用限制性酶切和Southern杂交对葡萄无核基因分子标记的分析

对葡萄（Vitis vinifera）无核基冈特异标记39970524-5-564和39970524—6—1538的DNA序列进行了克隆和测序，其序列全长分别为564和1538bp，GenBank登录号为AY327513和AY327514。用Wingene231 DNA分析软件对39970524—5—564和39970524—6—1538序列的限制性内切酶酶切位点进行了分析，可识别6个碱基及其以上序列的酶切位点分别有30和131个；EcoRⅠ和HindⅢ在39970524—5—564特异标记上没有酶切位点，而EcoRⅠ在39970524—6—1538第135个碱基处有一个酶切位点，HindⅢ在39970524—6—1538上没有酶切位点。用39970524—5—564DNA作探针对葡萄基因组DNA作Southern杂交，结果在无核亲本红光无核及无核基阏供给者无核白和无核杂种上出现杂交带，而且呈单拷贝，而在有核亲本红地球及有核杂种上未出现杂交带，进一步证明了39970524—5—564特异片段来源于无核葡萄基因组，为检测和克隆葡萄无核基因提供了证据。     

丹参遗传多样性的SRAP标记分析

相关序列扩增多态性(SRAP)是一种新发展起来的分子标记。试验通过建立优化的丹参SRAP反应体系,从88对引物组合中筛选得到36对多态性引物组合,对生长在四川中江、陕西商洛、山东临沂、安徽亳州和安徽凤阳5个丹参主产区的6个丹参种群进行了遗传多样性分析。结果表明:36对多态性引物组合共产生782条多态性条带,平均每个引物组合产生21.7条多态性条带,显示了较高的多态性。应用NTSYS软件聚类分析36对引物组合的扩增结果,供试材料分为两大类,Jaccard’s遗传相似系数在0.6774~0.8225之间,说明SRAP技术可有效地应用于丹参的遗传多样性及亲缘关系的研究。     

基于PCR的SSR标记分离方法综述

SSR分子标记是目前应用最广泛的第二代共显性分子遗传标记。SSR标记具有物种特异性,要应用该方法需要提前开发相应物种的特异SSR标记,而获得微卫星标记的经典方法是通过构建基因组片段文库和特殊标记SSR探针杂交法获取,这些方法经济成本相对较高且耗时耗力。近年来,该领域的研究中积累了很多研究成果和技术改进,发展起来几种基于PCR简便易操作且节约成本的SSR标记分离方法,例如基于RAPD的微卫星分离方法、基于ISSR抑制PCR扩增法、序列标签微卫星分析法、选择性扩增微卫星分析法以及荧光ISSR-PCR分离微卫星和微卫星扩增文库法等。本文主要对这些方法逐一进行综述,旨在为各个物种SSR标记的开发提供参考。     

SSAP逆转座子分子标记在柿属植物遗传分析中的应用

对SSAP（特异序列扩增多态性;sequence-specific amplification polymorphism）在部分柿属植物种质鉴定和亲缘关系分析中的应用进行了研究,并对每个SSAP引物单独用于柿属植物遗传分析的性能作了探讨。基于5个逆转座子引物的25对SSAP引物组合在供试28份柿属（Diospyros L.）基因型中共扩增出1300个位点（多态位点93.38%）,每对引物平均产生52个位点（含48个多态位点）,表明SSAP是一种高多重比例系数（multiplex ratio）和高多态性的标记系统;经SSAP数据的UPGMA聚类和主坐标分析,原产中国、日本的柿种质（D.kakiThunb.）及柿的近缘种各自单独成组,该聚类结果与部分已知亲缘关系的试材十分吻合,表明SSAP技术可用于柿属植物亲缘关系研究。此外,在25对SSAP引物组合中筛选出3对具高信息含量的引物组合,将在柿属植物遗传关系研究中广泛应用。     

