草莓FvARF5基因的克隆、生物信息学及表达分析

生长素响应因子ARF是一类新的转录因子,通过激活或抑制生长素响应基因的表达调控植物的生长发育过程。为解析草莓生长素响应因子FvARF5在草莓形成过程中的功能,以草莓为试验材料,克隆了FvARF5基因并进行了生物信息学分析,利用qPCR分析了FvARF5在草莓不同组织及植物激素处理下的表达模式。结果表明,FvARF5基因开放阅读框为2 745 bp,编码914个氨基酸,蛋白质分子质量为100.65 ku,等电点为5.25。多序列比对和系统进化树分析表明,FvARF5基因具有保守的B3 DNA结合结构域和生长素响应因子保守结构域,与蔷薇科月季ARF5基因的进化关系最近,相似度达95%。亚细胞定位预测分析表明,FvARF5蛋白定位于细胞核中。启动子分析显示,FvARF5基因具有多样化的激素应答元件。qPCR结果表明,FvARF5存在组织表达差异,在茎和绿果中表达量较高。另外,FvARF5基因表达受到生长素和赤霉素的诱导,初步推测该基因可能参与了生长素和赤霉素调控草莓果实的形成过程。为进一步研究FvARF5基因的功能奠定基础。     

罗汉果生长素响应因子SgA RF8基因的克隆及表达分析

基于转录组Unigene序列信息,结合RACE技术,克隆罗汉果生长素响应因子基因Sg ARF8的全长。采用同源克隆法获取罗汉果Sg ACTIN基因,以该基因为内参,通过实时荧光定量PCR检测Sg ARF8在罗汉果不同器官组织中的时空表达。结果表明:获得Sg ARF8基因c DNA全长序列3 266 bp,Gen Bank登录号KU949383,最长ORF为2 547 bp,编码848 aa的蛋白质,预期分子量94.42 k D,等电点5.67,该编码蛋白具有DBD、CTD和MR等转录因子ARF特征性结构域,其5'端和3'端区域比较保守;克隆得到罗汉果内参基因Actin基因部分序列,命名为Sg ACTIN,Gen Bank登录号为KU949382;实时荧光定量分析表明,罗汉果Sg ARF8在茎、叶、芽、雌蕊、雄蕊、幼果中普遍表达,并且在雌蕊和15 d幼果中表达量较高。可见Sg ARF8广泛参与罗汉果生长发育调节过程,尤其与雌蕊和幼果的器官形态建成密切相关,也暗示该基因在罗汉果性别调控和单性结实遗传改良中具有重要应用价值。     

巴戟天MoTPS基因及其启动子克隆与分析

为探究巴戟天中MoTPS基因的序列特征及其在生长素IAA处理下的表达模式。本研究利用RT-PCR获得3个巴戟天MoTPS基因的全长c DNA序列,分别命名为MoTPS1、MoTPS2和MoTPS3。基因序列分析显示,基因全长分别为2 841、2 126和2 144 bp,开放阅读框(ORF)分别为2 481、1 668和1 943 bp,分别编码826、555和640个氨基酸。序列分析结果显示,3个MoTPS基因编码蛋白均为亲水性的不稳定蛋白,3个基因的氨基酸序列含有萜类特有的天冬氨酸(DDXXD)富集基序及RXR保守基序,并含有萜类ClassⅠ超级家族结构域。同源比对分析显示3个MoTPS基因氨基酸序列与咖啡树匹配的TPS基因同源性均达到75%以上。系统进化树分析表明MoTPS1基因属于TPS-f亚族分支,而MoTPS2和MoTPS3基因同属于TPS-d亚族分支。启动子克隆得到序列长度为739 bp的MoTPS3基因启动子,其含有多种光响应、激素响应顺式元件,如G-box、Sp1、P-box、TGA-element等。荧光定量PCR分析表明3个MoTPS基因在巴戟天根、茎、叶中稳定表达且具有组织特异性;经生长素IAA处理后,3个MoTPS基因在根中的相对表达量均显著上调。因此研究推测,3个MoTPS基因参与巴戟天根中萜类次生代谢物合成过程且生长素IAA对MoTPS基因的表达调控发挥重要作用。     

