水稻稻瘟病抗性基因Pi2-InDel标记的开发与评价

通过对水稻抗稻瘟病基因Pi2/9位点上已克隆的功能基因及非功能位点序列的相互对比,鉴定到Pi2特异的核苷酸差异,开发了基于PCR技术的Pi2基因的插入/缺失(insert-deletion,InDel)标记,能有效地将Pi2与其它抗性等位基因及感病等位基因区分开。利用Pi2基因的分离群体进行标记选择与接种鉴定,结果表明Pi2-InDel标记能精确地选择Pi2基因。用Pi2-InDel标记对20份水稻品种和育种亲本进行分子检测,该标记能准确地将抗性基因分离开来。这为筛选水稻稻瘟病抗性种质资源,以及抗性标记辅助抗病育种提供了便利。     

水稻抗白叶枯病基因Xa7荧光分子标记开发与育种应用

本研究利用含有抗白叶枯病基因Xa7的水稻品种‘IRBB7’与9个感病水稻品种进行序列比对,在Xa7基因位点附近寻找碱基差异,结合PARMS (Penta-primer amplification refractory mutation system)技术,开发了与Xa7基因紧密连锁的荧光分子标记PM-Xa7,并利用该标记对72份水稻种子资源中的Xa7基因进行鉴定和对杂交水稻育种亲本‘美B’的白叶枯病抗性进行改良。结果显示,从72份水稻种质资源中鉴定出了两份含有抗病Xa7基因的水稻种质;利用标记PM-Xa7将‘IRBB7’中的抗病Xa7基因导入到‘美B’中,成功选育出了稳定的抗白叶枯病新保持系材料;在对‘IRBB7’与‘美B’的382份BC2F2代单株进行选择时,发现289株检测到抗白叶枯病荧光信号,93株检测到感白叶枯病荧光信号,与病原菌Xoo接种的实验结果完全一致。以上结果表明标记PM-Xa7可有效地运用于Xa7基因的抗白叶枯病分子标记辅助育种工作中。     

兼抗两种稻飞虱和稻瘟病多基因聚合系的创制

通过分子标记辅助选择创制兼抗稻飞虱和稻瘟病的水稻多基因聚合系,为选育持久多抗的水稻新品种提供材料来源。以携带稻瘟病抗性基因Pi1的材料‘CQ12261’为供体亲本,以兼抗白背飞虱和褐飞虱的优良恢复系‘桂恢1561’为轮回亲本,应用田间抗病虫性鉴定与分子标记辅助选择相结合的方法,并结合农艺性状的考察和分析。在BC₂F₄代中检测到6个株系的抗病基因Pi1已稳定遗传。至BC₂F₆代,GH-7、GH-8、GH-12这3个株系农艺性状与轮回亲本‘桂恢1561’相似,且丰产性好。通过常规的回交选育、分子标记辅助选择和田间抗性鉴定相结合的方法,筛选获得3份聚合了稻飞虱抗性基因Wbph9、Bph14、Bph15和稻瘟病抗性基因Pi1的水稻中间材料,为选育新的双抗病虫害水稻恢复系提供种质资源。     

河南粳稻抗稻瘟病基因Pi9、Pita和Piz-t的分子检测

为明确Pi9、Pita和Piz-t 3个抗稻瘟病主效基因在河南水稻新品系的分布状况。本研究对2015年河南省沿黄粳稻品种筛选试验的21份水稻新品系进行Pi9、Pita和Piz-t 3个抗稻瘟病基因的分子鉴定。结果表明,21个检测品系中有9个含有Pi9抗性等位基因,5个含有Pita抗性等位基因,11个含有Piz-t抗性等位基因;只有一个品系汴粳3号携带3个基因的抗性等位基因,菡科18、新丰1768、豫农粳13号、圣稻070、信粳1787、郑稻23和光灿8号7个材料携带两个基因的抗性等位基因。Pi9和Piz-t基因在河南水稻稻瘟病育种中利用较为广泛,Pita利用较少,今后河南水稻育种应加强广谱稻瘟病抗性基因的聚合育种和综合利用。     

