鸭坦布苏病毒江西分离株全基因组序列分析

为了解江西省鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)的遗传变异情况,对2013年江西省某蛋鸭场分离获得的1株鸭坦布苏病毒(命名为YF株)进行基因组分子特征及遗传进化分析。序列分析表明,该株病毒基因组全长10 990nt,未出现核苷酸插入或缺失及基因重组的变异情况,与已报道的DTMUV分离株的核苷酸同源性均在98.5%以上,且亲缘关系与当前鸭群中优势病毒亚群非常近。以上结果表明,近年来江西鸭群中流行的鸭坦布苏病毒遗传比较稳定,未发生变异。     

狂犬病病毒SRV_9株修饰全长基因组cDNA克隆的构建

为获得狂犬病病毒(rabies virus,RV)SRV9株的基因组全长cDNA克隆并对其进行基因修饰,深入研究狂犬病病毒的基因组特性及构建新型病毒载体,本研究根据GenBank中公布的SRV9基因组序列设计数对引物,以SRV9病毒为材料,从病毒总RNA中将全长基因组11 928 bp分5段扩增,克隆至载体测序鉴定。测序正确后,设计引物缺失基因组Ψ区并在缺失位置插入人细胞色素C基因,又设计引物删除糖蛋白(G)胞质区(CD区)。利用引物在病毒基因组起始处添加锤头状核酶序列,在病毒序列结尾处添加了丁型肝炎核酶序列。再次测序后克隆至pcDNA3.1(+)载体,利用扩增片段自身内切酶位点顺次进行修饰后全长连接,从而获得含修饰SRV9全长基因组的质粒pcDNA3.1-SRV9,为RV感染性克隆的建立奠定了基础。     

一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

2010年我国爆发了使蛋鸭产蛋量急剧下降、由一种鸭黄病毒引起的疾病,通过对来自山东某发病鸭场的病料进行分离,得到实验室分离株Du/CH/LSD/110128。对其进行全基因组序列测定分析,确定该株病毒全基因组含有一个开放阅读框,编码一个由3 426个氨基酸组成的多聚蛋白。将试验测得株Du/CH/LSD/110128株与黄热病毒(Yellow fever virus)、登革热病毒(Dengue virus)、伊利乌斯脑炎病毒(Ilheus virus)、西尼罗病毒(West Nilevirus)、巴格扎病毒(Bagaza virus)和其他一些已公布序列的坦布苏病毒进行核酸同源性比较和遗传进化树分析,发现Du/CH/LSD/110128株与巴格扎病毒亲缘关系较近但介于病毒种的水平上,与其他株坦布苏病毒核酸同源性在87%以上,可以确定Du/CH/LSD/110128株属于新型鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus)。     

新城疫病毒Lasota株基因组全长cDNA的构建与序列分析

将Lasota病毒RNA反转录为cDNA,按照GenBank上公布的Lasota基因组序列(AF 077761)设计了5对引物进行全基因组的扩增(RT-PCR),并将各个片段连于克隆载体pMD_(18)-T,获得高拷贝的基因序列,然后通过酶切连接将测序正确的各个片段连接到pET-30a载体。PCR分片段扩增、酶切鉴定及测序结果表明,所构建的Lasota全基因组cDNA基因序列正确,连入载体的位置与预期完全一致。     

鸭坦布苏病毒LH株E蛋白基因的克隆与结构

采用分子克隆技术对鸭坦布苏病毒(DTMUV)E蛋白基因进行克隆,同时运用多种生物学软件对该基因进行结构和生物学功能预测和分析.结果表明,本试验成功克隆了DTMUV LH株E蛋白基因,该基因包含一个1 500 bp的开放阅读框,编码500个氨基酸.遗传进化树分析表明,该蛋白与我国其他省份分离株的同源性很高.该蛋白的分子质量为54.3 ku,等电点为7.63,不存在信号肽序列,含有17个糖基化位点,有13个丝氨酸、4个络氨酸和8个苏氨酸的磷酸化位点.该蛋白存在跨膜区域,为亲水性蛋白.抗原位点分析表明,该蛋白有21个抗原肽段.本试验结果为E蛋白的生物学功能和致病机理的研究奠定重要的分子理论基础.     

