文心兰生物钟基因OnELF3启动子克隆与表达分析

为了解文心兰生物钟基因OnELF3的转录调控,本研究采用TAIL-PCR技术从文心兰基因组中克隆到OnELF3基因起始密码子上游2 204 bp的启动子序列。使用BDGP、PlantCARE和PLACE在线软件对OnELF3基因启动子的转录起始位点与顺式作用元件进行预测。结果表明启动子序列除包含TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件外,还包含组织特异性元件、光调控元件、植物激素响应元件、胁迫反应响应元件和昼夜节律调控元件等。为探究OnELF3启动子的表达活性,构建pCAMBIA1301-p OnELF3p:GUS载体,利用农杆菌介导法,转化烟草与拟南芥。烟草叶片瞬时转化表明克隆的OnELF3启动子序列具有启动子活性。转化拟南芥结果表明,OnELF3启动子能够驱动下游的GUS基因在T2代拟南芥中稳定表达,GUS组织染色显示该启动子呈现发育与组织特异性表达。这些结果为进一步研究文心兰OnELF3基因的转录表达调控与相关功能分析提供基础。     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

马铃薯细胞壁蔗糖转化酶基因StCWIN1启动子克隆与表达及其在干旱胁迫下的作用分析

植物细胞壁蔗糖转化酶（cell wall invertase,CWIN）是源、库组织蔗糖代谢及胁迫应答的关键酶。本研究利用基因步移法克隆马铃薯StCWIN1启动子片段,应用PlantCARE在线软件对启动子区域的作用元件进行分析,将融合StCWIN1启动子与GUS报告基因的表达载体转化拟南芥野生型,并利用组织化学染色和GUS实时定量PCR技术探究启动子表达活性、组织表达特性和响应干旱胁迫的表达规律。结果表明,克隆获得StCWIN1基因上游1956 bp启动子序列,其中包含核心调控、植物激素、防御及胁迫、光响应等关键元件;StCWIN1启动子在根、柱头和果荚组织中的表达活性高于其他组织;转StCWIN1启动子拟南芥株系叶片中GUS表达量高于野生型,且干旱胁迫显著抑制了GUS相对表达量。本研究克隆得到具有活性的StCWIN1启动子,基于研究结果推测目的基因可能参与根、花和果实等器官发育,对干旱胁迫也发挥应答调节作用。     

巨胚稻OsGAD_3基因启动子的序列及活性分析

本研究以富含γ-氨基丁酸的巨胚稻"Tge B"基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到GABA合成关键酶基因Os GAD3的上游959 bp启动子序列。序列分析表明:Os GAD3启动子不仅含有转录必备的TATA box、CAAT box元件,还含有分生组织特异性表达调控元件CAT-box、CCGTCC-box以及一些非生物胁迫和激素响应元件等。将该启动子序列与GUS基因融合构建表达载体,转化水稻后进行GUS组织化学染色分析,结果显示,Os GAD3启动子驱动的GUS基因在转基因植株的根、茎中具有较高的表达活性,且在根尖和茎初生韧皮部区域的表达更为明显,在种胚及叶片切口处也能检测到GUS表达。浸水后种胚中的GUS活性显著提高,且随着浸水时间的延长呈逐渐增加趋势。研究结果为了解巨胚稻Os GAD3的表达调控机制提供了依据。     

葡萄逆境胁迫诱导启动子的克隆及表达分析

为了研究葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的表达特性,采用PCR技术从葡萄中克隆了CAN70200.1基因上游一段长度为1 354 bp的启动子片段,命名为PCAN。采用Plant CARE和PLACE启动子在线预测工具分析表明,PCAN启动子序列具有CAAT-box、TATA-box基本的顺式作用元件和一些参与非生物胁迫、光和植物激素应答相关的顺式作用元件。为验证启动子的表达特性,将PCAN启动子连接到p CAMBIA1391Z载体GUS基因的上游,构建成植物表达载体p1391Z-CAN,并通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR鉴定,获得转基因植株。对转基因烟草植株进行逆境胁迫处理发现,在干旱处理120 min后,PCAN启动子活性达到最强;而4℃低温处理30~60 min时,PCAN启动子活性达到最强,表明PCAN启动子具有低温和干旱胁迫诱导表达特性。     

