杜仲糖基转移酶基因EuCGT1克隆及序列分析

本研究以杜仲(Eucommia ulmoides)7月雌株新生幼枝的树皮为材料,根据杜仲转录组测序数据中筛选的一个糖基转移酶基因(CGT)片段信息设计引物,采用SMART RACE技术,克隆了5’-端1432bp和3’-端535 bp cDNA片段,测序拼接后获得全长1 583 bp的杜仲CGT的cDNA序列。分析结果表明,该cDNA开放阅读框长1 464 bp,编码487个氨基酸,命名为EuGT基因。EuGT在NCBI中经blastn比对,显示序列与甜橙和草莓的UDP-葡萄糖基转移酶基因同源性分别为72%和67%;推测的氨基酸序列经blastp和CDD比对,显示序列与UDP-葡萄糖类黄酮3-O-糖基转移酶-6同源,其中含有UDP-葡萄糖基转移酶的保守域(pfam00201),初步推测EuCGT1蛋白属于糖基转移酶家族。本研究克隆的EuGT基因是首次从杜仲中克隆的糖基转移酶家族基因。以EuCGT1基因构建的植物表达载体pSH-35S-EuCGT1采用农杆菌介导法遗传转化烟草,获得了含EuCGT1基因的转基因烟株,移栽生长1个月的转基因烟草植株在表型上与野生型烟草无明显差异。     

玉米ZmHDR基因的分子克隆及生物信息学分析

为了解Zm HDR在玉米叶绿体发育过程中的作用机制及进化模式,利用RT-PCR方法克隆了玉米HDR基因,并对其进行了生物信息学分析.结果表明,ZmHDR基因在玉米基因组中以单拷贝形式存在,全长序列为3 188 bp,其中含有1 389 bp的开放阅读框,编码1个由462个氨基酸组成的蛋白;半定量PCR分析表明,该基因是一个组成型表达的基因;不同物种氨基酸序列比对结果显示,ZmHDR基因与高粱、水稻、黄花蒿、烟草、三叶胶、孜然芹、拟南芥、青色藻同源性比较高,暗示该基因在进化上具有高度的保守性.     

玉米光周期反应及一个相关基因的克隆

【目的】研究玉米的光周期反应，克隆出玉米中的EMF同源基因并研究其表达模式。【方法】以热带玉米自交系CML288和温带玉米自交系黄早四为材料，研究了它们在9 h和15 h光周期处理后的反应和热带自交系CML288在不同时期两种日照挪动处理下的光周期反应。通过RT-PCR法克隆到一个玉米上的EMF同源基因，并检测了该基因在经过不同光周期处理的自交系CML288、黄早四及其F1的不同生长时期茎尖中的表达。【结果】 CML288对光周期的反应非常敏感，黄早四相对不敏感。CML288在短日照条件下7片叶时期是光周期反应的敏感时期，在长日照条件下9片叶时期是光周期反应的敏感时期。推测新克隆的cDNA序列含有完整的1 881bp的开放阅读框，编码一条约71kD的多肽，包含626个氨基酸残基，编码的蛋白质有一个C2H2型锌指结构区,两个核定位信号区和一个酸性区，可能是DAN结合蛋白，Northern杂交显示，其在茎尖和叶片中均有表达。经不同光周期处理后，该基因在2个自交系及F1不同生长时期茎尖中的表达情况不同。【结论】克隆到的基因其功能可能与促进营养生长和抑制生殖生长有关。     

枸杞胆碱合成关键酶基因PEAMT的克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR和RACE结合的方法,获得了枸杞磷酸乙醇胺N-甲基转移酶PEAMT基因cDNA全序列(命名为LbPEAMT).LbPEAMT cDNA全长1 863 bp,开放读码框1 497 bp,编码一个由498个氨基酸构成的多肽,理论分子量为56.53 kDa,等电点pⅠ为5.50.通过多种序列比对,该基因编码的氨基酸序列与番茄PEAMT氨基酸的相似性为93％.二级结构预测LbPEAMT蛋白由44.98％的α-螺旋、17.67％的延伸链、6.63％的β-转角和30.72％的不规则卷曲组成.LbPEAMT是一个亲水蛋白.含有2个S-腺苷甲硫氨酸依赖催化活性结构域,分别位于N端65-164 aa和C端290-392aa.每个活性区都包含有4个部分基序,分别为Ⅰ、post Ⅰ、post Ⅱ和post Ⅲ.LbPEAMT的这2个活性区在蛋白、磷脂和小分子甲基转移酶中都是相对保守的.     