鸭坦布苏病毒E基因的克隆表达及初步应用

利用PCR方法从鸭坦布苏病毒山东分离株(BZ株)扩增整个E基因,全长1 503 bp,克隆到pMD18-T载体中,然后将双酶切目的片段亚克隆入pET-28a(+)载体,构建出重组表达质粒PET28a-E。将PET28a-E转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导可表达出分子量约54.8 kD的蛋白,Western blotting试验呈阳性,表明E蛋白有很好的反应原性。以纯化的表达产物作为包被抗原,鸭坦布苏病毒血清为一抗,HRP标记的羊抗鸭IgG为二抗建立间接ELISA方法。采用该方法对80份送检鸭血清进行检测,并与中和试验进行比较,结果显示,两者的符合率为95.0%,表明该方法具有较好的应用前景。     

浅谈鸭坦布苏病毒病

鸭坦布苏病毒病自2010年在国内首次爆发,引起产蛋鸭产蛋下降,雏鸭瘫痪,给养鸭业造成巨大的危害。通过对鸭坦布苏病毒病原学、流行病毒学、临床诊断、预防与控制等方面的阐述,为该病的诊断和防控提供参考和依据。     

鸭坦布苏病毒的分离和PCR鉴定

鸭坦布苏病是危害养鸭业最严重的传染病之一。从某鸭场的疑似鸭坦布苏病病死鸭中分离到1株病毒,并对该毒株进行PCR鉴定和序列分析。结果显示,分离株的序列与Gen Bank上登录的DTMUV序列的同源性在99%以上,表明分离的病毒为鸭坦布苏病毒。     

柑橘脉突病毒基因组全长cDNA克隆及其侵染性鉴定

【目的】构建柑橘脉突病毒(citrus vein enation virus,CVEV)侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】利用SMARTer~?RACE(rapid amplification of cDNA ends)试剂盒对CVEV的5′序列进行RACE,并依据序列分析结果及CVEV分离株VE-1保守序列,设计CVEV基因组全长cDNA扩增引物。以CVEV毒源植株的总RNA为模板,通过EV25-F/EV5983-R引物扩增CVEV基因组全长cDNA。利用In-Fusion重组连接线性化pXT1和CVEV全长cDNA。通过菌液PCR及测序分析鉴定CVEV基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导的真空浸润接种摩洛哥酸橙(Citrus aurantium)、邓肯葡萄柚(C. paradisi)、尤力克柠檬(C.limon)、枳柚(C. paradisi×Poncirus trifoliata)、Rusk枳橙(P. trifoliata×C. sinensis)、枣阳小叶枳(P. trifoliata),进一步通过RT-PCR检测、症状观察鉴定所构建CVEV全长cDNA克隆的侵染性。【结果】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得基于双元载体pXT1的CVEV基因组全长cDNA克隆10个。随机选取的6个全长cDNA克隆CVEV1901—CVEV1906的序列一致性为99.35%。其中,CVEV1901基因组全长5 983 nt,由5个开放阅读框、5′端207 nt和3′端198 nt的两个非翻译区、以及ORF2和ORF3之间122 nt的基因间隔区组成。序列分析结果显示,CVEV1901与浙江分离株XZG及四川SM分离株的序列一致性分别为99.98%和99.11%;与西班牙VE-1分离株、美国加州VE701分离株和日本IBK分离株基因组序列一致性在96.89%—98.61%;与同属中豌豆耳突花叶病毒(pea enation mosaic virus)和紫花苜蓿耳突病毒(alfalfa enamovirus)的序列一致性约90%。通过农杆菌介导的真空浸润将CVEV1901接种至6个不同的柑橘品种,接种后120 d的RT-PCR检测结果表明摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚、尤力克柠檬、枳柚、Rusk枳橙和枣阳小叶枳阳性植株/接种植株(阳性率)分别为16/17(94.12%)、12/14(85.71%)、16/21(76.19%)、15/19(78.95%)、13/14(92.86%)和0/18(0)。其中,部分摩洛哥酸橙出现典型CVEV侵染症状,叶片侧脉和支脉产生耳状小突起,叶背有相应的凹陷;部分邓肯葡萄柚和尤力克柠檬出现叶片皱缩现象。【结论】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得了CVEV基因组全长cDNA侵染性克隆,通过农杆菌介导的真空浸润接种可引起摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚和尤力克柠檬的CVEV侵染症状。     