拟南芥CBF4 基因位点的单核苷酸多态性(SNP)变化与抗旱表型的相应性

以生长于不同生态气候条件下的17个拟南芥(Arabidopsis thaliana)核心生态型为材料，分析了它们的相对抗旱性和抗旱转录因子CBF4基因的单核苷酸多态性(SNP)。结果表明，不同的拟南芥生态型具有差异明显的抗旱性。与拟南芥Columbia生态型相比，25av、203av和244av生态型的CBF4基因位点具有高密度的SNP和插入／缺失(Indel)，多态性的频率为每35．8bp 1个SNP，每143bp 1个Indel。Tajimma'S D统计学检验结果显示各区域都不显著，说明该区域核苷酸变化符合中性突变假说，较高的核苷酸多样性是净化选择的结果。基因非编码区的多态性是编码区的4倍，表明编码区承受着更大的选择压力。在编码区，SNP的频率为每96．4bp 1个SNP，其中1034位(以GenBank No．AB015478序列第19696位的核苷酸为1)碱基变化：G←→T，引起第205位氨基酸变化：gly←→val。而203av形成的haplotype6具有4个特异的SNP变化，其中5′端非编码区3个：27位的A←→G，129位的A←→C，171位的G←→A；3′端非编码区1个：1106位的A←→C。抗旱性鉴定结果表明203av拟南芥是抗旱性最强的一个生态型，研究认为haplotype6与它较强的抗旱性表型相应。     

基于简化基因组测序技术的甘薯HRM分子标记开发及其应用

目前甘薯中针对SNP位点的分子标记开发及应用的报道较少。为开发甘薯特异SNP分子标记,本研究利用简化基因组测序技术对甘薯种质材料进行测序,筛选稳定的SNP位点,将其开发为基于HRM技术的分子标记,并在甘薯种质材料中进行验证。通过对23个甘薯种质材料简化基因组测序数据的分析,共发现835 756个SNP多态性位点,筛选其中的3 650个含有SNP多态性位点的高质量测序片段,成功设计了134对引物;初步验证发现,22对(16.42%)引物没有扩增产物,15对(11.19%)引物扩增产物2个以上,36对(26.87%)引物的扩增产物没有差异。61对(45.52%)引物在8个样本中的扩增特异性好,而且样本之间有差异。最后筛选34对扩增多态性丰富的引物对52份甘薯种质材料进行扫描,发现材料间多态性介于27.27%~90.91%之间,平均多态性达到59.35%。聚类分析表明,参试52份甘薯种质材料之间的差异较小,多数材料与骨干亲本南瑞苕、徐薯18之间关系较近,国外引进甘薯材料和地方品种差异较大。建议在今后甘薯育种中尽量选用地方品种和国外甘薯品种,从而更好地拓宽甘薯遗传背景。本研究初步建立了基于简化基因组技术和HRM技术开发甘薯SNP分子标记的新思路,为今后甘薯SNP分子标记开发提供了参考。同时本研究开发的甘薯分子标记,丰富了甘薯分子标记类型,为甘薯研究者开展快速的分子标记研究提供了支持。     

枣SRAP-PCR体系的正交优化

相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism,SRAP）是Li and Quiros（2001）发展的新型的分子标记,该标记通过独特的引物设计对ORFs进行扩增,因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。国内有关SRAP反应条件的优化研究,一般采用单因子实验的方法,难免顾此失彼,忽视其互作效应,本实验拟采用正交试验设计的方法,从Mg^2＋、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶4种因素3个水平,对枣SRAP反应体系进行优化,旨在建立适合于枣SRAP反应体系,为进一步研究枣种质资源提供技术资料。     

利用生物信息学方法进行基于表达序列标签的玉米单核苷酸多态性标记的开发

针对简单重复序列（SSR）标记密度不足、单核苷酸多态性（SNP）标记开发一般只基于2种基因型的序列差异,用以检测其他基因型的材料时多态性不高,不能满足玉米基因精细定位需要的现状,本研究从公共数据库下载来自不同遗传背景的玉米表达序列标签（EST）,结合运用各种生物信息学软件,开发基于EST序列的高多态性SNP标记。通过对2018530条EST序列的比对分析,拼接发掘出遍布全基因组的80363个SNP位点。在SNP位点两侧保守序列上设计PCR引物,开发出12388 个SNP标记（www.sicau.edu.cn/web/yms/snp/snp.html）,包含34721个SNP位点。其中,6008个标记只含单一SNP位点,12762个位点的多态性信息含量（PIC）大于04,具有高度多态性。     

