宁夏苦豆子中产苦参碱内生真菌的分离与鉴定

【目的】从宁夏野生苦豆子中分离内生真菌,筛选能够产生苦参碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱或槐定碱4种喹诺里西啶类生物碱的内生真菌。【方法】应用光学显微镜和扫描电子显微镜对分离菌株显微形态进行观察,根据形态对各菌株进行初步分类;应用薄层色谱法、气相色谱-质谱联用法和酸性染料比色法检测各分离菌株的生物碱成分。对能够产生生物碱的真菌ITS和SSU rDNA序列进行扩增和测序,根据序列信息进行同源性比较和系统发育树构建;结合形态特征,对其进行种属分类。【结果】从苦豆子中共分离到27株真菌,其中23株分属于青霉属、曲霉属、链格孢属、镰刀菌属、Simplicillium属真菌,4株为不产孢菌;筛选出E1、E3和E5这3株能够产生苦参碱的内生真菌,均属于Simplicillium属真菌,其菌丝中苦参碱的含量分别为20.4、17.4和37.6 μg•g-1。【结论】根据真菌形态特征、同源性比较和遗传进化分析结果,确定该3株产苦参碱内生真菌均为Simplicillium lanosoniveum。     

一个嗜蓝孢孔菌属新菌株的分离、鉴定与菌种培养基质研究

采自山西右玉地区沙棘树腐木中的野生嗜蓝孢孔菌属一新菌株,其形态学特征为具有马蹄形担子果,盖状无柄,有时平伏反卷生长,单系菌丝系统;骨架菌丝在Melzer试剂和棉蓝试剂中呈负反应;担孢子近球形或球形,无色,厚壁等。将Fomitiporia yanbeiensis的ITS序列与其他已经报道的嗜蓝孢孔菌属真菌ITS进行比对分析。分析结果表明Fomitiporia yanbeiensis与嗜蓝孢孔菌属亲缘关系较近,因此可定该属的一个新种,名为Fomitiporia yanbeiensis S.GuoL.Zhou(Gen Bank:KT861405,Fungal name:FN570360)。     

福木假尾孢菌Pseudocercospora elaeodendri的转录间隔区序列分析

PCR扩增福木假尾孢菌的转录间隔区序列(ITS)并测序,获得的基因序列长度为581bp,相似性分析发现其与假尾孢属不同种之间的ITS序列相似度极高。进一步对相似度高的不同种、属菌的ITS序列采用Neighbor-joining法构建系统进化树。遗传距离分析结果发现,试验菌株仅与同源性为100%的未知种名的假尾孢菌聚为一类。比较不同种的ITS碱基序列,结果表明,试验菌株与其它种之间的差异碱基分布于ITS1和ITS2区域,说明ITS能够体现假尾孢属的种间变异。     

麻疯树根部内生真菌分离及鉴定

从能源植物麻疯树的根部凸起部分韧皮部、木质部中分离到内生真菌42株,应用PCR技术对分离菌rDNA的内转录间隔区（ITS区）基因克隆后测序,并将所测序列提交到欧洲分子生物学实验室核酸数据库（European Molecular Biology Laboratory Gen-bank）,通过Blast程序将该序列与数据库已有的序列进行分析比较。结果表明,42个菌株分别与Genbank中的拟盘多毛孢菌属Pestalotiopsis、头孢霉属Cephalosporium、枝顶霉孢霉属Acremonium、镰孢霉菌Fusarium、木霉属Trichoderma、毛霉属Mucor、青霉属Penicillium、根霉属Rhizopus、曲霉菌属Aspergillus和茎点菌属Phoma具有高度同源性（达到99%以上）,其中拟盘多毛孢为优势属,其次为青霉属和茎点菌属。表明麻疯树内生真菌有着丰富的多样性特点。     

1株产白藜芦醇及白藜芦醇苷虎杖内生真菌的分离鉴定

对秦岭山区虎杖内生真菌进行分离、纯化及摇瓶发酵,通过对其发酵液及菌丝的乙酸乙酯萃取液进行HPLC分析,获得1株既产白藜芦醇又产白藜芦醇苷的菌株,产量均在4 mg/L以上.根据该菌株的形态特征及菌丝ITS序列分析,将该株菌确定为半知菌亚门丛梗孢目丛梗孢科青霉属(Penicillium sp.)真菌.     