柑橘脉突病毒基因组全长cDNA克隆及其侵染性鉴定

【目的】构建柑橘脉突病毒(citrus vein enation virus,CVEV)侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】利用SMARTer^?RACE(rapid amplification of cDNA ends)试剂盒对CVEV的5′序列进行RACE,并依据序列分析结果及CVEV分离株VE-1保守序列,设计CVEV基因组全长cDNA扩增引物。以CVEV毒源植株的总RNA为模板,通过EV25-F/EV5983-R引物扩增CVEV基因组全长cDNA。利用In-Fusion重组连接线性化pXT1和CVEV全长cDNA。通过菌液PCR及测序分析鉴定CVEV基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导的真空浸润接种摩洛哥酸橙(Citrus aurantium)、邓肯葡萄柚(C. paradisi)、尤力克柠檬(C.limon)、枳柚(C. paradisi×Poncirus trifoliata)、Rusk枳橙(P. trifoliata×C. sinensis)、枣阳小叶枳(P. trifoliata),进一步通过RT-PCR检测、症状观察鉴定所构建...     

珠三角地区鸭坦布苏病毒的全基因序列测定与分析

【目的】了解2010年以来分离于珠三角地区鸭坦布苏病毒病(Duck Tembusu virus,DTMUV)GDNS2010.1、GDNS2010.2、GDZQ2012、GDPY2013株的分子特征.【方法】参考Gen Bank收藏的DTMUV JS804株,共设计合成11对特异性引物,扩增了4株病毒的全基因序列片段.【结果和结论】4株病毒全长约为10 990 bp,无Ploy(A)尾结构,仅含有1个大的ORF,共编码3 426个氨基酸,5'非编码区(5'UTR)各含有94 bp.在3'非编码区(3'UTR),GDNS2010.1、GDNS2010.2毒株在103 395~103 411 bp处缺失10个碱基.联合前期试验已测定的2株病毒序列(GDHZ2012.1、GDHZ2012.2),用DNAstar和MEGA6.0序列分析软件将6株病毒同Gen Bank收藏的国内的其他坦布苏病毒株比对,发现核酸序列相似性在98%以上,与Ntaya病毒和Sitiawan病毒相似性较大,相似性都在73%左右;与西尼罗河病毒、日本乙型脑炎病毒、黄热病毒等相似性皆低于63%.6株病毒囊膜蛋白E核酸序列相似性为97.5%~99.9%,推导氨基酸序列相似性在97%以上,其中同一地区分离的毒株相似性最高,达99.9%;在囊膜蛋白E154位存在一潜在的糖基化位点Asn-Try-Ser,在E蛋白结构域Ⅱ第E289位,极性带正电荷的Lys变为极性带负电荷的Glu,推测这一位点可能为病毒的毒力位点.     

鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达

在大肠杆菌中表达鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV) 奉贤株的主要结构蛋白E。本研究利用RT-PCR方法扩增出E基因, 将其克隆至原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-E。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白成功获得了表达。SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子量为63 ku。Western blot分析表明,该蛋白能与抗His标签的鼠单克隆抗体发生特异性反应。以上结果表明,在大肠杆菌中成功表达了DTMUV主要结构蛋白E。     

表达鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性

为开展鸭瘟病毒-鸭坦布苏病毒二联苗的研究,将密码子优化的鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因插入转移载体p EP-BGH-end构建了p EP-BGH-E重组表达质粒。在鸭瘟病毒疫苗株细菌人工染色体(p DEVvac)的基础上,首先通过Red E/T两步重组法构建了EF1启动子替换GFP基因CMV启动子的p DEV-EF1突变体克隆,并将p EP-BGH-E质粒上的重组表达框p CMV-E-BGH-p A再次通过两步重组克隆至p DEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带有外源基因DTMUV E的突变体克隆p DEV-E。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞(CEFs)获得了重组病毒r DEV-E。病毒蚀斑大小测定结果显示,r DEV-E在CEFs上的蚀斑面积较亲本株相比稍有减少。Western blotting分析表明,外源蛋白E在病毒感染的CEFs细胞中成功表达。     