牛FABGL基因cDNA的克隆与序列分析

以中国西门塔尔牛肝脏组织为材料,运用同源序列克隆技术结合RT-PCR和RACE技术,对牛FABGL基因的cDNA进行了克隆与序列分析,并对推导的FABGL蛋白结构与性质进行了初步分析。结果表明,牛FABGL基因的cDNA序列长994 bp,包括780 bp的开放阅读框、16 bp的5′非翻译区和198 bp的完整3′非翻译区,由260个氨基酸组成。该基因cDNA核苷酸编码区序列与猕猴、人、猪和小鼠FABGL基因的相似性分别为89%,89%,87%和86%。推导的氨基酸序列与猕猴、人、猪和小鼠的相似性分别为89%,87%,89%和86%。以FABGL基因cDNA编码区序列构建的分子进化树研究结果表明,牛的FABGL基因在人、猕猴、猪、鼠等物种中,与猪的亲缘关系最近。牛的FABGL蛋白的三级结构包含2个跨膜结构—Cu toff模体,分别位于11~16位氨基酸和128~131位氨基酸处。     

香蕉MaPRMT1基因的分离及表达分析

[目的]为研究香蕉果实采后成熟机理奠定分子基础。[方法]通过抑制差减杂交和cDNA微阵列相结合的方法分离获得1个香蕉PRMT基因的cDNA片断,并克隆了该基因全长cDNA序列,对其进行生物信息学分析和在香蕉不同器官与果实不同成熟时期的表达模式分析。[结果]MaPRMT1基因cDNA全长1158 bp,具有完整的开放阅读框,编码385个氨基酸,与植物中的PRMT的同源性较高,含有1个Methyltransf-11结构域。在香蕉根、茎、叶和果实中均有表达,且在茎和叶中的表达量较高。随采后天数的增加,表达量逐渐下降,但至香蕉乙烯释放高峰时最大,后又开始下降。[结论]MaPRMT1属于第1类精氨酸甲基转移酶,在香蕉不同器官和果实不同成熟期呈差异表达。     

一种简单、快速克隆玉米功能基因的方法

电子克隆是随着基因组计划和EST计划的发展而产生和发展起来的一种克隆功能基因的新方法。随着玉米(Zea mays L)大量EST序列的公布,使得这项技术在玉米上的应用成为可能。介绍了玉米电子克隆的原理、方法与过程,并通过实例证明了该方法的可行性和有效性。     

人血清白蛋白基因的克隆及序列分析

根据Genebank(登陆号V00495)中人血清白蛋白HSA的cDNA序列,设计扩增引物。采用RTPCR自人胎盘中扩增出HSA基因的全长cDNA。产物纯化后连至PMD18T载体,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆菌,酶切鉴定并进行序列测定。结果表明,该试验成功地克隆了HSA基因的1995bp全长cDNA,与Genebank中参照序列同源性为99%。     

茶树咖啡酸氧甲基转移酶基因的克隆及原核表达

以从茶树叶子中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR利用RACE技术,得到咖啡酸氧甲基转移酶(caffeic acid o-methyltransferase,COMT)基因全长1 381bp,其开放阅读框为1 092bp,编码393个氨基酸,推测的蛋白分子量约为39.661 9ku,理论等电点为5.66,在GenBank的登录号为HM204933。其核苷酸序列与欧洲白桦、苎麻、中果咖啡和毛果杨的COMT基因相似性分别为80%、78%、77%、77%,氨基酸序列与毛果杨的COMT基因达100%。将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果表明茶树COMT基因能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,电泳检测到一条大约60ku的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。     

