过量表达OsAPX1基因增强水稻的抗热和抗氧化能力

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)是植物体内活性氧清除的关键酶,在植物逆境应答中发挥着重要作用。通过构建水稻OsAPX1基因的过表达植物载体,利用根癌农杆菌介导法导入水稻品种日本晴获得转基因植株。半定量RT-PCR分析表明,转基因植株中OsAPX1表达水平明显提高。田间T0代过表达转基因植株在高温条件下的秕谷率显著低于野生型。热激胁迫实验显示,转基因株系比野生型具有更强的耐热性。在过氧化氢胁迫下,转基因植株也表现出更强的抗氧化能力。该结果表明水稻OsAPX1基因在活性氧清除中发挥功能,过量表达OsAPX1能够增强水稻的高温抗性。     

OsRhoGDI2过表达转基因水稻的筛选鉴定及外源基因拷贝数的初步分析

水稻Rho GDP解离抑制基因OsRhoGDI2是从幼穗中分离出的功能未知基因。为鉴定该基因的功能,笔者所在实验室前期构建了植物过表达载体pCAMBIA1302-OsRhoGDI2-GFP,并对水稻进行了遗传转化。对OsRhoGDI2过表达转基因水稻T_2代进行筛选和鉴定,采用PCR技术鉴定转基因植株,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测OsRhoGDI2在转基因水稻中的表达水平,结果显示,其中6个株系为过表达转基因植株,OsRhoGDI2表达水平上调1.69～13.35倍。为检测外源基因在转基因水稻中的拷贝数,分别以蔗糖磷酸合成酶基因SPS和潮霉素抗性基因HYG为内参基因和标记基因,采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术结合内参基因和标记基因的标准曲线进行分析,结果显示在所检测的6个转基因株系中,外源基因的拷贝数均为1,提示已经获得稳定遗传的OsRhoGDI2过表达转基因水稻,为后续OsRhoGDI2基因的功能研究奠定基础。     

水稻OsVDAC5基因干涉载体的构建和遗传转化

[目的]构建水稻基因Os VDAC5的RNAi表达载体,遗传转化获得Os VDAC5转基因植株以研究该基因的生物学功能。[方法]通过PCR扩增Os VDAC5特异片段并克隆到RNA干涉载体p MCG161,以水稻日本晴为受体,将Os VDAC5 RNAi表达载体进行了农杆菌介导的遗传转化,利用PCR和RT-PCR技术检测T0代转基因植株中Os VDAC5的表达水平。[结果]Os VDAC5在绝大多数RNAi转基因植株中的表达量显著降低。[结论]为进一步研究水稻Os VDAC5基因功能提供了重要材料。     

绿色荧光蛋白基因在水稻遗传转化中的应用

本研究构建了含有编码绿色荧光蛋白基因的植物表达载体,以愈伤组织作为外植体,采用农杆菌介导法将携带绿色荧光蛋白的植物表达载体转入水稻品种秀水11中.分析了转化1个月的抗性愈伤组织以及2个月的转基因植株根中绿色荧光蛋白基因的表达.在荧光显微镜下观察到了绿色荧光蛋白基因的表达,转基因水稻愈伤组织和根具有很高的绿色荧光信号.结果表明,在水稻遗传转化研究中,绿色荧光蛋白基因既可用于检测基因的瞬间表达,也可用于检测基因在细胞中的稳定表达.     

一种用于植物基因沉默的新RNAi载体的构建

RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是研究基因功能的一种常用方法。为解决目前植物RNAi载体构建繁琐复杂的问题,本研究以常用的植物过量表达载体pRI 101-AN为基础,在其多克隆位点处插入源自pKANNIBAL载体的内含子序列,获得pRNAi-E载体。在此基础上,只要将目的基因特异序列的正反向片段分别连接到内含子两侧,即可构建目的基因的RNAi载体。为了验证pRNAi-E载体的效果,苹果IAA29(Md IAA29)基因的正向和反向片段被插入到pRNAi-E载体上,获得了Md IAA29基因的RNAi载体pRNAi-IAA29。通过农杆菌介导的遗传转化,获得了GL-3苹果的转基因株系。qRT-PCR数据显示转基因苹果植株中IAA29的转录水平比非转基因对照显著下调,表明基于pRNAi-E构建的RNAi载体能够有效地沉默苹果内源基因的表达。本研究构建的pRNAi-E载体使得植物基因RNAi载体构建变得简单高效,对于开展植物基因功能验证研究具有一定意义。     