利用分子标记辅助选择技术创制抗稻瘟病水稻新恢复系

为了选育出抗病的优良杂交水稻恢复系,本研究以含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻材料75-1-127为供体,以杂交水稻强恢复系蜀恢527、明恢86、闽恢3301和X5为受体亲本,运用分子标记辅助选择技术与回交、复合杂交的选育方法,同时连续4年在稻瘟病重发区田间自然诱发鉴定,最终获得了6份含有抗稻瘟病基因Pi9的新株系,其中2份表现抗稻瘟病,4份表现中抗稻瘟病,而不含有Pi9基因的株系材料均表现中感病及以上。结果表明,在相同遗传背景下含有Pi9基因的株系的抗性水平明显优于不含有Pi9基因的株系。本研究利用分子标记辅助选择技术有效地培育了抗稻瘟病的水稻恢复系。     

Pi9基因分子标记辅助选择改良水稻不育系丰源A的稻瘟病抗性

为改良水稻不育系丰源A的稻瘟病抗性,以籼稻品系75-1-127作为广谱持久抗稻瘟病基因Pi9的供体亲本,先后以三系保持系丰源B和不育系丰源A为受体亲本,利用Pi9基因内共显性标记ClonDF_1R_1开展MAS连续回交育种。利用来自国内外不同稻区的33份稻瘟菌菌株进行温室内人工接种,分析丰源A、丰源B、75-1-127的抗菌谱,75-1-127的抗性频率为87.9%;而丰源A和丰源B的抗性频率均仅为33.3%。田间病圃抗性鉴定表明,75-1-127高抗苗瘟,而丰源B和丰源A高感苗瘟。结果表明,含有Pi9基因的75-1-127抗谱广、抗性水平高,在稻瘟病抗性育种中具有很大的应用前景;而丰源A和丰源B抗谱窄、抗性水平低,需要改良。根据Pi9基因序列信息开发了一个共显性分子标记ClonDF_1R_1,它从75-1-127基因组中扩增出一条320 bp的条带,而丰源B和丰源A基因组的扩增产物约450 bp。利用ClonDF_1R_1先后开展丰源B、丰源A稻瘟病抗性改良的MAS育种实践,获得了13个含Pi9纯合等位基因的改良抗病保持系丰源B-Pi9,以及11个含Pi9纯合等位基因的改良抗病不育系丰源A-Pi9。经过连续11 a的MAS回交育种实践,育成1个高抗稻瘟病、不育性稳定、柱头外露率高、农艺性状和产量性状优良的新三系不育系丰源A-Pi9-5,实现了丰源A和丰源B稻瘟病抗性的定向改良,为三系杂交水稻育种应用创制了新的亲本材料。     

基于HRM体系开发抗稻瘟病基因Pi2特异性分子标记

Pi2是一个具有广谱抗性的稻瘟病抗性基因,利用分子标记辅助选择技术选育含有Pi2抗性基因的水稻品种已得到越来越广泛的应用。本研究根据稻瘟病抗性基因Pi2及其复等位基因的序列,利用HRM技术开发与Pi2完全共分离的分子标记,并结合水稻DNA快速提取方法,建立中高通量辅助选择体系。该方法体系准确高效、简便快速、成本低廉,能够大大提高抗病育种选育的效率,为分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Pi2基因型鉴定提供技术选择。     

分子标记辅助选择Pi25基因选育抗稻瘟病三系不育系

稻瘟病是水稻最具毁灭性的病害之一,选育抗稻瘟病三系不育系,是选育抗稻瘟病品种的有效途径之一。本研究以携带抗稻瘟病基因Pi25的材料BL47为抗性供体亲本、福稻B为受体亲本,利用分子标记辅助选择技术和常规育种方法,从F2代起利用分子标记Si13070C检测Pi25基因,从F3代起结合稻瘟病重发病区苗瘟鉴定,从BC1代起对不育系植株进行花粉育性鉴定,筛选出5份具有中抗以上水平的候选不育系,其中不育系CP4A具有良好的不育性和开花习性,所配组合表现出良好的农艺性状。结果表明,利用分子标记Si13070C检测Pi25基因并结合田间苗瘟鉴定在选育抗性育种材料上是有效的。     