通用型植物表达载体pCamE的构建及功能验证

为了探索通用型植物表达载体的快捷构建,本研究通过PCR克隆、酶切连接和PCR扩增获得CaMV 35S启动子序列及pUC19多克隆位点部分限制性内切酶位点和NOS终止子,构建成完整的表达组件,并将该组件插入pCAMBIA1300的多克隆位点,构建成通用型植物表达载体pCamE(GenBank登录号:JX841315)。pCamE表达组件的启动子上游、多克隆位点和终止子下游分别含有4、8和3个单拷贝限制性内切酶位点,利于外源基因的克隆和插入以及对载体启动子或终止子的修饰和更换。以绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,eGFP)为报告基因,分别构建了表达载体pCam::GFP、pCam::SalGFP和pCam::DAHPS-GFP,转化洋葱(Allium cepa L.)表皮细胞和拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),绿色荧光蛋白(GFP)和融合蛋白DAHPS-GFP在洋葱表皮细胞中均成功稳定表达;在pCam::GFP转基因拟南芥株系的根、根尖、根毛、茎表皮毛、幼叶基部、叶柄微管组织和未成熟花药等组织均能观察到强烈的绿色荧光。表明,植物表达载体pCamE是可将不同目的基因与植物染色体整合并稳定遗传的通用型植物表达载体,不受外源片段大小及插入位点的影响,具有经济实用、适用广泛、操作简便和外源基因在转基因植物中遗传稳定且正常表达等特点。该载体可用于不同基因和不同功能表达载体的快捷构建,为植物的遗传转化和基因功能研究提供了新的通用型基因表达载体工具。     

利用分子标记辅助选择和花药培养改良光温敏不育系Y58S的稻瘟病抗性

Y58S是广泛应用的优良两系光温敏核不育系水稻品种。本研究通过分子标记辅助选择、花药培养与传统的回交技术相结合,将一全生育期广谱高抗稻瘟病基因R6导入Y58S,改良其稻瘟病抗性。根据改变激素的含量配制了4种诱导培养基,经比较发现激素配比为2,4-D3mg/L、KT1mg/L、NAA2mg/L的Y3培养基为Y58S背景材料花药培养的最佳培养基,其诱导率为15.08%,绿苗率为2.89%。本研究还获得1个含有R6基因的DH系,暂命名为YLH1,在远安自然诱发条件下稻瘟病抗性鉴定表明其分蘖期叶瘟抗性、抽穗期叶瘟抗性和穗颈瘟抗性均比对照Y58S显著提高。本研究表明花药培养和分子标记辅助选择相结合是改良光温敏核不育水稻稻瘟病抗性的快速、有效方法之一。     

Development of Expressed Sequence Tag (EST)-based Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) markers of tea plant and their application to cultivar identification

To develop cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) markers for cultivar identification of the tea leaf, 5 primer pairs designed on the basis of genes that encode proteins related to nitrogen assimilation and 26 primer pairs based on expressed sequence tag (EST) sequences of the root of tea plant were screened. From combinations of primer pair and restriction enzyme that showed polymorphism among tea plants, 16 markers were selected and applied to DNA fingerprinting of Japanese tea cultivars. Sixty-three cultivars, except for a bud sport (Kiraka) and its original cultivar (Yabukita) and a pair that was the progeny of the same crossing parent (Harumoegi and Sakimidori), were distinguished from one another. By combining the 16 markers with previously developed CAPS markers and observing the physical appearance, 67 cultivars were distinguishable. The cultivars involve approximately 95% of total tea cultivating area in Japan; therefore, about 95% of tea leaves produced in Japan can be authenticated by labeling their cultivars.     

