美国白蛾基因组DNA提取及RAPD反应条件优化

用改进的SDS法从无水乙醇浸泡美国白蛾幼虫标本中提取到高分子量的可用于RAPD扩增的基因组DNA。用正交试验对影响RAPD扩增的条件进行优化得到最佳反应体系：20 μL反应体系中,模板浓度1.25 ng/μL、引物浓度1.2 ng/μL、dNTP浓度 0.2 mmol/L、Mg2+浓度 3.0 mmol/L、TaqDNA聚合酶用量2.5 U。确定最佳退火温度为38 ℃。PCR反应条件：94 ℃ 30 s、38 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s 35个循环后,72 ℃延伸5 min。为在分子水平上讨论美国白蛾种群的遗传分化提供基础。     

小菜蛾ISSR-PCR反应体系的建立与正交设计优化

以小菜蛾(Plutella xylostella)基因组DNA为模板,采用L16(45)正交试验设计方法,建立小菜蛾的ISSR最佳反应体系。通过梯度退火试验,确定不同引物的最适退火温度。优化得到的反应体系(20μL)为:Mg2+浓度1.5mmol/L、Taq DNA聚合酶2.5U、dNTPs浓度0.2mmol/L、引物浓度1.25μmol/L、模板DNA量20ng。反应程序为:94℃预变性5.0min;94℃变性45.0s,40～61℃(不同引物退火温度各异)退火1.0min,72℃延伸1.5min,40个循环;72℃延伸10.0min;10℃保存。利用所建立的ISSR-PCR反应体系,获得了清晰、重复性好的DNA谱带。     

腐食酪螨ISSR最佳反应体系的设计

本文以腐食酪螨基因组DNA为模板,采用逐个参数优化法,探讨腐食酪螨ISSR实验的最佳反应体系。实验结果表明,腐食酪螨ISSR-PCR最佳反应体系:总体积25μL,其中Mg2+1.5 mM;10×Buffer 2.5 mM;dNTPs 0.2 mM;ISSR引物0.2μM;模板DNA 50 ng;Taq DNA聚合酶0.75 U。扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性1 min,(48℃、50℃、52℃)复性1 min,72℃延伸1.5 min,循环35次,结束后72℃延伸5 min,4℃保存。同时通过梯度退火实验,确定不同引物的最佳退火温度。     

高GC含量青枯菌aac基因PCR扩增体系的建立与优化

通过添加增效剂、正交试验设计优化PCR反应体系、联合采用多种PCR程序等措施,建立并优化了PCR扩增体系,成功地从高GC青枯菌基因组中扩增出了长度为2 434 bp且GC含量高达70.9%的aac基因。PCR反应体系为20 μL包括5%DMSO、2.5 mmol/L MgCl2、500 μmol/L dNTP、10 pmol/L引物、1.25 U Taq酶、50 ng模板DNA。首先采用热启动PCR：95 ℃5 min,保持80 ℃,加入Taq酶;然后采用二步PCR：5个循环包括变性95 ℃1 min,65 ℃1 min;最后采用降落PCR：30个循环为95 ℃1 min,78 ℃1 min,每个循环降低0.5 ℃,72 ℃3 min;补充10个循环为95 ℃ 1 min,63 ℃1 min,72 ℃3 min;72 ℃10 min。该试验体系的建立与优化为研究高GC含量生物的基因功能提供了方法。     

基于URP-PCR多态性片段的苦瓜枯萎病菌特异性检测技术的建立

 通过URP(Universal Rice Primers)-PCR分析尖孢镰孢菌苦瓜专化型基因组DNA扩增片段多态性,筛选检测尖孢镰孢菌苦瓜专化型的特异性引物,并建立了基于该引物的PCR检测方法。结果表明,特异性引物为FOMM-SPF/FOMM-SPR, PCR检测体系为25 SymbolmAL,包括2SymboltB Green Taq Master Mix 12.5 SymbolmAL,10 mmol·L^-1 的上下游引物各1 SymbolmAL,模板DNA 1 SymbolmAL,灭菌去离子水补足至25 SymbolmAL;PCR程序为95℃预变性3 min,94℃变性15 s,57℃退火30 s,72℃延伸20 s,共30个循环,循环结束后72℃延伸5 min;特异性扩增片段大小294 bp,检测灵敏度为2 ng·μL^-1 DNA或50个孢子·500 mg^-1土壤。该引物及其检测方法对尖孢镰孢菌苦瓜专化型的检测特异性好、灵敏度高,可以从土壤和植物样品中快速准确地检测出苦瓜枯萎病菌,无需病原菌的分离培养和致病性检测,对苦瓜枯萎病的早期诊断和预警及有效防控具有重要的指导意义。     

