抗氯霉素特异性单克隆抗体的制备及鉴定

为制备氯霉素单克隆抗体,并鉴定其特性,采用重氮化法合成氯霉素-牛血清白蛋白作为免疫原免疫小鼠,通过杂交瘤技术建立杂交瘤细胞株,利用体内诱生法制备单克隆抗体,用间接ELISA和间接竞争ELISA分别测定抗体效价和特异性.结果获得细胞株5C9,诱生腹水中抗体的效价在1.024×106以上,抗体IC50约为0.94 ng/mL,与其他同类药物交叉反应均小于0.01％.制备的单克隆抗体特异性强,可用于氯霉素快速检测试剂盒的研制.     

单克隆抗体技术及其在畜牧兽医事业上的应用

<正> 1975年,英国的Milssoin等将不能长期持续培养的抗体产生细胞,与能够长期持续培养的骨髓瘤细胞融合成为既能产生抗体,又能长期持续培养的杂交瘤细胞,使大量制备均一性抗体成为可能。这一划时代的工作,是生物技术上的一次革命。这种由杂交瘤细胞纯系所分泌的抗体被称为“单克隆抗体”(McAb)。单克隆抗体如今作为一种“梦寐以求”的试剂正广泛应用于遗传学、细胞学、肿瘤学、免疫学、病毒学、细菌学、寄生虫病学、神经化学和胚胎学等各个领域,并取得令人瞩目的进展。一、单克隆抗体技术简介 (一)抗体产生细胞与骨髓瘤细胞(?) 制备杂交瘤时所用的抗体产生细胞,多数是使用注射过抗原的动物的脾细胞。制订     

抗小鹅瘟病毒中和性单克隆抗体研制及实验防治效果

用淋巴细胞杂交瘤技术研制出１１株抗小鹅瘟病毒（ＧＰＶ）单克隆抗体。这些单抗仅与ＧＰＶ反应，与其它细小病毒（ＣＰＶ、ＦＰＶ、ＰＰＶ）和其它禽病毒（ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＤＨＶ、ＤＰＶ）均不反应。腹水单抗的ＥＬＩＳＡ效价达１０－５～１０－７，琼扩沉淀效价达１∶２０～１∶５１２，鹅胚中和效价达１∶３０～１∶１２２，鹅体中和效价为１∶５４～１∶９６。ＧＰＡ１和ＧＰＣ５２株单抗对人工感染ＧＰＶ的雏鹅具有良好防治效果。     

新城疫病毒的抗独特型单克隆抗体的研制——新城疫单克隆抗独特型疫苗研究(Ⅱ)

作者用纯化 FE_8和 LA_(15-6)2株抗新城疫病毒(NDV)中和性单抗(MAb_1)分别免疫 BALB/c /小鼠,经杂交瘤技术获得2株抗独特型单克隆抗体(MAb_2),分别命名为AFE_8Id_(16-6)和ALA_(15-6)Id.在血凝抑制阻断试验(BHI)中,2株MAb_2都能阻断FE_8MAb_1抑制NDV血凝活性,BHI效价分别达1:8和1:4.在中和抑制试验(NIT)中,2株MAb_2在 1:10～1:80稀释时均可特异地抑制FE_8MAb_1中和NDV的能力,使部分试验鸡胚死于NDV感染.这些结果不仅表明,2株MAb_2的抗原结合位点是针对FE_8MAb_1独特型决定簇的,而且提示它们的可变区构形和与FE_8MAb_1相结合的NDV抗原决定簇或其邻近结构相似.这2株MAb_2可用于新城疫单克隆抗独特型疫苗的研究。     

鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的研制与鉴定

用经蔗糖密度梯度离心纯化的鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ，Ｍ４１）作为抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过常规淋巴细胞杂交瘤技术产生杂交瘤细胞，经ＥＬＩＳＡ筛选，获得了４株能分泌特异性抗ＩＢＶ单克隆抗体的细胞系，分别命名为４ＡＣ１、４ＡＦ１、６ＤＨ８及２ＤＨ１０。４株单抗的亚类都属于ＩｇＧ２ｂ，在Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ试验中，４ＡＦ１、６ＤＨ８２株单抗特异性地识别ＩＢＶ的核衣壳蛋白（Ｎ）；经ＥＬＩＳＡ测定，各株单抗４０ｈ培养上清效价达１０－２～１０－４，第７天腹水效价达１０－５～１０－６，４ＡＦ１、６ＤＨ８与所试７个ＩＢＶ标准株及２个ＩＢＶ分离株都发生反应     