鸭坦布苏病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测方法的建立

[目的]建立可同时检测鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)与鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)的二重RT-PCR,为有效防控DTMUV与DPV提供技术支撑.[方法]根据GenBank中DTMUVE基因和DPVUL6基因的保守序列,设计合成两对引物,优化反应体系条件,并通过特异性、敏感性试验评价建立的二重RT-PCR.[结果l优化后的二重RT-PCR反应体系为:2×PCR Mix 12.5 μL,其中DTMUV上、下引物各0.5 μL,DPV上、下引物各0.5 μL,混合模板2.0 μL,ddH2O补足至25.0 μL;最佳反应程序:95℃预变性5 min;95℃1 min,54.4℃l min,72℃1 min,进行35个循环;72℃延伸10 min.该方法对DTMUV与DPV的检测敏感性分别达500和600 fg,但对鸭源新城疫病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合症病毒等病原体不敏感.[结论]建立的二重RT-PCR可用于DTMUV与DPV感染的快速鉴别诊断.     

鸭坦布苏病毒与新城疫混合感染的分离鉴定

鉴于上海某鸭场成年种鸭出现产蛋率下降、死亡率升高的现象,为有效解决此问题,通过鸭/鸡胚接种,进行了血凝及血凝抑制实验,对分离的病毒进行了鉴定,最终基本确诊为鸭新城疫和鸭坦布苏病毒混合感染,其发病原因是由于新城疫病毒引起鸭群抵抗力下降,导致并发坦布苏病毒感染。     

鸭坦布苏病毒感染诊断与防治

<正>坦布苏病毒感染是我国于2010年新发生的一种传染性疾病,该病以雏鸭、育成鸭脑炎、产蛋鸭产蛋下降为特征。初步研究表明,该病的病原为黄病毒属中的坦布苏病毒(TMUV)。一、病原体黄病毒属是一大群具有包膜的     

鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定与基因变异分析

[目的]2012年10月徐州地区某鸭场的樱桃谷种鸭突然发生产蛋下降,疑似鸭坦布苏病毒病.为了确诊病因,本试验进行了剖检与病原的分离鉴定.[方法]将病料匀浆处理后尿囊腔接种SPF鸡胚,分离病毒,接种BHK细胞培养,应用RT-PCR扩增病毒全基因,测序并进行基因进化分析.[结果]分离到一株鸭坦布苏病毒,命名为DTMUV XZ-2012株.该病毒株能适应鸡胚,无血凝活性,在BHK-21细胞上第5代的病毒滴度为5×104 PFU·mL-1.测序结果表明该病毒株基因组全长为10 990 nt,编码的多聚蛋白含3 426个氨基酸.DTMUV XZ-2012株与BYD株、YY5株和JS_2010株等分离株的全基因同源性为98.5％ ～99.3％.与最早分离的BYD株等相比,XZ-2012株的基因变异主要分布于E基因、NS1基因、NS2基因和NS5基因,提示该病毒在自然界的流行存在一定的免疫压力.[结论]本试验成功分离鉴定了一株鸭坦布苏病毒,为鸭坦布苏病毒候选疫苗株的筛选及病毒分子流行病学研究提供了参考信息.     

鸭坦布苏病毒的研究进展及综合防控措施

我国是养鸭大国,在众多鸭易感疫病中,鸭坦布苏病毒是最新发现的疫病,该病毒快速传播,导致养鸭业经济受到巨大损失.鸭坦布苏病毒是由黄病毒科的坦布苏病毒感染所引起的一种传染性疾病,该病具有传播快、发病急、死淘率高等特点.肉鸭和蛋鸭是该病毒的主要受感染群体,肉鸭感染后会出现站立不稳、倒地不起、头部震颤等神经症状,淘汰率为15％...     

鸭坦布苏病毒病的研究进展

鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus,DTMUV）病自2010年开始在我国流行,该病能引起蛋鸭产蛋率骤降、肉鸭发育迟缓甚至死亡,给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。自该病暴发以来,DTMUV迅速蔓延至我国大部分鸭养殖地区以及临近的东南亚地区。DTMUV宿主范围广泛,除了感染鸭、鹅等水禽和鸡、麻雀等其他禽类外,也可以感染哺乳动物,具有潜在的公共卫生安全风险。近年来研究人员在DTMUV相关的流行病学、与宿主的相互作用机理以及疫苗研制等方面取得了一些进展。综述了DTMUV病原学、流行特点、病毒感染引起的天然免疫反应以及疫苗研制等方面的研究进展,以期为未来DTMUV的深入研究及该病的综合防控提供借鉴。