高GC含量青枯菌aac基因PCR扩增体系的建立与优化

通过添加增效剂、正交试验设计优化PCR反应体系、联合采用多种PCR程序等措施,建立并优化了PCR扩增体系,成功地从高GC青枯菌基因组中扩增出了长度为2434bp且GC含量高达70．9Y00的aac基因。PCR反应体系为20pL包括5％DMSO、2．5mmol／LMgCl2、500／xmol／L dNTP、10pmol／L引物、1．25U Taq酶、50ng模板DNA。首先采用热启动PCR：95℃5min,保持80℃,加入Taq酶;然后采用二步PCR：5个循环包括变性95℃1min,65℃1min;最后采用降落PCR：30个循环为95℃ 1min,78℃1min,每个循环降低0．5℃,72℃3min;补充10个循环为95℃1min,63℃1min,72℃3min;72℃10min。该试验体系的建立与优化为研究高GC含量生物的基因功能提供了方法。     

荒漠刺叶墙藓DNA的提取及PCR扩增反应条件

采用改进CTAB法、NaOH法和直接PCR法(direct PCR amplification)提取藓类生物结皮中刺叶墙藓(Tortula desertorumBroth.)基因组DNA,比较其分离效果以及ISSR扩增效果。结果表明:改进CTAB法提取的基因组DNA质量好、纯度高,ISSR扩增反应效果好。直接PCR法一旦体系建立,则是最简易快速、经济高效的模板制备方法,适于植株矮小、生物量很小的荒漠藓类植物个体模板DNA的制备。利用改进CTAB法获得的基因组DNA作为模板,对ISSR反应组分浓度及反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化实验,建立了刺叶墙藓最优ISSR反应体系。反应总体积为20μL,各反应组分终浓度为:2μL10×Buffer,2 mM Mg2 ,0.1 mM dNTPs,0.2μM引物,10~40 ng模板DNA,1U Taq酶。扩增程序为:94℃4 min,1个循环;94℃45 s,退火温度(Tm)45 s,72℃1 min,35个循环;72℃7 min,1个循环;4℃保存。刺叶墙藓是组成古尔班通古特沙漠藓类生物结皮的优势种,研究结果为进一步开展刺叶墙藓遗传多样性的研究奠定了基础。     

基于环介导等温扩增技术检测由强雄腐霉引起的玉米茎腐病

为建立强雄腐霉Pythium arrhenomanes的快速分子检测技术,基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)以β-tubulin基因为靶标序列,设计强雄腐霉的特异性引物,建立了一种准确快速的LAMP检测方法,并对该检测方法的特异性、灵敏度和实际应用效果进行评估。25μL LAMP最终反应体系为:10×ThermoPol Buffer 2.5μL、10 mmol/L dNTPs 3.5μL、6 mmol/L MgSO_4 2μL、5 mol/L甜菜碱4μL、40μmol/L FIP-1/BIP-1各1μL、5μmol/L F3-1和B3-1各1μL、40μmol/L LB-1 1μL、Bst DNA polymerase 1μL、2.5 mmol/L HNB 1.9μL、模板DNA 2μL、灭菌水3.1μL。LAMP体系在等温64℃条件下反应60 min,HNB显色反应显示天蓝色即为阳性反应;扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证为梯形条带,也可判定为阳性反应。特异性检测结果显示,LAMP体系能特异性地检测出强雄腐霉,而其它卵菌近缘种和常见植物病原真菌均未检测出。灵敏度检测结果显示,LAMP体系的最低检测灵敏度为10 pg/μL,是普通PCR反应灵敏度的1 000倍。在实际应用中,LAMP体系能够快速检测出人工接种和实际发病玉米组织中的病原菌。表明本研究建立的快速、准确、可视化的LAMP检测方法能在60 min内检测出强雄腐霉。     

利用错配碱基引物的ASO-PC R检测小麦赤霉病菌对多菌灵中抗菌株Codon200TTC→TAC基因型

采用在引物3'端引入错配碱基,建立了特异性检测小麦赤霉病菌对多菌灵中抗菌株(Codon200TTC→TAC)基因型的ASO-PCR分子检测技术.结果表明含有错配碱基的引物对NT-7 Rl/NT-7 Err5 F能够特异性检测小麦赤霉病菌对多菌灵的中抗菌株(Codon200TTC→TAC),扩增条件为94℃预热5 min;94℃变性60S,56℃退火60S,72℃延伸60S,35个循环;最后72℃延伸15 min.并利用26种常见植物病原真菌验证了所设计引物的PCR扩增特异性.整个检测过程快速,操作简单,结果准确,在6小时内完成.     