金刚烷胺单克隆抗体的制备和鉴定

为制备金刚烷胺(AMD)的单克隆抗体(mAb),改造AMD的半抗原,采用EDC/NHS法合成人工免疫原AMD-BSA和检测抗原AMD-OVA,经紫外扫描和凝胶电泳进行鉴定,AMD与载体蛋白[牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)]成功偶联;用被免疫原(AMD-BSA)免疫BALBC/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,获得AMD杂交瘤细胞株,腹腔注射小鼠后,得到抗AMD的mAb。小鼠免疫后的多抗血清的效价均在6.4×10~3以上,所制得的杂交瘤细胞上清液的效价为3.6×10~2～1.0×10~3,2D5细胞株的腹水效价为5.12×10~5,对AMD的IC_(50)值为1.02μg/L,除与金刚乙胺的交叉反应率为9.82%,与其他结构类似物无交叉反应性。表明获得了高价、敏感和特异的抗AMD的单克隆抗体,为进一步的免疫学快速检测提供了技术支持。     

猪脂肪细胞膜单克隆抗体的制备

利用分离纯化的猪脂肪细胞膜蛋白在福氏完全佐剂中乳化 ,经皮下 (腹膜内 )免疫BALB/C小鼠。取脾细胞与SP2 /0骨髓瘤细胞进行融合 ,经筛选及克隆 ,成功地建立了 4株可分泌抗猪脂肪细胞膜蛋白单克隆抗体 (McAb)的杂交瘤细胞 2D3 、2D4、3F6、3E7,其中以 3E7稳定性最好 ,血清抗体效价为 1 0 3 ,此杂交瘤细胞株传代培养 2～ 3个月以上 ,ELISA检测抗体滴度无明显降低。     

IgM型单克隆抗体之scFv库的建立与筛选

从一个抗脂磷酸聚糖IgM型单克隆抗体细胞的mRNA中经RT-PCR克隆重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),然后将VH、Linker和VL连接成scFv,并克隆到载体pCANTAB-5E,转Escherichia coliTG1感受态细胞,构建了单链抗体库。通过辅助噬菌体M13KO7感染后,使单链抗体展示在噬菌体衣壳蛋白pIII的N端,得到噬菌体展示的抗体库。将抗体库用于"淘洗—富集—扩增"3轮以后,得到针对脂磷酸聚糖特异性的噬菌体抗体。测序结果表明,该scFv的VH基因序列全长390 bp,编码127个氨基酸;VL基因序列全长341 bp,编码113个氨基酸。二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基。     

抗Zhangfei蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备抗Zhangfei蛋白的单克隆抗体,并鉴定其特性。【方法】用Zhangfei融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0融合,筛选出阳性克隆,应用有限稀释法筛选抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤株;采用腹水诱生法制备单抗腹水,用饱和硫酸铵法纯化腹水抗体;采用间接ELISA、单克隆抗体亚型检测试剂盒、免疫印记技术、曲线拟合方案等分别鉴定单抗效价、亚型、特异性和亲和力等特性。【结果】免疫小鼠的血清抗体效价达1∶5 000以上,细胞融合克隆率为98.96%,阳性克隆率为30.18%,筛选出2株抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤细胞,其培养上清效价均达到1∶800,腹水单抗效价分别为1∶105和1∶2×105,亲和常数分别为2.5×106和2.3×106。制备的抗Zhangfei蛋白单克隆抗体的亚型均为IgG1类型。【结论】制备的抗Zhangfei蛋白单克隆抗体具有较高的效价和较强的亲和力,可用于进一步研究Zhangfei蛋白在机体中的生理作用。     

猪蛔虫卵可溶性抗原单链抗体库的构建及初步筛选

为进一步研制抗猪蛔虫的高特异性、高亲和力的基因工程抗体奠定基础,以猪蛔虫未成熟虫卵可溶性抗原免疫BALB/C小鼠,提取小鼠脾脏总RNA,以RT-PCR技术分别扩增出H链和L链可变区基因,以SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成ScFv片段,然后将ScFv片段克隆至pCANTAB-5E载体,并转化至感受态TG1菌,经...     