甘蔗祖亲种RAPD标记的序列特征性片段扩增区域（SCAR）转化分析

采用RAPD标记技术获得了甘蔗(Saccharum)亲本种RSp2、RSp5、RSp6、RSo13和RSp16 5个RAPD标记特异片段.根据这5个特异片段的测序结果,设计了15对特征性片段扩增区域(SCAR)标记引物,并经SCAR标记特异引物筛选,ZT51、ZT52、ZT53、ZT55及ZT56为割手密种特异引物.RSp2这一甘蔗割手密种特异的RAPD标记被成功转化为割手密种(S.spontaneum)特异SCAR标记,记为ZT51-439.在甘蔗种质检测时,能在崖城割手密、印度割手密及部分云南割手密亲本种中特异检测出,并在具有割手密血缘的47份栽培种中均能检测到明显而唯一的439 bp割手密种特异条带.     

小麦抗叶锈病基因Lr45的表达序列标签-酶切扩增多态性(EST-CAPS)分析

为了获得与小麦(Triticum aestivum L.)抗叶锈基因Lr45更多的分子标记,建立更丰富的遗传连锁图谱,本研究利用表达序列标签-酶切扩增多态性(EST-CAPS)标记技术,选择小麦2A染色体短臂的26对EST引物与4种限制性内切酶共104对组合,对小麦抗叶锈近等基因系(near-isogenic line,NILs)TcLr45和感病对照Thatcher进行了多态性分析.EST引物BE426158与BE442876的PCR产物在亲本间存在差异,多态性检出率为7.7％; 104个引物/酶切组合中,CD454036/Msp Ⅰ、CD454036/HaeⅢ、BE406923/Msp Ⅰ和BE425962/RsaⅠ共4组在Thatcher和TcLr45之间呈现多态性,多态性检出率为3.8％.将BE426158标记成功转化为一个更稳定的序列标签位点(sequence tagged site,STS)标记,命名为LR45-1,经在TcLr45×ThatcherF2群体、抗叶锈近等基因系及黑麦品种中验证,LR45-1与Lr45连锁,遗传距离为8.2 cM.研究结果提示,EST-CAPS技术可应用于小麦抗叶锈病基因的多态性分析及分子标记的开发.     

应用RAPD技术快速进行西瓜杂交种纯度鉴定的研究

本研究建立了简单,快速提取西瓜半粒种子ＤＮＡ方法,并简化了适合西瓜的ＲＡＰＤ－ＰＣＲ分析程序。对“无籽京欣一号”西瓜种子纯度开展了分子鉴定研究,找到了一个随机引物ＯＰＰ－０１,用它扩增的ＯＰＰ－０１／５６４只在父本与杂交种上出现,母本不出现,本文还针对ＲＡＰＤ技术在西瓜杂交种纯度鉴定上实际应用的可能性进行了讨论。     

拟南芥抗致病疫霉突变体部分序列分析

目前获得拟南芥(Arabidopsis thaliana)突变体的主要方法是采用激活标签法(activation tagging)(Kakimoto,1996;Kardailsky et al.,1999)。本实验根据拟南芥突变体对致病疫霉表现的抗性差异,利用TAIL-PCR技术对感致病疫霉的拟南芥突变体进行遗传分析,为克隆拟南芥抗致病疫霉基因提供资料。     

Genetic Relationships and Variation among Biotypes of Dallisgrass (Paspalum dilatatum Poir.) and Related Species Using Random Amplified Polymorphic DNA Markers

The genus Paspalum L. consists of more than 400 species. Around twenty-five informal groups of species are recognized in Paspalum and the Dilatata group is of special interest because its members are excellent potential forage grasses. Seventy-five germplasm accessions, representing 15 taxa, were analyzed using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). Polymorphisms were observed with twenty-two primers in the Dilatata group and 16 of those were analyzed. Four hundred and four different RAPD fragments were generated, resulting in an average of 25.2 bands per primer. Among the 404 markers analyzed, 48 (11.88%) were exclusive for the P. dilatatum Poir. biotypes, 31 (7.67%) were exclusive to taxa belonging to other groups included in this study, 28 markers (6.93%) were diagnosed for other species of the Dilatata group and 16 (3.96%), for natural hybrids. Extensive RAPD variation was found among the species studied. Inter- and intra-taxonomic polymorphisms were detected. A dendrogram based on the RAPD data shows some clusters corresponding to the same taxa. However, the biotypes of P. dilatatum do not form a cluster. The present work confirms that the RAPD technique can be used to determine genetic relationships between the taxa belonging to the Dilatata group.     