拟南芥血红蛋白1（AtGLB1）超量表达载体和RNAi表达载体的构建及转化

为研究拟南芥血红蛋白1基因(AtGLB1)的功能,将AtGLB1基因构建入超表达载体pMD和RNAi载体pZYI中,并采用花序浸染法将重组质粒转化拟南芥Columbia得到了转基因植株。对超表达株系和RNAi株系的纯合体进行Northern分析,结果表明:超量表达的拟南芥株系中AtGLB1的表达水平比野生型高很多,而表达被抑制的RNAi株系中几乎检测不到AtGLB1基因的表达。这些AtGLB1表达水平不同的拟南芥株系的获得可为该基因功能的后续研究以及在农业生产中的应用奠定一定基础。     

一个耐镉基因过表达载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步研究MNB1基因在植物应对镉胁迫响应中的功能,构建拟南芥中MNB1基因过量表达载体,通过筛选鉴定最终获得相应的转基因植株。[方法]以野生型拟南芥c DNA为模板,PCR扩增MNB1基因全长,将该基因连接到过量表达载体上;然后将构建成功的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,浸花法转化野生型植株;最后利用转基因筛选与遗传鉴定获得MNB1转基因阳性植株。[结果]MNB1基因CDS全长1 368 bp,酶切连接后转化大肠杆菌鉴定得到阳性菌落,测序结果经比对完全正确。通过抗性筛选及PCR电泳检测获得阳性转基因植株。[结论]MNB1基因过表达载体构建成功并获得相应转基因植株,为进一步研究该基因调控植物镉胁迫响应中的功能及其分子机制奠定基础。     

过量表达甜菜BvNHX1基因提高拟南芥的耐盐性

Na+/H+逆向转运蛋白调节细胞内的离子平衡,在植物耐盐性起重要的作用。为了研究甜菜液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白BvNHX1基因在植物耐盐中的作用,构建了植物表达载体pROKⅡ-BvNHX1转化拟南芥.在含有卡纳霉素的培养基上筛选转化子,并利用Southern和Northern杂交技术检测,进一步证实BvNHX1基因已整合到拟南芥基因组并能正常转录。选取纯合转基因株系进行耐盐性分析实验表明,过量表达BvN-HX1基因的拟南芥在种子萌发和苗期都提高了植株耐盐性,盐处理下转基因植株的鲜重、干重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。结果表明过量表达BvNHX1基因提高了转基因拟南芥的耐盐能力。     

苹果MpSnRK2.4基因的克隆及转化

【目的】从常用苹果砧木楸子中克隆MpSnRK2.4基因,并将其转化番茄(Lycopersicon esculentum)品种Micro-Tom,为研究其功能奠定基础。【方法】以楸子幼叶为材料,通过RT-PCR扩增获得MpSnRK2.4基因的完整开放阅读框序列;利用Gateway技术构建pGWB411-SnRK2.4植物过表达载体,通过根癌农杆菌介导法将此载体转入Micro-Tom番茄中,通过卡那霉素筛选和转基因番茄RT-PCR鉴定,获得阳性转基因株系,利用qRT-PCR技术研究不同转基因株系中MpSnRK2.4基因的表达水平。【结果】成功克隆到长度为1 220bp的MpSnRK2.4基因片段,该基因包含长1 026bp的完整开放阅读框,编码341个氨基酸残基。通过在线软件分析发现,该基因的gDNA序列包含8个内含子,9个外显子;预测编码蛋白MpSnRK2.4的分子质量为38.475ku,理论等电点(pI)为6.06。系统进化树分析表明,MpSnRK2.4与水稻OsSAPK3蛋白的亲缘关系最近,序列比对显示MpSnRK2.4蛋白与已知的其他植物SnRK2s蛋白序列具有较高的同源性。转基因植株PCR鉴定结果表明,MpSnRK2.4基因已成功转入番茄植株中,经qRT-PCR发现,不同转基因株系的MpSnRK2.4基因表达量存在差异,其中株系1的表达水平最高。【结论】克隆获得了MpSnRK2.4基因全长序列,并得到了10个含有该基因的Micro-Tom番茄转基因株系。     