胰腺癌人源噬菌体单链抗体库的构建及初步筛选

提取胰腺癌患者的外周淋巴细胞总RNA,以RT-PCR技术分别扩增出人源抗体H链和L链的可变区基因,采用SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成scFv片段,然后将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,并电转化至感受态TG1菌,经辅助噬菌体M13K07拯救,获得胰腺癌人源噬菌体单链抗体库。结果表明,从外周血淋巴细胞中获取可变区基因,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗胰腺癌单链抗体的策略是可行的。     

抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建

 【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体（single chain variable fragment,ScFv）基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础。【方法】利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠,制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体,从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）法构建其单链抗体基因,并克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中,重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。【结果】获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1、2D12B6、3D8A10。成功构建了单链抗体基因ScFv,获得的ScFv基因大小约750 bp,其中重链可变区（VH）基因有360 bp,轻链可变区（VL）基因有342 bp,中间连接肽基因45 bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5 kD的ScFv重组蛋白。【结论】试验获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株,成功构建了ScFv基因,并实现了原核表达,为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质的研究打下了基础。     

间接ELISA筛选鹅源副粘病毒病单克隆抗体方法的建立

将鹅源副粘病毒NA-1株接种SPF鸡胚进行病毒增殖,用蔗糖密度梯度离心对病毒进行纯化.用提纯的鹅源副粘病毒作为抗原包被ELISA板,通过反应条件的筛选,建立检测鹅源副粘病毒病单克隆抗体的间接ELISA方法.结果表明,抗原最佳包被质量浓度为5 mg·L-1,血清最适稀释度1∶80,其作用时间为60 min,羊抗鼠酶标二抗的最适质量浓度为1∶6 400,最适作用时间为60 min,37℃显色15 min.不与小鹅瘟等3种疫病阳性血清发生反应.对282孔杂交瘤细胞液进行检测,阳性检出率为12.77%,高于血凝抑制试验的阳性检出率(10.28%),符合率为91%.     

抗氯霉素单克隆抗体的制备及直接竞争ELISA方法的建立

用人工合成的氯霉素-卵清蛋白(CAP-OVA)免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术筛选出1株能稳定传代并分泌抗氯霉素(CAP)单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞4C9,并以此制备腹水单抗.经间接竞争ELISA(ciELISA)检测,该单抗亚类重链类型是IgG1,轻链为κ类型,单抗腹水效价为1∶1×106,与甲砜霉素、氟甲砜霉素以及其他常见抗生素的交叉反应率小于0.01%.用过碘酸钠氧化法合成CAP酶标记单抗,建立了CAP直接竞争ELISA(cdELISA)方法.此法检测的线性范围为0.1~100 ng·mL-1,半数抑制浓度(IC50)为5.81 ng?L-1.添加回收实验表明所建立的CAP cdELISA方法检测限达到0.1 ng·L-1,对比试验表明其检测灵敏度与商品试剂CAP ELISA基本相当.     

2种不同无色孔雀石绿单克隆抗体的制备

【目的】制备无色孔雀石绿（LMG）单克隆抗体,并分析其生物学特性,为建立LMG残留的免疫学检测方法奠定基础。【方法】通过改进的碳二亚胺法制备无色孔雀石绿牛血清白蛋白偶联物(LMG-BSA)与副品红牛血清白蛋白偶联物（PA-BSA）,用紫外扫描、质谱法方法鉴定偶联物。利用制备的LMG-BSA与PA-BSA作为免疫原,免疫4～5周龄Balb/c小鼠,用杂交瘤技术制备LMG单克隆抗体,并对其效价、亲和力、灵敏度和特异性等进行分析。【结果】LMG-BSA与PA-BSA的偶联比率分别为7∶1和37∶1;经间接酶联免疫吸附（ELISA）法筛选,由LMG-BSA和PA-BSA抗原各获得1株杂交瘤细胞,分别命名为L-1、P-1。这2株细胞株分泌的单克隆抗体纯化后,经测定效价分别为1.25×10⁵和6.25×10⁶,亲和力常数分别为4.92×10⁹和1.44×10⁸ L/mol,半抑制质量浓度（IC₅₀）分别达8.03和10.5 μg/L。L-1分泌的单克隆抗体仅与孔雀石绿存在交叉反应,交叉反应率为100%;P-1分泌的单克隆抗体与孔雀石绿及副品红均存在交叉反应,交叉反应率分别为80%与100%。【结论】成功获得了2株LMG单克隆抗体,其均可用于水产品中LMG残留的快速检测。