河南省商丘地区棉花枯萎病菌的分子鉴定与致病力

以河南省民权县花园镇棉花枯萎病病株为材料,采用连续稀释法和单孢分离法得到枯萎菌单孢菌株,对该菌株进行形态学和显微形态学分析。采用真菌通用引物对所分离的菌株r DNA内转录间隔区(ITS)PCR扩增得到544 bp大小的片段(Gen Bank登录号为FJ715505),BLASTn分析结果显示,该序列与其他枯萎菌的ITS序列具有很高的同源性,将该ITS序列与Gen Bank中搜索到的同源性序列构建系统进化树,确定商丘地区棉花枯萎菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),对该分离棉花枯萎菌菌株进一步进行致病力生物学鉴定。     

1株抗小麦病原真菌活性的射干内生真菌的筛选鉴定及其聚酮合酶基因分析

【目的】挖掘有用的射干内生真菌资源,并为其合理利用提供一定的参考依据。【方法】从射干根中分离获得了1株内生真菌,采用形态学和分子生物学手段鉴定其属种,采用菌丝生长速率法测定其发酵液对禾谷镰刀菌和小麦根腐离蠕孢的抑菌作用,并分析该菌株的聚酮合酶基因序列和生物学特性。【结果】结合形态学和ITS序列同源性分析将菌株鉴定为层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)。该菌株的发酵液对禾谷镰刀菌和小麦根腐离蠕孢的菌丝生长有较好的抑制作用。SG5菌株的PKS氨基酸序列与Gen Bank所报道的层出镰刀菌的PKS序列相似性为99.7%。菌株最适生长的固体培养基为察氏培养基,最适碳源为蔗糖,最适氮源为硝酸钾,最适pH为7;在NaCl质量分数≤1%的培养基上正常生长。【结论】该拮抗内生真菌是潜在的小麦病原真菌生防菌资源,具有一定的开发与应用价值。     

野生柑橘炭疽病鉴定

本研究对华中农业大学野生柑橘上的病害进行鉴定。运用形态学及ITS序列分析方法对病样进行系统鉴定。结果表明,从发病的野生柑橘枝稍病样上共分离到24个单孢菌株,这些菌株根据形态学及ITS序列分析方法分为3种真菌:(1)菌落粉红色,长势非常缓慢,孢子镰刀形,ITS序列分析鉴定为砖红镰孢菌Fusarium lateritium;(2)菌落灰黑色,气生菌丝多,孢子砖格状,ITS序列分析为链格孢菌Alternaria alternata;(3)菌落灰白色,气生菌丝较少,常产生橙色胶滴和黑色小粒点,分子孢子短杆状,ITS序列分析为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides。利用健康柑橘枝条对此3种真菌进行回接实验时,接种胶孢炭疽菌的枝条出现了跟采样枝条相同的症状,而且从发病的枝条上又分离到同样的炭疽菌;而接种链格孢及砖红镰孢的枝条不发病。该病害鉴定为胶孢炭疽菌C.gloeosporioides感染引起的炭疽病。     

南方红豆杉紫杉醇产生菌的分离与鉴定

从南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)根部树皮内表皮中分离得到69株内生真菌,通过HPLC检测发酵液中紫杉醇含量,共获得7种紫杉醇产生菌,同时,通过形态学分析以及ITS序列分析确定分别属于链格孢属(Alternaria)、葡萄孢盘菌属(Botryotinia sp.)、刺盘孢属(Colletotrichum)、拟茎点霉属(Phomopsis)和枝孢菌(Cladosporium),其中链格孢属真菌紫杉醇产量最高,平均为271.54μg/L,是目前见诸报道的产量最高的链格孢菌,亦是从红豆杉根部树皮中筛选出的紫杉醇产量较高的野生菌株之一。该菌株的发现为紫杉醇高产菌的选育提供了又一优良的种质资源。     

栀子叶斑病及其病原的鉴定

首次报道在栀子(Gardenia jasminoides)上存在由拟盘多毛孢属真菌引致的叶斑病。从湖北省长阳县采集到栀子叶斑病病害标本,并利用柯赫氏法则证实该病由真菌GJ-1菌株所引致;根据GJ-1菌株的形态学特征和ITS序列的分析、比较,证实GJ-1菌株属于拟盘多毛孢属(PestalotiopsisSteyaert)真菌;GJ-1菌株的ITS序列与P.gracilis的ITS同源性达100%,因此推定它属于P.gracilis。     