一种改进的玉米SSR标记的PAGE/快速银染检测新方法

聚丙烯酰胺凝胶电泳技术由于其检测灵敏度和分辨率高的特点．特别适合于像SSR这样的小片段扩增产物的检测。银染法是其常用的显影方法之一，不同的银染法操作步骤及采用试剂有一定差异，主要集中在固定液的选择和洗脱次数上。本研究在参考以往各种银染法的基础上，进一步简化操作步骤，仅需染色和显影两步即可进行结果的判读，将其应用于玉米SSR标记的PAGE银染检测，为SSR技术在玉米种质纯度及真伪快速鉴定上的应用提供技术方法。     

钙对赭曲霉毒素A(OTA)诱导拟南芥毒性的抑制作用

为丰富赭曲霉毒素A (ochratoxinA,OTA)的植物毒性及其作用机理,探究钙在OTA诱导的植物毒性调控作用机理,本研究采用添加外源Ca2+,钙离子螯合剂乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid,EGTA)及OTA等处理离体拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶片,通过形态学观察,叶片相对电导率、活性氧含量(reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的测定等研究钙对OTA诱导的拟南芥毒性的影响,结果表明,在一定浓度范围内(0～50 mmol/L),外源Ca2+单独处理,拟南芥叶片形态学无明显变化,EGTA与OTA分别处理均会引起拟南芥叶片失绿、坏死病斑的形成,而Ca2+与OTA共同处理,能显著抑制OTA诱导的拟南芥叶片失绿、坏死病斑的形成,EGTA加剧OTA的毒性作用;OTA处理使拟南芥叶片相对电导率升高,细胞膜通透性增大,外源钙能显著抑制OTA引起的拟南芥叶片相对电导率升高(P＜0.05),20 mmol/L Ca2+的抑制作用最强,抑制率为61.32％.此外,OTA处理使拟南芥叶片细胞ROS的爆发及MDA的积累,对拟南芥造成氧化损伤,钙能显著抑制OTA诱导的拟南芥ROS爆发(P＜0.05),减少MDA的生成,抑制率分别为29.7％和71.4％.研究结果说明OTA能诱导拟南芥的植物毒性,钙能显著抑制OTA诱导的拟南芥植物毒性,钙在拟南芥受外界胁迫中起重要作用.     

黄瓜抗西瓜花叶病毒性状的序列特征性扩增区域(SCAR)标记

以抗西瓜花叶病毒 (Watermelon mosaic virus, WMV)的黄瓜（Cucumis sativus）品种秋棚和感该病毒的欧洲八号为亲本,构建了120个F6重组自交系群体。根据苗期抗病接种鉴定结果进行遗传分析,发现黄瓜抗WMV的基因是由隐性单基因控制。利用集团分离分析法和相关分子标记技术,获得的特异片段E-ACT/M-CTT-427与WMV的抗性基因连锁,连锁距离为8 cM。双亲差异片段测序结果显示感病亲本目标片段存在6个T碱基的缺失。根据测序结果设计了1对与目的基因遗传距离为8 cM的序列特征性扩增区域(SCAR)引物,该引物可用于黄瓜抗WMV病毒的分子标记辅助育种。     

Genetic diversity in bambara groundnut (Vigna subterranea (L.) Verdc) landraces assessed by Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) markers

Genetic diversity in 12 landraces of bambara groundnut (Vigna subterranea), an indigenous African legume, was evaluated using Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) markers. DNA from individuals of each landrace was also analysed to determine the level of heterogeneity within landraces. RAPDs revealed high levels of polymorphism among landraces. The percentage polymorphism ranged from 63.2% to 88.2% with an average of 73.1% for the 16 RAPD primers evaluated. The construction of genetic relationships using cluster analysis groups the 12 landraces in two clusters. RAPDs are useful for the genetic diversity studies in V. subterranea and can identify variation within landraces.