玉米磷酸丙糖异构酶基因的克隆及原核表达

为克隆玉米(Zea mays L.)磷酸丙糖异构酶基因ZmTPI,并进行序列分析和原核表达研究,根据玉米TPI基因的cDNA全长序列设计特异引物,以玉米叶片总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增得到了约750bp的基因编码区cDNA片段,T/A克隆后进行了序列测定及序列分析,随后将克隆到的该基因片段构建到原核表达载体PGEX-4T-1上,得到的重组表达质粒GST-ZmTPI转化Bl21进行融合蛋白的诱导表达及纯化。结果显示,玉米ZmTPI(GenBank:EU959275)cDNA全长1 216bp,753bp开放阅读框编码250个氨基酸,推测分子量26.7205kDa,理论等电点为5.12;该蛋白具有高度保守的TIM结构域,与其它高等植物的同源蛋白有很高的相似性;进化树分析表明,玉米TPI与甘蔗亲缘关系最近,处于同一进化支;SDS-PAGE检测结果显示,成功诱导表达并且纯化了与预期大小一致的融合蛋白。玉米ZmTPI蛋白的基因克隆和原核表达及纯化的成功,为进一步研究目的蛋白的酶活性质及生物学功能奠定了基础。     

虹鳟PDCD6基因cDNA全长的克隆与功能预测

程序性死亡因子6（PDCD6）基因编码1个含EF-hand结构域的钙离子结合蛋白。应用逆转录PCR及cDNA末端快速扩增（RACE）技术从虹鳟（Oncorhynchus mykiss）脑组织中克隆了PDCD6基因cDNA的全序列（GenBank No：FJ591154）。序列全长1 179bp,其中5’端非翻译区长48bp,3’端非翻译区长567bp,开放性阅读框长564bp,编码187个氨基酸。电子表达谱分析结果表明该基因在4种脊椎动物的多个部位或组织中均有表达。同源模建蛋白三级结构显示该蛋白具有8个主要的α螺旋结构。虹鳟PDCD6蛋白序列与斑马鱼、非洲爪蟾、人、小鼠和鸡的同源性均高于85%,表明PDCD6基因在进化过程中是高度保守的,在细胞程序性死亡过程中发挥重要作用。     

玉米ZmCIPK基因的克隆及表达特性

根据玉米(Zea mays L.)CIPK基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从玉米中克隆了一个ZmCIPK基因。结果表明,ZmCIPK基因cDNA全长1 956 bp,5’-非编码区长62 bp,3’-非编码区长337bp,编码区长1 557 bp,编码518个氨基酸,预测分子量为57.18 kDa,等电点为8.94。氨基酸同源性分析表明,ZmCIPK与高粱的CIPK蛋白质同源性较高。实时定量PCR检测表明,ZmCIPK基因的表达受干旱、盐胁迫和高温诱导,说明玉米ZmCIPK基因可能参与玉米对逆境胁迫的应答。     

梁平柚葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达

基于GenBank公布的葡萄糖基转移酶(LGT)基因的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以梁平柚成年树幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增葡萄糖基转移酶基因,将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了该基因的融合表达载体pET28a-CmLGT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中.经1.0mmol/LIPTG诱导表达获得大小约为62Kd的目的融合蛋白.     

黄鳝性逆转相关基因的克隆和表达

运用cDNA末端快速扩增(Rapid-Amplification of cDNA Ends,RACE)技术和半定量RT-PCR技术,克隆了黄鳝(Monopterus albus)性腺差异表达基因(F64)的cDNA全长序列,分析了该基因于各期性腺组织的表达情况。结果表明,F64基因cDNA全长1 721 bp,含有142 bp的5’-UTR、268 bp的3’-UTR、1 311 bp的开放阅读框(ORF),共编码436个氨基酸;在线SignalP分析表明,F64亚基肽链不存在信号肽,为非经典分泌蛋白;同源性分析结果显示该基因无同源性序列,视为新报道的基因;F64在卵巢发育早期不表达,从排卵的Ⅴ期卵巢开始表达,随着卵巢的败育和精巢的发育,表达量明显升高。     

利用CODEHOP方法克隆高山红景天葡萄糖基转移酶基因cDNA片段

根据已报道的植物糖基转移酶氨基酸序列,利用CODEHOP方法设计简并引物,同时利用改良的CTAB法提取高山红景天的叶片RNA并反转录为cDNA第1链,然后采用3-′RACE的方法克隆得到未知糖基转移酶的3′端基因序列(GenBank登录号EU145020),并采用生物信息学技术进行序列分析。结果证明CODE-HOP引物设计结合茉莉酮酸甲酯诱导方法克隆获得未知糖基转移酶基因成功率更高。     