黄瓜黑星病菌核糖体基因ITS区段的克隆及序列分析

为了探讨枝孢霉属的系统发育情况,采用真菌核糖体基因转录间隔区域(ITS)通用引物,PCR扩增3株来自不同地方的黄瓜黑星病菌核糖体基因的ITS序列,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果表明:3株黄瓜黑星病菌之间同源性为100%,ITS全长463bp,其中ITS1长154bp,5.8S rDNA长159bp,ITS2长150bp,各碱基的个数分别为G 119个、C 118个、A 120个、T 106个,GC含量为51.2%。利用MEGA4软件中的NJ法和ME法,对3个样品序列以及GenBank中登陆的枝孢霉属其他25个种构建ITS聚类分析树状图,NJ法和ME法构建的结果基本相同,枝孢霉属可以分为5个聚类组,所测的3个样品和Cladosporium cucumerinum在一个聚类组中。     

西藏3种疯草中合成苦马豆素内生真菌的鉴定

 【目的】从西藏毛瓣棘豆、冰川棘豆、茎直黄芪中分离内生真菌。【方法】应用薄层色谱法、气相色谱、气相色谱-质谱联用法检测内生真菌中的苦马豆素（swainsonine,SW）,筛选可生成SW的内生真菌;应用聚合酶链反应对真菌的ITS序列和IGS序列进行扩增,并根据ITS序列信息构建系统发育树,确定其种属分类;对IGS序列进行限制性酶切,并分析酶切产物。【结果】从3种疯草中分离到可以产生SW的4株内生真菌,各菌的形态、ITS序列的同源性与埃里格孢属真菌较为接近,系统发育分析表明4株真菌均为棘豆埃里格孢菌。ITS序列和IGS序列的限制性片段的分析表明,4株真菌遗传距离较近,但仍存在种间变异,可能为棘豆埃里格孢菌的不同亚种。【结论】本研究结果为探讨内生真菌合成SW机理研究奠定了基础,为动物疯草中毒病的防除和疯草资源的合理利用提供了新思路。     

四株马铃薯甲虫白僵菌菌株的鉴定

[目的]通过形态学特征明确四株马铃薯甲虫致病菌分类地位,探讨利用18S及ITS核酸序列鉴定四株致病菌的可行性.[方法]通过传统形态学特征及18S、ITS序列分别对四株马铃薯甲虫白僵菌1572、1573、1576和1577进行鉴定.[结果]孢子形态、产孢结构、菌落等形态学特征表明四菌株均为球孢白僵菌.四菌株18S rDNA序列分析获得1 665个共同碱基,在GenBank比对,从结果中选择相似度大于98;的序列与四菌株一起构建系统发育树I,发现白僵菌属归于一个分支,四菌株均归属于白僵菌属球孢白僵菌.剔除遗传关系比较远的、冗余的属外菌重新构建18S系统发育树Ⅱ,结果四菌株都与Beauveria bassiana(登录号为EU334676.1)分到一个枝上.ITS核酸序列分析获得513个共同碱基,在GenBank比对,显现的序列均属白僵菌属,下载这些序列与四菌株构建ITS系统发育树I,发现球孢与布氏白僵菌归属在一个分支.选取Stephen A.Rehner注册的白僵菌属六个分支的代表种及数据库中部分球孢和布氏白僵菌与四菌株一起构建ITS系统发育树Ⅱ,四菌株与代表种Cordyceps bassiana(AY532041.1)分到一个枝上,但在该枝上有三株布氏白僵菌,球孢与布氏白僵菌不能完全区分开.[结论]利用18S和ITS核酸序列均可将白僵菌鉴定到属,根据ITS序列可以确定四株白僵菌归属于球孢白僵菌的分支.     

江西烤烟棒孢霉叶斑病病原菌鉴定

为了鉴定江西省吉安地区一种新的烤烟叶斑病病原菌,研究了该菌的致病性、形态特征以及温度对其生物学特征的影响,分析了其核糖体DNA-ITS 序列同源性。结果表明,该病原菌属于棒孢属真菌,同源性分析显示,该菌与 Gen Bank 中多主棒孢霉 ITS 序列的同源性达99%以上,确认该病原菌为多主棒孢霉〔Corynespora cassiicola(Berk. Curt.)Wei〕;生物学特性测定结果表明,菌丝在低于9℃、高于39℃条件下不生长,生长最适温度为26.5℃;最适于产孢温度为29℃,而分生孢子萌发最适温度为26.5℃。烤烟棒孢霉叶斑病在江西属首次报道。     