大豆CHI1基因启动子的克隆及功能初探

为了解大豆ClassⅠ几丁酶基因(Chitinase gene)对不同胁迫响应的分子机制。利用PCR技术克隆了大豆ClassⅠChitinase基因的启动子片段(Gm CHI1p),序列分析表明,扩增片段(1 641 bp)与Gen Bank中的已知序列同源性达99.8%,且含有多个胁迫响应调控元件。利用GUS基因上游无启动子的表达载体p CAMBIA1391Z,构建GmCHI1p与GUS基因融合的植物表达载体pCAM-Gm CHI1p,并通过农杆菌介导法导入烟草中。在转基因烟草愈伤组织中检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。对转基因烟草中的GUS活性进行初步定性分析,结果表明,GmCHI1p可驱动GUS基因在转基因烟草的根部特异性表达,而且在伤害处理的叶片中检测到GUS的强烈表达,表现出明显的根组织特异性及伤害诱导性。这种伤害诱导仅在伤害组织部位及其附近高效表达而没有被长距离传递,预计该启动子在转基因抗虫分子育种中具有巨大的应用前景。     

花生AhDGAT2a基因启动子的克隆和功能验证

二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是三酰甘油(TAG)合成途径的限速酶,对脂肪酸合成的调节具有关键作用。为了研究AhDGAT2a的表达调控,利用GenomeWalking方法从鲁花14基因组中克隆了AhDGAT2a上游5¢侧翼调控区1200 bp序列,即AhDGAT2a启动子(pAhDGAT2a)序列,并利用生物信息学软件分析其包含的调控元件,发现其含有多个TATA-box和CAAT-box、光调控元件、胁迫防御相关元件和激素响应元件。用pAhDGAT2a构建pAhDGAT2a:GUS植物表达载体并转化烟草品种SR1。利用组织染色法鉴定转基因烟草的GUS表达模式,发现在转基因烟草的各个器官均有GUS酶活,而在柱头、花药和幼嫩种子中表达量较高,说明pAhDGAT2a具有一定的组成型启动子活性。     

二穗短柄草逆境诱导型启动子pBdDREB-47的克隆及功能验证

前期研究分析二穗短柄草逆境胁迫下的AP2/EREBP基因家族的表达谱时,发现Bd DREB-47响应多种逆境胁迫,因此本研究利用PCR的方法克隆了该基因上游1 388 bp的启动子区域,并命名为pBdDREB-47。启动子分析软件Plant CARE分析表明:pBdDREB-47含有TATA-box、CAAT-box等启动子核心元件,同时还含有LTR、ABRE等多种胁迫响应相关元件。因此我们将pBdDREB-47构建到启动子检测载体p CAMBIA1381-GUS上,形成p CAMBIA1381-pBdDREB-47-GUS,以检测其启动子活性。通过农杆菌介导法转化烟草,得到的转基因烟草T1代植株GUS染色结果表明:该启动子在冷、干旱及盐胁迫条件下能够显著诱导GUS报告基因的表达,可进一步用于植物抗逆遗传育种改良工作。     