绿豆生长素响应因子基因家族序列特征及分子进化

绿豆种子萌发率严重影响和制约其田间产量,研究利用与绿豆种子萌发相关的基因资源具有十分重要的意义。本研究拟通过查询绿豆转录组数据库,分离包含完整ORF的生长素响应因子(ARF)基因家族成员,对比分析该家族成员的蛋白保守结构域,基于氨基酸序列同源性构建系统进化树。结果表明:分离到22个包含完整ORF的ARF基因,其核苷酸序列长度范围为905~3 624 bp,其编码氨基酸序列长度的范围为237~761 aa。其中仅有4个ARF基因包含保守的B3 DNA结合结构域、Auxin响应因子和AUX/IAA家族蛋白结构域,其他基因存在1~2个保守结构域的缺失。系统进化树结果显示,绿豆22个ARF基因与拟南芥12个ARF基因共划分为3大类,9个亚类。这些结果为进一步揭示绿豆ARF基因功能多样性,同时为将来遗传工程改良绿豆品种提供理论参考。     

陆地棉GhLEA3基因的克隆及其响应低温胁迫表达分析

【目的】本研究旨在探索棉花GhLEA3基因的结构特征及其在低温胁迫下的表达模式,研究其抗逆功能。【方法】利用同源序列克隆法在陆地棉中克隆GhLEA3;采用生物信息学方法分析其蛋白质性质,构建系统进化树。采用In-Fusion连接技术构建融合蛋白表达载体35S∷GhLEA3-GFP并进行亚细胞定位;在棉花三叶期进行叶片低温表达分析;采用农杆菌介导的花序浸染法将GhLEA3基因转入拟南芥;对T_3转基因拟南芥种子进行4℃低温萌发试验;低温处理后测转基因拟南芥叶片的电导率。【结果】GhLEA3基因编码序列全长1 218bp,编码405个氨基酸;GhLEA3蛋白含有4个功能结构域PF02987。陆地棉GhLEA3与拟南芥AtLEA3氨基酸序列之间相似性为52.6%。GhLEA3蛋白可能定位在液泡和小泡中。GhLEA3基因在低温处理的棉花叶片中上调表达。T_3转基因拟南芥低温萌发率显著高于野生型,低温处理后转基因拟南芥叶片电导率显著低于野生型。【结论】陆地棉GhLEA3属于典型的LEA3家族成员,与拟南芥AtLEA3亲缘关系最近;该基因响应低温胁迫,可能在抗冷中起重要作用。     

小麦小G蛋白Rab2基因TaRab2的克隆及其表达分析

小G蛋白Rab在真核细胞内的小泡运转过程中起重要作用。本文通过反向Northern筛选,从小麦抗旱品种旱选10 号水分胁迫诱导表达的cDNA文库中分离到与小G蛋白Rab2基因高度同源的EST片段。利用电子克隆和RT-PCR方法,在小麦中克隆了该基因的全长cDNA,命名为TaRab2（GenBank编号为AY851657）。测序结果表明,TaRab2的cDNA长度为824 bp,包含一个完整的633 bp的ORF,推测编码一个210个氨基酸的蛋白质。氨基酸多重比对分析表明,TaRab2编码的蛋白质与玉米、水稻、拟南芥及Sporobolus stapfianus等植物小G蛋白Rab2的同源性均大于90%。Northern杂交分析结果表明,TaRab2为水分胁迫诱导上调表达的基因,在水分胁迫6 h的表达量最高,随着胁迫时间的推移表达量下降。     