转苋色藜NDR1基因水稻的获得及对白叶枯病抗性的初步研究

NDR1(non-race-specific disease resistance)基因能介导植物广谱抗病,在植物的防御反应中发挥重要作用。以特色抗病植物苋色藜为材料,克隆并鉴定了NDR1的同源基因Ca NDR1a和Ca NDR1b。在此基础上,利用该基因分别构建植物表达载体,农杆菌介导转化法获得转基因水稻,经PCR和Southern杂交证明外源基因已整合到水稻基因组中。选取部分株系进行水稻白叶枯病抗性鉴定,记录接种后3 d、5 d、10 d的叶片病斑长度,结果表明:转Ca NDR1a、Ca NDR1b基因水稻对白叶枯病具有一定的抗性,可延迟发病。外源基因在转基因水稻植株中均有较高水平表达,但抗病性较好株系Ca NDR1基因的表达量并非最高。农艺性状调查结果显示多数转基因植株株高较对照组矮,但结实率、千粒重等农艺性状与对照组相比并无显著差异。     

拟南芥bZIP23基因过量表达载体的构建及过表达植株的筛选

[目的]以拟南芥为材料克隆bZIP23基因,构建bZIP23基因的过量表达载体和筛选过表达植株,为验证其功能奠定基础.[方法]提取拟南芥总RNA和RT-PCR克隆bZIP23基因,用限制性内切酶切割和T4 DNA连接酶连接,使bZIP23基因连接到35S强启动子的pART27载体上;将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞中,筛选阳性单克隆进行菌落PCR鉴定并测序验证,获得重组质粒.将该重组质粒电激转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,浸花法转化拟南芥野生型植株.[结果]通过单菌落PCR鉴定和DNA测序结果显示,bZIP23基因与35S过量表达载体已连接,获得了重组载体;抗性筛选与遗传鉴定获得相应的转基因过量表达阳性植株.[结论]构建的过量表达载体及筛选得到的过量表达植株为验证bZIP23基因功能奠定了基础.     

水稻高效RNA干涉体系的建立及其在受体激酶基因功能研究中的应用

利用RNA干涉(RNAi)技术，可以特异性的抑制真核生物体中目标基因的表达。本研究构建了适合水稻转化的RNAi诱导载体pCADS1341。为检测其有效性，使用它构建了针对GUS基因的RNAi载体，并利用基因枪转化法导入GUS基因稳定表达的转基因水稻愈伤组织。GUS染色分析结果表明该载体中RNAi诱导元件的瞬时表达可显著抑制GUS基因的表达。为探讨影响水稻中转基因诱导的RNAi效率的因素，对针对某个目标水稻基因的水稻RNAi植株进行了详细的分析。通过Southern和Northern杂交检测了T0代RNAi植株中T-DNA插入的拷贝数和目标基因的表达量，筛选出T-DNA为单拷贝插入，且目标基因的表达被高效抑制的株系。对来源于该株系的T1代植株进行了半定量RT-PCR检测，结果表明RNAi效应可以遗传给后代转基因水稻植株，但是不同个体中的RNAi效率存在差异。RNAi系统的表达量可能是决定RNAi效率的最关键因素。我们建立的高效RNAi技术体系对于水稻功能基因组学研究具有重要意义，利用这个系统我们已经构建了60多个水稻受体激酶基因的RNAi载体，系统的研究正在进行中。     

含抗草甘膦CP4-EPSPS基因和耐逆Trihelix类转录因子GmGT-2A基因的植物表达载体构建及转化验证

高效易用的植物表达载体在基因功能相关研究中起着重要的作用。以植物表达载体p BA002为基础载体,使用抗草甘膦CP4-EPSPS基因替换原载体的Bar筛选标记基因,获得新的植物表达载体p ES002。将大豆耐逆相关Trihelix类转录因子Gm GT-2A连接到p ES002,构建了同时含耐逆相关基因和抗除草剂标记基因的植物表达载体p ES002-Gm GT-2A。利用农杆菌介导的花序浸润法转化拟南芥,并对转基因植株进行抗草甘膦和耐盐性鉴定。结果表明,转基因植株在抗草甘膦和耐盐性上均显著强于对照,表明该载体可以用于转基因相关的基因功能研究。     

水稻锌指蛋白基因OsZRL过表达对根系发育的影响

锌指蛋白是目前研究最为深入的一类转录因子,在植物的生长发育调控中发挥重要作用。本研究克隆了水稻的一个锌指蛋白转录因子基因(OsZRL),并构建OsZRL基因过量表达载体,通过农杆菌介导法转入野生型水稻品种日本晴,获得转基因阳性分化植株。其中一些转基因小苗因根系不能正常发育而死亡,经定量分析这些转基因株系中OsZRL基因表达量显著高于野生型,初步表明锌指蛋白基因OsZRL与水稻根系发育有关。     