白桦W-box元件的载体构建及驱动GUS基因表达分析

植物体内的启动子含有多种顺式作用元件,通过调控下游基因的表达,影响植物的生长发育。本研究以白桦中含有BplMYB46启动子的质粒为模板,将含有W-box元件的启动子短片段克隆出来,经过酶切、连接和热激转化到大肠杆菌中。经过PCR检测及测序分析,结果表明pCAMBIA1301-W-box-GUS重组载体构建成功。获得工程菌后,瞬时侵染烟草后进行GUS染色,结果显示,烟草叶片能被染色,但颜色较浅,说明W-box元件能够驱动GUS基因表达,但驱动能力较低。本研究为后续分析上游转录因子与W-box顺式作用元件的互作以及筛选诱导型启动子从而改良白桦品质提供前期基础数据。     

rd29A启动子的克隆及提高烟草抗逆性的研究

根据GenBank上公布的rd29A基因序列(D13044),利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中扩增得到了rd29A基因的启动子片段.序列分析表明,该片段与D13044有99%的同源性,它包括了DRE等4种完整的顺式作用元件.与GUS基因融合构建双元植物表达载体pBI-rd.转基因烟草的GUS活性组织染色分析及Northern杂交分析均表明,3种胁迫处理均可诱导GUS基因大量表达.其中,15%PEG和0.5%NaCl胁迫处理的转基因烟草比0℃低温处理的转基因烟草的GUS表达量高,而未经胁迫处理的转基因烟草的GUS基因只有少量表达.这些结果表明,rd29A属胁迫诱导型启动子,当植物遭受逆境胁迫时,rd29A启动子可以驱动下游目的基因超量表达,这就为通过基因工程途径提高植物抗逆性奠定了基础.     

陆地棉钾转运体基因GhHAK5启动子的克隆与功能分析

KUP/HAK/KT钾转运体基因的转录调控是植物响应低钾胁迫的一项重要机制。克隆和分析棉花钾转运体基因的启动子,不仅有助于了解其表达模式及调控机制,对于改良棉花的钾吸收特性也具有重要意义。陆地棉钾转运体基因GhHAK5是一个在根中特异性高表达的基因,其表达受低钾胁迫诱导,目前关于该基因启动子的功能还不清楚。本研究以陆地棉品种百棉1号为材料,通过PCR方法对GhHAK5上游2000bp启动子片段(pGhHAK5)进行克隆,并通过转化拟南芥、GUS组织定位和低钾诱导表达特性分析来研究其功能。结果表明, pGhHAK5除具有TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有多个响应于光、逆境胁迫、植物激素和生物钟等的顺式作用元件。pGhHAK5与雷蒙德氏棉pGrHAK5在重要调控元件的数量和位置分布上具有较高的一致性,均具有5个参与根特异性表达调控的元件(ATAAAAT)和1个参与低钾条件下转录调控的ARF转录因子结合位点(TGTCNN)。GUS组织化学染色结果显示,转基因拟南芥幼苗的叶脉和胚轴维管束组织染色较深,根系染色较浅;成熟期转基因拟南芥植株的根、叶脉和花萼维管束组织染色...     

棉花HSP70基因植物表达载体的构建及转化烟草的研究

为研究棉花HSP70 基因在转基因植物中抗旱效果,利用前期克隆的GhHSP70 基因,以pCAMBIA1304 质粒为植物表达载体,构建了GhHSP70 基因的植物表达载体CAMBIA1304-HSP70;采用冻融法转入根癌农杆菌EHA105 菌株,通过叶盘法对模式植物烟草进行遗传转化研究。结果表明,在潮霉素(50 mg/L)选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过PCR方法以及GUS基因组织化学法检测鉴定转基因烟草,其中有5 株为阳性植株。初步证实了GhHSP70 基因已导入烟草基因组中。为进一步研究该基因的功能提供实验基础,同时为后续转化棉花改善其抗旱能力奠定基础。     