草莓FvARF2的克隆、组织表达分析及对外源激素的响应

ARFs家族基因广泛参与植物生长发育的调控过程。为了研究草莓生长素响应因子FvARF2在草莓生长发育过程中的功能,以‘丰香’草莓为实验材料,利用RT-PCR技术克隆草莓FvARF2基因,对其序列特征进行生物信息学分析,并利用Real-time PCR技术分析了Fv ARF2在草莓不同组织(包括根,茎,叶,花,绿果, 1/2红果及红熟果)及外源激素生长素(IAA)、乙烯利(C2H4)、脱落酸(ABA)处理下的表达模式。结果表明,Fv ARF2基因开放阅读框为2 469 bp,编码822个氨基酸;预测其分子量和等电点分别为91.1 kD和6.11,具有保守的B3 DNA结合结构域和生长素响应因子保守结构域;该基因启动子区含有生长素、ABA、茉莉酸甲酯及胁迫相关的顺式作用元件。进化分析表明FvARF2与甜樱桃ARF2B基因亲缘关系最近;Real-time PCR结果表明,FvARF2基因表达量存在组织表达差异,且对外源IAA、ABA和乙烯有显著性应答反应,说明该基因可能参与了生长素、ABA和乙烯调控草莓发育的信号转导过程。本研究为后继研究草莓FvARF2的功能和作用机制作为参考依据。     

中间锦鸡儿CiATAF1基因的亚细胞定位及表达分析

为研究NAC转录因子在非生物胁迫条件下的表达,以中间锦鸡儿为材料,克隆并分析了NAC转录因子家族CiATAF1基因。该基因ORF全长为873 bp,编码291个氨基酸,由2个内含子和3个外显子构成,具有典型NAC结构域。染色体步移法获得CiATAF1基因启动子826 bp,该启动子含有光、激素、厌氧诱导等多种响应元件。经拟南芥叶片原生质体瞬时表达分析亚细胞定位,CiATAF1基因主要定位于细胞核中。荧光定量分析表明:CiATAF1基因表达具有组织特异性,相比于中间锦鸡儿根和茎,在叶部表达量最高;在干旱、盐、冷、ABA处理下,CiATAF1基因表达量增加,推测该基因可能与非生物胁迫应答相关。CiATAF1同模式植物拟南芥及豆科其他植物的同源基因做多重序列分析,序列一致性为81.14%,表明ATAF1基因序列结构相对保守。生物信息学分析CiATAF1蛋白质属于不稳定的亲水蛋白,二级结构主要由α-螺旋、β折叠、无规则卷曲构成。研究结果对挖掘中间锦鸡儿抗非生物胁迫的基因和深入分析逆境胁迫机理具有重要意义。     

青花菜BoMYB基因的克隆与序列分析

通过培养青花菜幼苗并提取DNA,以所得DNA为模板克隆青花菜MYB基因,并对该基因进行测序。测序后,利用生物信息学手段进行序列分析,包括寻找同源序列、同源序列蛋白质翻译比对、分析翻译所得蛋白质的理化性质和二级结构,预测结构域和构建系统发育树。从青花菜中克隆得到的BoMYB基因,其编码263个氨基酸,蛋白序列中具有2个SANT结构域。对比在拟南芥中的研究推测,该基因可能在渗透胁迫响应中起作用。系统发育分析结果表明,BoMYB与欧洲油菜的MYB聚为一组,它们与拟南芥的MYB处于不同分支。对BoMYB基因的克隆与序列进行分析,为探究青花菜MYB基因的表达、功能及抗逆机理研究奠定了基础。     

富集小麦磷胁迫响应基因的cDNA差减文库构建和部分ESTs的功能鉴定

植物在形态学和生化代谢水平上对低磷胁迫逆境的响应,是特异表达基因在时空上精细协同作用的结果.以前期工作中鉴定的磷高效小麦品种石新828为材料.构建了富集不同低磷处理时间点特异表达基因的根系cDNA差减抑制杂交文库.获得的克隆总数为2 682个.对随机选取的文库克隆研究发现,克隆中插入的片段长度为250～750 bp.测序结果和功能比对发现,具有功能比对结果的克隆比例为70%,其中部分分别与小麦、大麦、水稻、玉米和拟南芥等植物种属高度同源,参与转录调控、蛋白质合成和代谢等多个生物学过程.该富集低磷胁迫响应基因文库为进一步鉴定小麦响应磷胁迫逆境的基因调控网络和克隆重要的磷高效相关基因奠定了坚实的基础.     