引起茄子黄化萎蔫病原菌的分离与鉴定

采用病原形态学观察、接种致病性测定及分子鉴定的方法对引起南京地区黄化萎蔫茄子的病原菌进行了分离与鉴定.结果发现,从茄子黄化萎蔫植株上分离得到了2种病原菌:菌株VW003在PDA培养基上呈黑色圆形轮纹状,分生孢子呈卵圆形,经回接试验确定该菌为引起茄子黄萎病的大丽轮枝菌(Verticillium dahliae).菌株FW007经培养的气生菌丝呈白色絮状,小型分生孢子团生,卵圆形至椭圆形,大型分生孢子呈镰刀形;接种健康幼苗后也可引起植株黄化、萎蔫和死亡;利用真菌ITS通用引物对菌株FW007的基因组DNA进行PCR扩增,经测序鉴定与GenBank中尖孢镰刀菌菌株的ITS序列(登录号AY928409和JN107739)一致性高达99％,进一步确定菌株FW007为镰刀属尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum).以上结果表明大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌均可导致茄子的黄化萎蔫,且分别由这2种病原菌引起的茄子黄萎病和枯萎病通常伴随发生.     

1株生防芽孢杆菌的鉴定及其抑菌活性的初步研究

从芝麻连作田中分离筛选到1株具有拮抗作用的细菌菌株B10-26,为明确其对植物病原真菌的抑菌效果及其分类地位,采用纸碟法及含毒介质法测定了其对部分植物病原真菌的抑菌作用,并通过形态学、生理生化特征以及分子鉴定方法对菌株B10-26的分类地位进行了确定。结果表明,生防菌B10-26菌体和活性物质对菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、多主棒孢霉(Corynespora cassiicola)和芝麻长蠕孢(Helminthosporium sesami)均有较好的抑制作用。对菌株B10-26的16SrDNA序列同源性和系统发育分析,只能将其鉴定到芽孢杆菌属;对菌株B10-26的ITS序列同源性和系统发育分析表明,B10-26的ITS序列与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的ITS序列位于同一簇群,同源性达100%。结合形态特征、生理生化特性和ITS序列分析鉴定指标,将B10-26菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌。     

银杏产黄酮内生真菌的分离与鉴定

为了保护银杏资源,寻找生产黄酮类物质的替代品,采用选择性培养基,从银杏Gingkgo biloba L.的根、茎和叶中分离7株内生真菌,经高效液相色谱分析,证实3株内生真菌可产生槲皮素和山萘素类黄酮物质,其中内生真菌Enf 7的黄酮产量最高,达到70mg·100g-1干菌丝,可作为生产银杏黄酮的候选菌株.根据真菌的孢子结构、菌丝形态、菌落生长速度等形态学特征,结合核糖体RNA基因的居间序列(internal transcribed spacer,ITS)的碱基差异,确定3株产黄酮内生真菌分别属于安培菌属的白粉菌寄生菌Anpelomyces humuli、茎点霉属的头状茎点霉Phoma glomerata和镰孢属的茄镰孢Fusarium solani.     

10株白僵菌菌株ITS序列测定和系统发育分析

通过对10株白僵菌菌株进行培养和提取基因组DNA,并利用真菌ITS序列通用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增,均得到了1条长约500 bp DNA产物。分别对该产物进行序列测定和分析表明,这10株白僵菌菌株的ITS序列长为490~494 bp;利用ITS序列构建系统发育树表明,菌株YD-1、YD-2、JN-1、QC-1、SY-1、YC-1、YC-2、GA-1和FJ-2均为球孢白僵菌（Beauveria bassania）,而菌株FJ-1很可能为白僵菌属的一个新成员。     

一株野生蘑菇的鉴定

对实验室分离获得的一株野生蘑菇G1菌株进行了初步鉴定。传统形态学观察结果表明,G1菌株子实体菌盖白色,直径2.1~5.6 cm;菌柄粗0.6~1.0 cm,呈中央着生,菌柄和菌褶基端分离;在菌柄上部有单层菌环;有隔菌丝,菌丝体上无锁状联合;一个担子上普遍着生2个担孢子,孢子椭圆形、棕色,孢子的大小为(5.52~6.12)μm×(5.02~5.47)μm。根据形态学特征初步鉴定,G1菌株为蘑菇属双孢蘑菇(Agaricus bisporus)。由Gen Bank数据库进行同源性检索比对可知,G1菌株的ITS(Internal transcribed space)序列与双孢蘑菇的ITS序列同源性最高,为95%。综合形态学观察结果和ITS序列分析结果,最终鉴定G1菌株为双孢蘑菇。     

马铃薯早疫病菌rDNA-ITS区序列分析

采用真菌核糖体基因通用引物对马铃薯早疫痛茵的rDNA ITS区域进行扩增,克隆测序其PCR产物,序列分析结果表明,马铃薯早疫病菌与链格孢属的其他几个小孢子种在该区域的同源性均为100%,不存在任何序列差异.说明rDNA ITS区域不适合作为马铃薯早疫病分子诊断的靶序列.