中表现更明显。【结论】说明ABP9基因过量在正常生长条件下即诱导转基因植株产生耐逆反应，抑制植株的生长发育。因此，在利用ABP9基因进行转基因抗逆育种时须考虑控制ABP9基因适时适量表达。     

马铃薯HD-Zip Ⅰ家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子,在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因,其开放阅读框为759 bp,编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯第1染色体,其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水和高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达,其根中表达量最高。q RT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、Na Cl和ABA诱导,受低温抑制。构建了由组成型表达启动子Ca MV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体,通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后,转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P0.05),而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P0.05);转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株;说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。     

海岛棉转录因子基因GbMYB60的克隆、表达及其抗逆性分析

MYB转录因子是在真核生物细胞内广泛存在的一类转录因子蛋白,在植物的生长发育、代谢调节、抗病抗逆、以及激素介导的信号路径等方面都发挥着重要的作用。本研究从海岛棉品种海7124中克隆得到一个MYB转录因子基因,根据序列同源性和进化分析,将其命名为GbMYB60。该基因序列长990 bp,编码一个36.9 kD的R2R3类MYB转录因子蛋白。GbMYB60蛋白被特异地定位于植物细胞核。GbMYB60基因的表达水平较低,在真叶中优势表达,根系中表达量最低。该基因受甘露醇、NaCl、低温、高温等非生物逆境,以及脱落酸、乙烯利、茉莉酸甲酯和水杨酸等植物激素的诱导上调表达。利用病毒诱导的基因沉默技术在海岛棉中干涉GbMYB60发现,降低GbMYB60基因的表达水平,使棉花幼苗对高盐胁迫的耐受性降低;但GbMYB60干涉的植株在甘露醇溶液的处理下与对照植株并无显著的抗性差异。     

OsRPK1基因过表达和RNA干涉对水稻苗期耐盐性的影响

水稻OsRPK1基因属于富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶,在盐胁迫下其表达量暂时升高后出现明显下降。前期研究表明, OsRPK1基因过表达会造成拟南芥非生物胁迫耐受性明显降低。本研究对OsRPK1基因在水稻中实现过表达和RNA干涉,进而对OsRPK1的抗逆性功能加以探究。结果表明, OsRPK1基因表达量增加时,水稻幼苗表现为耐盐性下降;RNA干涉则使水稻幼苗表现为耐盐性增加。盐胁迫后OsRPK1过表达植株脯氨酸含量低于野生型、MDA含量和相对电导率显著高于野生型,而OsRPK1-RNAi水稻植株的脯氨酸含量显著高于野生型、MDA含量和相对电导率显著低于野生型。因此, OsRPK1基因的表达量对水稻耐盐性具有明显影响,脯氨酸含量及细胞质膜受破损程度的改变可能是造成转基因水稻耐盐性变化的内在原因。本研究为进一步阐明OsRPK1基因的抗逆作用机制奠定了基础,对于通过调整该基因表达改良水稻的耐盐性具有重要意义。     

马铃薯StWRKY15在转基因烟草的耐寒性分析

WRKY转录因子在植物的正常生长发育以及逆境生长过程中起着重要作用.本研究以4℃作为低温胁迫水平,对'青薯9号'马铃薯组培苗进行胁迫处理.通过RT-qPCR技术对马铃薯的5个WRKY转录因子基因进行表达分析,筛选出对低温响应的基因,构建表达载体遗传转化烟草,初步分析基因的功能.结果 显示,4℃低温胁迫下,马铃薯中的StWRKY15基因上调显著(P＜0.05);STRING预测分析StWRKY15编码蛋白的互作蛋白,主要包括StWRKY72编码蛋白、StGRAS6编码蛋白、c2结构域QUIRKY蛋白;通过双酶切方法成功获得重组质粒PRI101-StWRKY15;冻融法介导转化烟草,过表达StWRKY15基因显著提高了转基因烟草的耐寒性.4℃低温胁迫下,StWRKY15基因的过表达明显增加了脯氨酸、可溶性糖及总蛋白含量,降低了丙二醛含量;胁迫10d时,转基因烟草的长势优于野生型烟草.综上所述,可推断出StWRKY15对低温胁迫有响应,在逆境胁迫下可减轻植株受到的损伤,在一定范围内增强转基因烟草的耐寒性.本研究为进一步了解马铃薯WRKY转录因子的功能提供了理论依据.     