芸芥中DnaJ同源基因的克隆与表达分析

为研究芸芥自交亲和机理,采用mRNA差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)分析技术,从芸芥自交亲和系开花前柱头中获得1条差异片段。测序及DNA序列的生物信息学分析表明,该差异片段与拟南芥DnaJ蛋白同源基因At J3有较高同源性,暂命名为esAtJ3基因。该序列含有一个长度为297 bp的完整开放阅读框,编码98个氨基酸残基,含有一个DnaJ-C保守结构域,属于植物DnaJ超家族。esAtJ3基因编码的蛋白无信号肽,是一个亲水性蛋白,该蛋白主要由不规则卷曲和α螺旋组成。实时荧光定量PCR分析表明,esAtJ3基因在芸芥SC系开花前柱头中表达量较高,初步推测该基因可能参与芸芥亲和性调控。     

茶树己糖激酶基因CsHXK2的启动子克隆及表达特性分析

植物己糖激酶是双功能蛋白,具有磷酸化己糖和介导糖信号的关键性作用。前期研究中,我们从茶树中克隆获得4个己糖激酶基因,其中CsHXK2基因编码492个氨基酸残基,与拟南芥AtHXK3、番茄LeHXK4归为Type A类HXKs。利用RT-PCR技术,克隆获得长度为2029bp的CsHXK2基因启动子。CsHXK2基因可能受到光照、低温、病原菌、糖和多种激素等信号的调控,且可能特异性表达于叶、花、种子、根系、腋芽等组织。CsHXK2蛋白定位于叶绿体内。酵母突变体功能互补试验表明,去除叶绿体转运信号肽的CsHXK2成熟蛋白具有葡萄糖和果糖磷酸化活性。茶树组织特异性表达分析显示,CsHXK2基因在根和茎中表达量最高,而在老叶中表达量最低。CsHXK2基因的表达受低温胁迫而显著下调,经炭疽菌侵染的茶树叶片内CsHXK2基因的表达也受到显著抑制,而外源赤霉素(GA_3)处理的茶树叶片内CsHXK2基因表达显著上调。本研究结果表明,CsHXK2基因在茶树的生长发育过程和逆境胁迫响应中发挥重要的调控作用。     

北美鹅掌楸CCD1基因的克隆与表达分析

本研究以北美鹅掌楸为试验材料,从北美鹅掌楸和鹅掌楸转录组数据库中挖掘出37条CCD基因家族的EST序列,并将这些序列归类于CCD基因家族中。以其中一条预测为CCD1的EST序列为基准设计引物,通过反转录PCR(RT-PCR)与c DNA末端快速扩增(RACE)技术从北美鹅掌楸中克隆得到一条全长为1 929 bp的序列,命名为LtCCD1基因。该基因包含102 bp 5'端、177 bp 3'端非翻译区序列和1 650 bp的开放阅读框,共编码549aa。LtCCD1基因与多个物种CCD1基因相似度大于80%,其编码的蛋白质拥有CCD基因家族典型的结构域RPE65。系统发育分析发现,LtCCD1基因编码的蛋白质与Anthurium amnicola、Crocus ancyrensis和番红花的CCD1基因编码的蛋白质亲缘关系较近。LtCCD1蛋白质分子量为61.96 kD,等电点为6.10,属酸性蛋白;无规则卷曲是该蛋白质二级结构的主要成分。利用在线软件Target P进行亚细胞定位预测并结合CCD1蛋白在其它植物中的定位信息,推测该蛋白可能位于细胞质内。使用实时荧光定量PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析,发现LtCCD1基因在北美鹅掌楸的花瓣、花萼、雄蕊、雌蕊、花芽、叶、叶芽、茎8个组织中均有表达,表达量从大到小的顺序依次为:叶、花萼、花瓣、茎、雌蕊、叶芽、花芽、雄蕊。该研究结果可为进一步分析北美鹅掌楸中CCD1基因的功能奠定基础。     

玉米热激蛋白基因ZmHSP90-1的克隆及表达分析

HSP90是普遍存在于原核和真核细胞中的一种高度保守的分子伴侣。本研究从玉米中克隆了一个HSP90同源基因, 命名为ZmHSP90-1基因, 并对其进行了初步的序列分析。该基因cDNA序列全长2 371 bp, 开放阅读框2 094 bp, 编码697个氨基酸, 蛋白质分子量约79.98 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明, ZmHSP90-1基因编码蛋白含ATPase位点和HSP90保守结构域, 并与拟南芥、水稻等多种物种的热激蛋白高度同源; 进化树分析表明ZmHSP90-1与拟南芥AtHSP90.1基因关系较近, 蛋白序列相似性达88.3%。目的蛋白亚细胞定位显示, ZmHSP90-1蛋白在细胞质中表达。实时荧光定量PCR分析表明, ZmHSP90-1对非生物胁迫高温、高盐、ABA、低温、干旱均具有明显的应答反应。推测ZmHSP90-1是玉米的一个胁迫相关基因。     