转基因水稻外源基因的遗传和表达初步研究

将天蚕抗菌肽B基因应用基因枪法导入水稻TN1发芽肿胚，获得转基因植株2株，转基因水稻T1－T5 5个世代不同株系，对bar基因、抗菌肽基因的遗传和表达进行初步研究。结果表明：转基因后代株系bar^R:bar^S在部分符合3：1分离比率。T1、T4转基因株系PCR、Southern印迹分析表明，T18株有抗菌肽B基因；T4仍有4个株系有抗菌肽基因，其他的株系基因丢失，T3 1个株系Northern印迹证明抗菌肽基因在RNA水平有表达；抗菌肽B转基因水委对白叶枯病的抗病性有提高，抗性能传递到高世代，在T3得到抗病性提高的株系。     

一个杨树GDSL基因组织表达的特性及其在拟南芥异源的表达

GDSL酯酶为脂肪水解酶家族的一个分支,参与植物生长发育和防御反应等多种功能。半定量RT-PCR分析结果显示,毛果杨GDSL酯酶基因Potri.002G253400在顶端茎组织中高丰度特异性表达;构建Potri.002G253400-GFP融合的植物表达载体,转化模式植物拟南芥并获得其过量表达的转基因株系7个;激光共聚焦显微镜检测结果显示,GFP荧光蛋白高丰度表达于转基因植株根的细胞壁区域,说明Potri.002G253400蛋白可能定位于细胞壁。     

茎瘤芥PHYA基因与茎瘤芥茎膨大关系的初步研究

从茎瘤芥基因组中克隆了全长PHYA基因,构建了植物超表达载体,通过农杆菌GV3101转化茎瘤芥——永安小叶,得到PCR反应呈阳性的转基因株系.结果发现,在自然生长环境下,转基因植株发生了多种形态变异,如植株矮化、花期提前、叶片变大且色泽浓绿、转基因植株茎膨大延缓等.初步推断PHYA基因参与调控茎瘤芥植物茎膨大过程,过量表达PHYA基因可能会抑制茎膨大过程.     

农杆菌介导的抗除草剂基因Bar转入北方粳稻恢复系的研究

以2个北方粳型恢复系津稻162和津稻18为受体,经农杆菌EHA105/pDSBar1300转化,分别获得77和55个转植株。用0.25%浓度的Basta对转基因在T0代进行了涂布试验,其抗性植株率分别为92%和78%,对除草剂抗性转基因株系做PCR检测,均能扩增出400bp的Bar基因特异条带,证明外源基因已整合到水稻基因组中。对转基因T1代进行潮霉素抗性鉴定,大多数转基因株系表现为3∶1的分离比。     

糖基转移酶基因sm-Ngt1对水稻株高的影响

[目的]研究烟草中受甲基茉莉酸和水杨酸双重诱导的糖基转移酶基因sm-Ngt1过表达对水稻生长的影响。[方法]构建sm-Ngt1的植物表达载体,采用农杆菌浸染法转化籼稻粤泰B,对获得的阳性转基因植株进行高度检测。[结果]共获得117株阳性转sm-Ngt1植株。在成功转入sm-Ngt1基因后,水稻植株出现了不同程度的矮化,其中37%的转基因植株高度为71.4±9.8cm,27%的转基因植株高度为65.1±4.6cm,而未转基因的对照YTB的平均高度为130.0±4.3cm。[结论]为进一步研究sm-Ngt1的功能奠定了基础。     

大豆查尔酮还原酶1基因的克隆及转化

【目的】克隆大豆查尔酮还原酶1(CHR1)基因,以构建的过表达载体pCAMBIA3301-CHR1转化大豆,获得含有CHR1基因的阳性植株,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】以大豆基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆CHR1基因,构建植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,对其进行PCR及双酶切鉴定。采用农杆菌介导法将该载体转入大豆"吉农28"中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,对CHR1基因mRNA相对表达量进行荧光定量PCR检测。【结果】克隆得到的CHR1基因大小为1 100bp。成功构建了植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,将其转化大豆后,通过PCR检测获得T1代转基因大豆植株12株;Southern杂交检测结果显示,CHR1基因以单拷贝形式整合入大豆基因组中;荧光定量PCR检测结果显示,转基因植株的CHR1mRNA相对表达量高于非转基因大豆植株。【结论】成功构建了过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,并获得了CHR1基因表达量高的转基因大豆。