农杆菌介导的ZmRLK基因转化玉米的分析

玉米是世界上非常重要的粮食作物,其产量受诸多生物胁迫及非生物胁迫的影响。转基因技术是玉米遗传改良的重要途径之一。利用转基因技术把抗逆基因导入玉米优良自交系,并使其后代具有抵抗逆境的能力,减少损害,从而实现高产稳产。本研究通过将抗冷基因ZmRLK在玉米自交系Y423中遗传转化,得到过量表达ZmRLK基因的抗冷玉米新种质。结果表明,以玉米自交系Y423幼胚为受体,经检测获得ZmRLK过表达阳性植株89株;干扰载体获得121株阳性植株;空载体获得31株阳性植株。转基因阳性植株的获得为培育转基因玉米新品种提供帮助。     

植物RNA干涉载体的构建及其在水稻基因表达沉默中的应用

为了方便利用RNA干涉（RNA interference，RNAi）研究植物基因的功能，本研究构建了2个用于RNAi的植物转化载体pRNAi-35S和pRNAi-Ubi。这两个载体以pCAMBIA双元载体为骨架，含有2个多克隆位点区进行目的基因片段的正向和反向克隆，并分别由CAMV35S启动子和玉米泛素基因启动子控制发夹结构RNA的产生。为了验证该载体的有效性，用PCR扩增了1个水稻转录因子（Arabidopsis AP2／EREBP同源基因）基因片段组装入pRNAi—Ubi，转化水稻获得转化体。在所检测的7株转化株中，5株的内源目标基因的mRNA被降低至RNAblot检测不到的水平。这些结果说明本研究构建的RNAi载体对基因表达沉默是有效的。     

水稻育性调控相关基因RNAi载体的构建及其表型鉴定

利用RNAi干扰技术研究不同基因对花粉发育、卵细胞发育和合子胚发育的影响是一种重要的手段。本研究通过筛选水稻在生殖发育过程中的9个重要调控基因,构建基因的RNAi表达载体,分析转基因植株育性及相关性状表型,以期探明RNAi表达载体对靶标性状的干扰效应。其中,AT61~AT63、AT64~AT66、AT67~AT69表达载体分别靶标花粉育性、卵细胞发育以及合子胚发育的调控。结果表明,除RNAi表达载体AT64没有获得转基因植株外,其余8个RNAi表达载体均获得了转基因植株;对T0代转基因植株的花粉育性、结实率以及潮霉素筛选(40 mg/L)发芽率检测的统计结果显示,RNAi表达载体AT62(花粉发育调控)、AT65(卵细胞发育调控)和AT67(合子胚发育调控)的干扰效应较强。本研究结果将为创制新型水稻基因工程不育系提供策略和选择。     

水稻蛋白二硫键异构酶基因沉默载体构建及其转基因后代的高温结实特性分析

采用RT-PCR法亚克隆了PDI基因保守区内450 bp的靶标序列作为干扰区段, 构建了含有内含子hpRNA (ihpRNA)的双元表达载体pTCK303-RiOsPDI, 经农杆菌介导转化日本晴, 获得转基因植株; 通过在T₀代对其潮霉素(Hyg)抗性基因的PCR鉴定, 确定携带有干扰片段的T-DNA区已整合到水稻基因组中, 且在转基因T₁代符合3∶1的分离模式。半定量PCR和荧光定量PCR的检测结果表明, PDI基因沉默转基因阳性植株不同器官中的PDI表达量均显著降低, 尤其是其籽粒中表达量较微, 几乎能引起靶基因80%左右沉默。对转基因T₂代植株的高温结实特性和籽粒理化品质的检测结果, PDI基因沉默会引起高温胁迫处理下结实率的大幅度降低, 耐热性显著下降, 但其在常温处理下的结实率与对照之间无显著差异。此外, PDI基因沉默后, 稻米的透明度下降、垩白度增加, 但对籽粒粗蛋白总量和直链淀粉含量的影响不甚明显。     

转GHABF4转录因子棉花植株的耐盐性研究

AREB/ABFs转录因子家族基因主要参与干旱、高盐、低温等胁迫应答反应。为了获得具有较高耐盐水平的棉花新种质材料,通过农杆菌介导法将耐盐转录因子基因(GHABF4)导入陆地棉中棉35中,通过对转化植株的卡那霉素初步筛选及T1、T2、T3目的基因PCR的分子检测,获得T3转基因棉花纯合系。通过盐胁迫试验对5个T3转基因棉花株系和非转基因棉花对照进行耐盐性分析。结果表明,在200 mmol/L Na Cl胁迫下,与非转基因对照相比,5个转基因棉花株系株高提高2.5~4.4 cm,地上部分的鲜质量增加3.6%~11.8%;且抗氧化物酶SOD、POD、CAT活性以及叶绿素含量提高。在盐胁迫条件下,转GHABF4基因棉花表现出优良的生长和生理优势,转GHABF4基因能够提高棉花的抗盐能力。     