桑树1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(MnACO)启动子功能分析

1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)作为关键酶,能够催化1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)形成乙烯。为探究桑树MnACO基因在桑树生长发育和抵御外界胁迫中的功能,本研究构建了p MnACO::GUS的植物表达载体并转化拟南芥。采用GUS组织染色法鉴定转基因拟南芥不同生长阶段及胁迫处理后的GUS活性。通过PCR克隆得到MnACO1和MnACO2启动子片段,它们分别为1518 bp和1429 bp,启动子区域有大量的TATA-box、CAAT-box和其他响应外界刺激的顺式作用元件。GUS活性分析显示MnACO启动子能驱动GUS在拟南芥中表达;MnACO1启动子能驱动GUS在拟南芥的根、叶片、花瓣、花药、花丝、柱头以及果荚中表达,且活性较MnACO2强;MnACO2启动子不能驱动GUS在果荚中无表达。转MnACO1和MnACO2植株经不同逆境处理后GUS表达活性不同,转MnACO1植株的GUS活性随处理延长时间而减弱,转MnACO2植株GUS活性随处理时间延长而增强。q RT-PCR检测2周苗龄的桑幼苗在经过胁迫处理后Ma ACO1和Ma ACO2的基因表达量,发现Ma ACO基因的表达模式与MnACO启动子GUS活性变化趋势一致。本研究结果表明,MnACO为诱导型启动子,MnACO1兼具组成型启动子特性,MnACO2兼具组织特异型启动子特性。MnACO1在转基因植株中对胁迫响应能力更强,预示着可将其用来调控改良桑树品种抗逆性靶基因;Ma ACO2可能与果实成熟有关,可将其启动子作为果实特异性启动子对桑椹品质进行合理改良。     

Ta6-SFT在烟草中的逆境诱导型表达及抗旱性

分别构建CaMV35S启动子驱动的Ta6-SFT组成型植物表达载体和rd29A启动子驱动的逆境诱导型表达载体。利用农杆菌介导法分别导入烟草中,获得转基因株系,Southern杂交和Northern点杂交确定Ta6-SFT整合进转基因株系基因组中,并正常转录。以非转基因株系作对照,对2种转基因烟草株系进行干旱胁迫处理,采用半定量RT-PCR分析Ta6-SFT在转基因株系中的表达,同时测定胁迫0 d和18 d果聚糖含量及部分农艺性状。结果表明,含有rd29A启动子的逆境诱导型株系中Ta6-SFT相对表达量比在含CaMV35S启动子的组成型株系中高,而且积累更多的果聚糖;从株高、1/2株高处茎粗、叶面积数据来看,逆境诱导型转基因株系的生长势优于组成型株系,对干旱表现强的耐性。因此,在转基因植物中逆境诱导型表达Ta6-SFT基因将发挥更好的抗逆功能。     

拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶启动子在转基因烟草中的表达特性分析

通过对报告基因GUS产物的分析进行了拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶（MPBQ MT）启动子在转基因烟草中的表达特性的初步研究。构建含该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化烟草,对转基因烟草进行GUS组织化学染色和GUS荧光定量分析该启动子表达特性。GUS在转基因烟草的根和种子中基本不表达,茎上有一定表达,叶上表达量最高,约是茎的4.7~10.9倍。结果表明MPBQ MT基因启动子主要在烟草绿色组织中特异性高表达。     

棉花器官特异病原相关启动子的克隆与分析

通过Tail PCR分离了GHNBS基因的5'侧翼序列,PLACE分析表明其含有CAAT-box、TATA-box及乙烯、茉莉酸甲酯、脱落酸应答元件,病原菌诱发子反应元件W boxes、GT-1、MYB、MYBST1和MYB1LEPR等。同时,在这段序列上还存在一些根特异表达元件。包括2个as-1和1个EECCRCAH1在内的3个增强子元件也存在于这段序列的上游区域,它们可能增强GUS基因在转基因植物中的表达。将GHNBS基因的5′调控序列以不同缺失与GUS基因融合转化拟南芥,发现GUS基因主要在根、茎的韧皮部和叶脉中表达。PGN-1559和PGN-1117表现为器官特异性表达。而PGN-476不能特异表达,同时也不能在根部表达。SA,ABA,MeJA,Eth-ylene,枯萎病菌和细菌DC3000处理后GUS活性均有显著上升,说明GHNBS基因的5′调控序列含有相应的应答反应因子,是一个器官特异以及与病原相关的启动子。