甘蔗和斑茅Ⅲ型过氧化物酶基因（SoPOD-1和SaPOD-1）cDNA克隆与分析

研究旨在通过克隆甘蔗和斑茅Ⅲ型过氧化物酶基因(Prxs),分析比较2个物种Prxs基因差异,探讨2个物种Prxs功能差异的遗传基础。采用同源克隆方法,以高粱Prxs基因序列为探针,克隆获得甘蔗和斑茅Prxs基因。本研究从斑茅和甘蔗中成功克隆获得了4个Prxs基因cDNA序列,其中斑茅2个基因长度均为1083 bp,存在一个差异位点,甘蔗2个基因长度均为1084 bp,存在11个碱基差异。4个基因开放阅读框均为996 bp,编码331个氨基酸。蛋白质保守结构域分析表明,克隆获得的4个基因均具有Prxs典型保守结构域,为目标基因。系统进化分析表明,克隆获得的基因与高粱、玉米和水稻的同源基因相似性最高,在一些双子叶植物,甚至裸子植物也能找到其同源基因,且氨基酸序列的相似程度与物种分化的程度基本一致,可供植物分类作参考。该试验从斑茅和甘蔗中成功克隆获得了4个Prxs基因cDNA序列,为深入研究Prxs基因在不同植物中功能差异提供了一定的参考。     

欧李ChCBF1基因的克隆及生物信息学分析

本试验在欧李基因组研究的基础上,利用RT-PCR方法从低温处理的‘农大4号’欧李叶片中克隆到了ChCBF1基因,该基因CDS序列长度为690 bp,编码229个氨基酸的蛋白,分子量为25.10 kD,等电点为4.94,蛋白不稳定指数为58.72。二级结构主要由α-螺旋,延伸链,β-折叠和无规则卷曲构成。启动子分析表明,ChCBF1基因的启动子元件包括低温响应元件、多个光响应相关元件以及激素响应元件等一系列诱导型顺式调控元件。通过氨基酸同源比对和系统发育树分析发现,ChCBF1基因编码的氨基酸序列与桃的相似性最高,达到95%。本研究为后续逆境与休眠诱导相关方面的基因功能验证提供了帮助。     

烟草Myb转录因子NtBL1基因的克隆及其表达分析

为揭示Blind基因在普通烟草中的功能,通过同源克隆的方法从普通烟草K326的基因组中克隆得到1个Blind-like基因,即NtBL1,用PROSITE(ExPASy)、Sopma和Swissmodel等软件对NtBL1进行蛋白质结构域分析和高级结构预测,用Mega 7.0和MEME软件对NtBL1及其同源蛋白进行了进化树构建和结构分析,用半定量PCR分析了NtBL1基因在花、叶、根、茎、苗中的表达模式,用qRT-PCR技术分析了ABA、NaCl和PEG处理下NtBL1基因的表达模式。结果表明,NtBL1的开放阅读框长度为1 014 bp,编码337个氨基酸。半定量PCR结果表明,NtBL1在烟草的大部分组织和各时期普遍表达,但是根中的表达量最高。蛋白质结构域分析显示NtBL1是典型的R2R3 Myb家族蛋白,含有2个Myb-type HTH类型的DNA结构域。蛋白质高级结构预测表明,NtBL1蛋白高级结构主要由无规则卷曲和α-螺旋组成。进化和结构分析结果表明,NtBL1基因与番茄Blind等基因的进化距离较近,且具有相似的模体结构。qRT-PCR的结果显示NtBL1基因的表达受ABA的诱导,在处理24 h达到最高表达量;NtBL1基因的表达受NaCl处理的抑制,在24 h出现最低表达量。因此,NtBL1基因可能参与激素和盐胁迫调控下的侧生分生组织的发育。     