受MeJA诱导的烟草GTs基因启动子的克隆及转化

利用已克隆的1个受甲基茉莉酸(MeJA)诱导的糖基转移酶(GTs)基因,以PCR扩增得到该基因启动子序列,长度约为1.4kb,用改造后的双元载体pCAMBIA1301与GTs基因启动子连接,构建了含目的启动子与GUS基因的融合基因质粒pCAP-GUS.通过根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草W38,经PCR检测验证得到了含有融合基因的转基因烟草植株,为进一步研究GTs基因的功能奠定了基础.     

玉米CIPK3蛋白激酶的克隆及表达分析

利用同源克隆的方法从玉米中获得1个可能编码CIPK的基因ZmCIPK3.ZmCIPK3包括CIPK家族的特征性结构域:N端的蛋白激酶结构域和C端的调节结构域NAF.序列分析表明ZmCIPK3的开放阅读框有1 323个碱基组成,编码440个氨基酸的多肽.表达分析表明ZmCIPK3受各种信号诱导,比如干旱、低温、NaCl和ABA.研究表明Ca2+促进ZmCIPK3的表达,而且Ca2+通道阻断剂(LaCl3)及Ca2+螯合剂(EDTA)能够部分降低这种促进效应.这些结论表明,ZmCIPK3可能属于逆境(或者ABA)胁迫基因,第2信使Ca2+调控其在逆境胁迫下的表达.     

桑树白藜芦醇合酶基因全长克隆及序列分析

根据已知的其他物种白藜芦醇合酶cDNA保守序列设计引物,用RT－PCR技术从桑葚中扩增获得白藜芦醇合酶基因部分cDNA序列,再用RACE技术获得其两端序列,并拼接得到完整的1442 bp白藜芦醇合酶基因。经序列分析发现,桑树白藜芦醇合酶基因开放阅读框长1170 bp,编码389个氨基酸,氨基酸序列含有芪合酶家族特征信号区GVLFGFGPGLT和活性中心序列GCFAGGTVLR;该基因与花生芪合酶基因的核苷酸序列同源性高达82．82％,氨基酸序列的同源性高达87．15％。     

白桦BpGT14基因启动子克隆及表达活性分析

本文利用SiteFinding-PCR方法克隆了白桦BpGT14基因起始密码子ATG上游2 169 bp序列,并通过PLACE启动子预测工具对其进行元件分析。结果表明,该启动子片段含有启动子核心元件及多种逆境及激素响应元件,同时具有植物苯丙烷及木质素生物合成的MYB类转录因子的重要结合基序。研究选取了其中含有启动子核心元件的1 156 bp片段构建了pBpGT14∷GUS植物表达载体,利用农杆菌侵染的方法将pBpGT14∷GUS报告基因瞬时转化烟草植株,鉴定该启动子在烟草中的表达活性及对非生物胁迫和激素的响应模式。对转基因烟草植株进行GUS染色,结果表明该启动子具有启动活性,且在茎段处活性较高;进一步分析非生物胁迫对烟草中GUS酶活性的影响,表明该启动子对ABA、NaCl、PEG及高温处理均有明显响应,且对于NaCl及PEG处理响应迅速。为了更好的鉴定白桦BpGT14基因启动子在白桦细胞中的启动活性及响应模式,本文构建了pBpGT14∷GFP载体并瞬时转化白桦茎段悬浮细胞,进行研究。GFP转录水平分析结果与GUS酶活性结果基本一致,但其中部分时间点仍存在差异。选取PEG处理3、6、12及24 h的转GFP基因白桦茎段悬浮细胞,在显微镜下观察其绿色荧光蛋白,以此揭示该启动子对干旱的响应模式。结果表明,该启动子在白桦茎段悬浮细胞中启动了GFP的表达,在处理初期(3 h),荧光效果明显;随着处理时间的增加,细胞脱水明显,且在细胞壁表现高亮度荧光。