水稻抗稻瘟病基因Pi-k~h的分子检测

水稻稻瘟病抗性基因Pi-kh对不同地区的稻瘟病菌表现出较广谱的抗性,被广泛应用于水稻抗稻瘟病育种。为明确稻瘟病抗病基因Pi-kh在水稻新品系中的基因型及分布情况,以期为水稻新品种选育提供抗性亲本,利用稻瘟病抗病基因Pi-kh的功能标记对184份水稻新品系进行分子标记检测分析。结果表明,在184份材料中,含抗病基因Pi-kh的材料106份,其中86份为基因型纯合体,20份为基因型杂合体,二者所占比例为65.76%。这些材料为培育抗稻瘟病优良水稻品种提供了抗病基因。研究结果可为水稻抗稻瘟病的分子标记辅助育种提供帮助。     

分子标记辅助选育抗稻瘟病水稻新品种‘铁粳16’

稻瘟病是对水稻生产威胁最大的真菌病害,选育抗病水稻品种是防控该病最经济有效的途径。研究表明,聚合多个抗病基因可提高品种的抗性、拓宽抗谱。本研究以携带抗稻瘟病基因Pib的‘辽粳9234’和携带抗稻瘟病基因Pita的‘铁粳7号’为亲本,利用常规育种技术与分子标记辅助育种技术相结合从后代中鉴定到聚合抗稻瘟病基因Pita和Pib的后代。通过连续3年生产试验和米质分析,鉴定到1个同时具有抗稻瘟病基因Pita和Pib的稳定株系A-3,通过辽宁省水稻品种审定,命名为‘铁粳16’。人工接种结果表明‘铁粳16’较其亲本抗谱宽、抗性强。研究结果证实聚合Pita和Pib可提高水稻品种对稻瘟病的抗性,可为抗病基因聚合育种提供参考。     

水稻抗稻瘟病基因Pi35功能性分子标记的开发及其应用

稻瘟病是水稻生产上的严重病害,利用抗病基因培育抗病品种是控制稻瘟病最经济而有效的措施。在日本,稻瘟病部分抗性基因Pi35作为广谱持久抗性基因已广泛应用于水稻育种和稻瘟病防治实践。但是,Pi35基因在我国的资源和品种中的分布情况不清,制约了这一重要基因在我国育种实践中的应用,急需开发实用的分子标记,并系统研究该基因在我国的品种及其亲本中的分布情况,为稻瘟病抗性育种服务。本研究通过比对抗、感品种中Pi35等位基因序列,发现一个能检测抗、感病性差异的特异SNP(3780 T),并据此开发了Pi35基因的功能性分子标记Pi35-d CAPS。利用该标记检测了抗源藤系138的衍生品种10份、微核心种质204份和主栽品种67份,结合测序鉴定,确认5份藤系138衍生品种(垦鉴稻3号、垦鉴稻6号、垦稻8号、绥粳3号和龙粳34)及2份微核心种质(粳稻品种抚宁紫皮粳子和籼稻品种细麻线)携带Pi35基因。本研究结果为通过分子育种手段高效利用Pi35基因改良我国水稻(特别是籼稻)品种的稻瘟病抗性提供了手段。     

水稻抗稻瘟病基因Pi2特异分子标记的开发与应用

稻瘟病是水稻最严重的病害之一,利用抗病基因选育抗病品种可以安全有效地防治稻瘟病。分子标记辅助选择(marker-assisted selection, MAS)技术可实现快速精准地定向培育含抗稻瘟病基因的抗性品种,但针对不同遗传背景育种材料开发设计特异性的分子标记是MAS育种的重要基础。广谱抗稻瘟病基因Pi2已被证明高抗多个国家和地区的稻瘟菌生理小种。本研究开发设计了1个新的广谱抗稻瘟病基因Pi2的共显性特异分子标记Pi2CM1,可有效区分Pi2与其等位基因Pi9、Pigm,对22份核心育种材料表现出100%的多态性,为利用MAS技术定向培育含Pi2抗病新品种提供了重要的依据。     