水稻OsNCED4基因的克隆及功能初探

脱落酸(abscisic acid,ABA)是一种抑制植物生长的植物激素,因能促使叶子脱落而得名,在植物逆胁迫中发挥关键作用。由NCED基因编码的9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED),是ABA在高等植物中的关键酶。本研究已成功从水稻Ilmibyeo(O.sativa L.ssp.japonica)基因组中克隆得到Os NCED4,生物信息学分析表明,Os NCED4基因位于水稻第7号染色体上,ORF全长1749 bp,无内含子结构,编码582个氨基酸,具有NCED家族的RPE65保守结构;以该基因和其启动子序列构建组织表达载体pOsNCED4::GUS、pCaMV35S::OsNCED4:EGFP和RNAi干扰载体p Ca MV35S::OsNCED4:RNAi,用于基因表达和功能分析,并利用农杆菌介导的方法,成功获得了相应遗传载体的转基因植株;GUS染色结果表明,该基因在叶片、叶耳、小穗等组织部位均有表达;RT-PCR结果显示,Os NCED4在水稻不同生育期的根、茎、叶、叶鞘和穗子中均有不同程度的表达,但表达量具有明显的差异;亚细胞定位结果显示,OsNCED4基因编码的蛋白定位于细胞核;与野生型植株相比,RNAi植株的花粉育性无明显差异,而结实率显著下降。该研究结果为进一步研究水稻OsNCED4基因表达的调控,以及为水稻生长发育上的功能研究提供了科学依据。     

玉米ppc基因过表达对转基因水稻光合速率的影响

通过转基因技术将外源ppc基因导入水稻以期增加产量是国内外的重要研究领域。然而,关于ppc基因过表达能否提高转基因水稻的光合速率至今尚无定论。本研究将玉米ppc基因导入水稻中花8号,获得大量转基因水稻植株。经PCR筛选、PEPC活性测定、Southern和Western杂交分析,表明玉米ppc基因已经整合到受体水稻基因组中,并得到了正确和高效的表达。测定了温室内种植的T₁代6个PEPC活性不同的转基因水稻植株的光合速率,只有活性最高的株系的光合速率显著增加,增加的幅度为27.3%。在旱作栽培条件下测定了T₃代33个转基因株系的光合速率,结果表明在高温、高光强下,绝大多数转基因水稻的光合速率增加,最大提高了68.8%。比较6个转基因株系的T₁和T₃代看到,逆境胁迫条件下转基因水稻光合速率明显提高。以上结果表明水稻中导入ppc基因可以提高其光合速率,特别是逆境条件下的光合速率。     

谷子转录因子基因SiNAC45在拟南芥中对低钾及ABA的响应

NAC(nascent polypeptide-associated complex)转录因子在植物生长发育和非生物胁迫响应等过程中发挥重要的调控作用,目前,关于NAC转录因子参与耐低钾胁迫的研究报道很少。本研究在前期工作对低钾胁迫的转录组测序基础上,对筛选出的一个低钾胁迫下表达量上调的NAC类转录因子基因SiNAC45进行了深入研究。结果表明,SiNAC45基因全长1383 bp,编码461个氨基酸,分子量为50.7 k D,等电点为6.92。SiNAC45在20~100个氨基酸之间有一段NAM保守结构域。系统进化树结果显示,SiNAC45位于NAC基因家族的第1亚族。基因表达谱分析显示,SiNAC45主要在谷子根部表达,并且能够被低钾和ABA诱导表达。亚细胞定位结果显示SiNAC45定位于细胞核。基因功能分析结果显示,在不同浓度低钾处理下,和野生型拟南芥相比,SiNAC45转基因拟南芥的根长和植株鲜重显著增加,说明过表达SiNAC45可以提高转基因植物对低钾胁迫的抗性。下游基因表达分析结果显示,在SiNAC45转基因植物中两种重要的钾离子转运体基因AKT1和HAK1的表达显著提高,证明SiNAC45通过调控植物钾离子转运体基因的表达影响植物对低钾胁迫的耐性。种子萌发试验结果显示,SiNAC45转基因拟南芥与野生型拟南芥相比对ABA的敏感性降低,说明SiNAC45可能负调ABA信号。     

转水稻OsSIK1基因玉米植株的获得及抗旱性分析

类受体激酶基因Os SIK1具有通过激活抗氧化系统,增强水稻对于干旱和盐胁迫抗性的作用。为了丰富可利用的作物抗旱基因,获得具有较高抗旱水平的玉米新种质,通过超声波辅助花粉介导法,将水稻类受体激酶基因Os SIK1导入玉米自交系郑58中,并对转化株进行卡那霉素筛选及T1、T2、T3的PCR及Southern Blotting杂交等分子检测,获得转化植株并在T3获得转基因纯合株系。对T3转基因玉米和非转基因玉米对照以16.1%的PEG模拟水分胁迫进行抗旱性分析。结果表明,与对照相比,在水分胁迫处理下,转基因玉米株系叶片相对含水量提高了7.4%~19.8%,叶绿素含量提高了11.3%~106.9%,SOD活性上升45.8%~93.4%,而转基因玉米叶片的相对电导率下降了35.4%~58.1%,MDA含量下降了25.7%~50.4%,说明转Os SIK1基因玉米植株抗旱性得到提高,其中,5个转化株系与对照在抗旱性方面有显著差异,且生长状况明显优于对照。综上所述,研究最终获得5个转Os SIK1基因玉米株系,并证明导入水稻Os SIK1基因可以提高玉米植株的抗旱性。