核桃ARF基因家族的鉴定及生物信息学分析

生长素响应因子(auxin response factor, ARF)是一类在植物生长发育过程中起着关键作用的转录调控因子。基于核桃(Juglans reiga)基因组数据库，本研究利用生物信息学方法，在全基因组水平上利用HMMER 3.0和BLAST软件对核桃ARF基因家族成员进行鉴定，共鉴定到了30个核桃ARF基因，其编码蛋白的长度在596～1 124 aa之间，蛋白分子量介于65 447.51～125 471.08 Da之间，等电点在5.27～8.31之间，均定位于细胞核。系统进化树分析，将其分为4个亚组(ClassⅠ～ClassⅣ)，同一亚组成员通常表现出相似的基因结构和保守结构域。保守结构域分析显示，30个JrARF蛋白均具有保守的B3、Aux＿resp结构域，大部分蛋白含有Aux/IAA结构域。这些基因不均匀地分布于核桃的15个染色体上。启动子顺式作用元件表明，该家族成员与众多光响应元件及逆境响应、激素应答等响应元件相关。利用转录组数据分析了ARF家族成员在核桃雌雄花芽分化过程中的表达模式，结果表明JrARF1、JrARF5、JrARF17等在雌花芽形态分化始期(FB-2)...     

甘蔗、斑茅及割手密Ⅲ型过氧化物酶基因克隆及比较分析

研究旨在通过比较分析甘蔗及其近缘种割手密和斑茅Ⅲ型过氧化物酶(Prxs)基因差异,探讨这三种植物Prxs功能差异的遗传基础。采用同源克隆方法,成功克隆获得了甘蔗、斑茅和割手密的Prxs基因DNA序列(Genebank登录号分别为KJ001797,KJ001798和KJ001799)。经测序鉴定,克隆获得的这三个基因DNA长度分别为3 030 bp、3 048 bp和3 028 bp,外显子长度均为1 083 bp,其中编码区长度为996 bp,编码331个氨基酸。蛋白质保守结构域分析表明,此三个基因均具有过氧化物酶典型保守结构域,属于依赖于亚铁血红素Ⅲ型过氧化物酶亚类,为目标基因,且在功能位点区域高度保守,只存在一个氨基酸位点差异。基因结构比较分析表明,克隆获得的割手密、斑茅和甘蔗过氧化物酶基因均包含4个外显子,与高粱、玉米和水稻的同源基因外显子个数一致,外显子长度有较小差异,而内含子长度却存在较大差异。高粱、玉米和水稻Prxs同源基因均处在靠近染色体末端的位置,说明此基因存在一定的同线性。本研究结果为深入研究Prxs基因在不同植物中功能差异提供了一定的参考,为研究植物中Prxs基因的进化规律奠定了一定的基础。     

桃PpHDZ1转录因子的克隆及其对冷胁迫的响应

HD-Zip是植物特异转录因子,在响应冷胁迫过程中起着重要的调控作用。为了解HD-ZipⅠ亚家族转录因子在桃果实采后抗冷害过程中的分子调控机理,本研究从“湖景”水蜜桃叶片中克隆获得了一个编码HD-ZipⅠ亚家族转录因子的基因PpHDZ1,并对该基因的功能进行初步分析。结果表明,PpHDZ1的开放阅读框长度为840 bp,编码氨基酸280个。PpHDZ1蛋白不稳定,呈酸性,具有较强的脂溶性和亲水性,主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,无跨膜结构,没有信号肽,可能定位于细胞核。PpHDZ1含有两个高度保守的同源结构域(HD)和亮氨酸拉链结构域(LZ),与扁桃仁、日本杏的同源基因蛋白相似性较高,在系统进化树中与拟南芥HD-ZipⅠ亚家族聚类于同一分支。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)结果显示,在不同桃组织中,PpHDZ1仅在硬核期果实中的表达量最高。在桃果实采后低温贮藏期间,0℃、4℃和8℃都显著诱导了PpHDZ1基因的上调表达,其表达强度与桃果实的冷害程度相一致。本研究为揭示HD-Zip转录因子在桃果实抗冷害过程中的分子调控机制提供了理论基础。