利用与抗稻瘟病基因Pi1连锁的MRG4766标记鉴定173份云南地方稻种

稻瘟病是世界上危害最严重的水稻病害之一,鉴定与发掘抗稻瘟病种质资源是抗稻瘟病育种的重要基础工作。本研究利用与抗稻瘟病基因Pi1连锁的SSR引物MRG4766对173份云南地方稻种抗性基因Pi1进行了检测,并选择其中30个材料进行了人工接种验证。结果表明,人工接种验证与分子鉴定结果完全相符,说明SSR引物MRG4766用于鉴定抗稻瘟病基因Pi1是可行的。分子标记检测表明,供试的173份材料中有64份含有抗稻瘟病基因Pi1,占36.99%;其中102份籼稻中有33份含有该基因,占32.35%,而71份粳稻中有31份含有该基因,占43.66%,粳稻含有抗稻瘟病基因Pi1的比例比籼稻要高。检测到含有Pi1基因的种质材料分布在云南省11个州市29个县(市),分布范围较为广泛。南部边缘水陆稻区分布频率为41.03%,滇南单双季籼稻区分布频率为32.69%,滇中一季粳稻籼稻区分布频率为35.29%、滇东北高原粳稻区为35.29%、滇西北高原粳稻区33.33%。     

利用共转化方法创制携带Pi9抗稻瘟病基因的无选择标记转基因水稻

水稻稻瘟病是由子囊菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻灾害性病害。培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的措施之一。水稻Pi9抗稻瘟病基因来源于小粒野生稻并已被克隆和应用于转基因育种。为了提高无选择标记转基因植株的选择效率,将绿色荧光蛋白(GFP)用作可视遗传标记,对双菌株共转化系统进行改良:目的基因载体携带Pi9抗稻瘟病基因;标记基因载体用潮霉素磷酸转移酶(HPT)作为植物转化选择标记,用GFP作为负选择标记,筛除标记基因分离植株。两种载体的农杆菌转化株混合,分别与水稻品种‘浙恢414’、‘浙粳22’、‘浙11B’、‘日本晴’、‘空育131’和‘粤泰B’的愈伤组织共培养,然后从5%~38.3%的起始愈伤组织筛选获得了转化愈伤组织(HPT+GFP+)。对T0植株进行Pi9基因PCR检测,11.8%~77.8%的T0植株为共转化植株(HPT+GFP+Pi9+)。对共转化植株T1代进行绿色荧光检测,筛选阴性植株(GFP-),再通过PCR筛选Pi9+植株。根据13个T1群体的研究结果,61%的共转化植株在T1代分离出无选择标记转基因植株(HPT-GFP-Pi9+)。转Pi9的无选择标记植株和后代株系对水稻稻瘟病呈抗病反应。因此,本研究通过GFP标记提高了双菌株共转化系统的选择效率,转Pi9的无选择标记水稻株系为水稻抗稻瘟病育种提供了有用的遗传资源。     

稻瘟病抗性基因Pi25特异性CAPS标记的开发与验证

为在水稻育种中快速与高效利用稻瘟病抗性基因Pi25, 本文利用该基因不同等位基因编码区序列差异开发了4套CAPS标记(CAP1/Hinc II、CAP3/Bgl II、CAP3/Nde I和CAP3/Hpy 99I), 并利用169份稻种资源、98个重组自交系(RIL)以及217个水稻转基因后代, 对4套标记的准确性和选择效果进行了验证。结果表明, 4套标记均能准确地检测Pi25/pi25座位。其中, 标记CAP1/Hinc II和CAP3/Hpy 99I特异性识别并酶切显性等位基因, 而标记CAP3/Bgl II和CAP3/Nde I特异性识别并酶切隐性等位基因。利用稻瘟病菌株JS001-20接种RIL与转基因材料, 抗性表现与标记检测的结果完全一致, 表明该CAPS标记准确可靠。分析稻种资源后发现, Pi25基因频率较低(1.2%), 说明该基因在我国水稻稻瘟病抗性育种中还没有被充分利用。本文的研究结果特别是开发的2对识别并酶切显性等位基因的CAPS标记可用于分子标记辅助选择, 改良我国早籼稻的稻瘟病抗性。     