利用错配碱基引物的ASO-PCR检测小麦赤霉病菌对 多菌灵中抗菌株Codon200 TTC→TAC基因型

 采用在引物3′端引入错配碱基,建立了特异性检测小麦赤霉病菌对多菌灵中抗菌株(Codon²⁰⁰ TTC→TAC)基因型的ASO-PCR分子检测技术。结果表明含有错配碱基的引物对NT-7 R1/NT-7 Err5 F能够特异性检测小麦赤霉病菌对多菌灵的中抗菌株（Codon²⁰⁰ TTC→TAC）,扩增条件为94℃预热5 min;94℃变性60 S,56℃退火60 S,72℃延伸60 S, 35个循环;最后72℃延伸15 min。并利用26种常见植物病原真菌验证了所设计引物的PCR扩增特异性。整个检测过程快速,操作简单,结果准确,在6小时内完成。     

樱桃灰霉病菌LFD-RPA快速检测方法的建立

 灰霉病是樱桃的主要病害,由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染所致。该病菌可为害樱桃的花、叶、果实等多个部位,尤其在樱桃生长中后期及贮藏期发病率极高,危害严重。依据樱桃灰霉病菌内转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立了樱桃灰霉病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。结果表明,该方法检测条件为37℃扩增30 min,能特异性地检测灰葡萄孢,灵敏度为100 fg·μL^-1,略低于常规PCR(10 fg·μL^-1)和荧光定量PCR(7.43 fg·μL^-1);检测方法用时短,PRA扩增仅需30 min,LFD检测仅需10 min。本研究建立的快速检测方法可用于樱桃灰霉病菌的实时监测及病害的田间快速诊断。     

环境温度对群居型和散居型亚洲小车蝗呼吸代谢的影响

为明确群居型和散居型亚洲小车蝗Oedaleus asiaticus对气候变化的呼吸代谢响应机制,采用多通道昆虫呼吸仪测定15、20、25、30和35℃温度下2种生态型亚洲小车蝗的呼吸率、代谢率、CO2释放率及呼吸商.结果 显示,随着温度的升高,群居型亚洲小车蝗的呼吸率、代谢率、CO2释放率均呈逐渐增加的趋势,且不同温度...     

小麦白粉病菌基因组DNA的微量提取及ISSR-PCR反应体系的优化

为了寻找适合小麦白粉菌基因组DNA微量提取的方法,本试验利用改进的CTAB法、电钻微量研磨一管法、FastPrep DNA试剂盒法和Chelex-100法分别提取小麦白粉菌基因组DNA。比较得出,在微量提取时,CTAB法的提取率较高;在分生孢子量较多时,FastPrep DNA试剂盒方法提取的DNA质量较高,这两种方法提取的DNA均适用于ISSR-PCR。采用正交设计L16(45)法优化了适合于小麦白粉病菌群体的ISSR体系,确定了25μL时优化的反应体系:1×buffer、模板DNA0.5ng、dNTP0.14mmol/L、TaqDNA聚合酶1U、引物1.4μmol/L、Mg2+1.8mmol/L。利用该体系筛选出了一批多态性较好的ISSR引物,为小麦白粉病菌遗传多样性研究奠定了基础。     

桃蚜基因组DNA提取及SSR反应体系优化和应用

针对蚜虫体型微小,体表有外骨骼等特点对改进的醋酸钾（KAC）法作了优化,优化后的方法可在常温条件下更加简易和有效地提取高质量的单头蚜虫基因组DNA,结果表明,DNA样品的A260/280值普遍在1.6～1.9之间,电泳检测基因组DNA纯度和完整性较好。同时在20 μL的反应体系中将PCR的5个主要成分分别设定10个浓度梯度,研究了适合桃蚜SSR分子标记的优化体系,结果表明,最适宜的优化浓度分别为：1.5 mmol/L Mg2+,0.25 mmol/L dNTP,1.0U Taq酶,40 ng/μL模板DNA,25 ng/μL引物。利用甘肃省酒泉地区马铃薯桃蚜来验证此优化体系,30%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示,扩增产物大多在100～300 bp,多态性高,且反应体系的稳定性和可重复性好。     

牛筋草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以牛筋草地上组织为材料,采用正交优化和单因子试验两种方法对影响牛筋草ISSR-PCR体系的Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度和DNA模板浓度5个因素进行优化试验,建立适合牛筋草ISSR-PCR的反应体系.结果表明,牛筋草ISSR-PCR反应体系的最佳条件为:Mg2+1.75 mmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq DNA聚合酶1 U/25 μL,引物0.3μmol/L,模板DNA 80 ng/25μL,10×PCR Buffer 2.5 μL/25 μL.利用优化体系进行牛筋草的ISSR-PCR反应,可获得稳定性高、重复性好、背景清晰的电泳结果.