水稻稻瘟病广谱抗病新等位基因pi21 t的鉴定及其抗性应用

为不断发掘和鉴定新的抗性基因,从而克隆和利用广谱持久抗性基因,选育水稻广谱抗稻瘟病新品种,解决稻瘟病危害。根据已克隆的水稻稻瘟病广谱抗病隐性等位基因pi21的序列设计分子标记Pi21-1,对育种上高频率使用的广亲和品种02428进行PCR扩增,测序比较分析发现了新的等位基因类型,同时对广亲和品种02428进行田间稻瘟病接种鉴定,苗期鉴定结果为免疫,从而鉴定了一个广谱抗稻瘟病的新等位基因pi21t,为水稻广谱抗稻瘟病育种提供了新的有利资源。通过分子标记辅助选择,能够快速明确目标品种中所携带目标基因的等位基因型,从而加快水稻广谱抗稻瘟病育种的进程,提高抗病效率。     

利用MAS技术改良水稻两用核不育系C815S的稻瘟病抗性

为了改良水稻两用核不育系C815S的稻瘟病抗性,本研究以75-1-127(Pi9)、谷梅2号(Pi25)、谷梅4号(Pigm)、天津野生稻(Pi2-1和Pi51(t))、湘资3150(Pi47和Pi48)和魔王谷(Pi49)共6个广谱抗稻瘟病水稻品种为供体亲本,通过分子标记辅助选择育种技术,将稻瘟病抗性基因回交导入C815S。结果表明:改良的6个BC3F1群体除每穗粒数较轮回亲本极显著增加外,其他性状均与轮回亲本保持一致。利用稻瘟病菌株110-2和CHL506对BC3F2改良株系接种鉴定,发现导入了抗病基因的单株抗性增强,表明抗病基因已成功导入到受体亲本中并稳定表达,证实本研究中分子标记辅助选择抗稻瘟病基因是有效的。改良的系列两用核不育系,一方面可用于配制稻瘟病抗性增强的两系法杂交稻新组合,另一方面为进一步培育聚合多个抗稻瘟病基因的不育系提供了材料基础。     

标记辅助改良节水抗旱杂交稻亲本材料的稻瘟病抗性

稻瘟病是水稻的主要病害之一,培育抗稻瘟病品种是防治稻瘟病的有效手段。本研究通过回交与分子标记辅助选择相结合的方式,将稻瘟病抗性基因(Pi1,Pi2和Pi9)导入到节水抗旱稻杂交组合的保持系"沪旱1B"和恢复系"旱恢3号"。对BC2F3代材料进行苗期稻瘟病抗性鉴定,结果表明,携带1个或2个目标基因的株系达到抗或中抗水平,抗病性显著高于各自的轮回亲本或者阴性株系。SSR标记分析表明改良株系的遗传背景回复率达到82.1%~93.6%。通过标记辅助选择获得的改良材料为节水抗旱杂交稻的培育提供了稻瘟病抗性亲本。     

稻瘟病抗性基因在主要育种亲本中的分布研究

稻瘟病是由稻瘟病菌引起的具有广泛性和毁灭性的水稻病害。目前通过抗病亲本杂交聚合培育持久广谱的稻瘟病抗性品种是水稻稻瘟病防治最经济环保的途径,而利用分子标记辅助选择技术对水稻育种亲本抗性基因分布的研究是分子辅助聚合育种的基础。本研究以36个育种亲本为实验材料,进行苗瘟和穗颈瘟鉴定,结合特异性分子标记Pid3、Pita、Pikm、Pib、Piz,研究这些育种亲本的稻瘟病抗性基因的分布情况。同时,对恢复系材料蜀恢498的抗稻瘟病基因Pita和Pikm扩增测序并进行同源序列比对分析,初步在分子水平分析抗病基因与抗病表型的关系。     

水稻稻瘟病抗性基因Pi25功能性SNP分子标记开发及应用

为了使稻瘟病抗性基因Pi25在水稻分子育种中得到高效和快速利用,本研究通过将Pi25不同等位基因测序及序列比对鉴定到一个Pi25基因内特异SNP位点。使用PCR-CTPP(PCR with confrontingtwo-pair primers)的方法加以改进开发了一套鉴定该SNP的功能性分子标记,利用该标记及待检测水稻品种基因组DNA进行PCR扩增,通过不同PCR产物条带大小将Pi25与其它等位基因区分开,可快速判断待测水稻Pi25的基因型。本方法快速简单、成本低廉,可广泛应用于水稻种质资源Pi25基因型鉴定和分子标记辅助选择育种。