pBI121-Lyz-GFP表达载体的构建及其在和田苜蓿愈伤组织中的转化

将绿色荧光蛋白(GFP)基因片段插入到pBIl21-Lyz多克隆区,构建了重组表达载体pBI121-Lyz-GFPo经Sma Ⅰ与BamH Ⅰ双酶切和PCR验证重组质粒,均能得到约750 bp的目的片段,通过进一步测序证明,GFP基因已成功地连接到pBI121-Lyz中,且重组质粒连接方向正确.利用冻融法将重组质粒导人根癌农杆菌(Agrobactcrium tumenfaciens)LBA4404,用叶盘法转化和田苜蓿(Medicago sativa L.cv.Xinjiang Daye),筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和荧光显微镜检测证明,重组基因已成功地转化到和田苜蓿愈伤组织中.     

pBI121-LyrZ-GFP表达载体的构建及其在和田苜蓿愈伤组织中的转化

将绿色荧光蛋白（GFP）基因片段插入到pBI121-Lyz多克隆区,构建了重组表达载体pBIl21-Lyz-GFP。经SmaⅠ与BamHⅠ双酶切和PCR验证重组质粒,均能得到约750bp的目的片段,通过进一步测序证明,GFP基因已成功地连接到pBI121-Lyz中,且重组质粒连接方向正确。利用冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumenfaciens ） LBA4404,,用叶盘法转化和田苜蓿（Medicago sativa L. cv. Xinjiang Daye）,筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和荧光显微镜检测证明,重组基因已成功地转化到和田苜蓿愈伤组织中。     

鸭梨果胶甲酯酶基因反义表达载体的构建及转化

果胶酯酶(pectin methylesterase,PME)催化细胞壁中多聚半乳糖醛酸的脱甲酯化,可以降解植物细胞壁中的果胶多糖而与果实软化有关。本研究根据白梨果胶酯酶基因PcPME4的序列,设计一对含有特定酶切位点的特异性引物,以鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)cDNA为模板通过PCR扩增得到一段294bp的PME基因片段。将片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,经限制性酶切分析和测序分析证明成功构建PME基因的反义表达载体pBI121-AsPME。将pBI121-AsPME电转化农杆菌EHA105,利用含pBI121-AsPME的农杆菌工程菌液侵染鸭梨外植体后于抗性培养基中诱导愈伤组织,获得的抗性愈伤组织经PCR初步检测含有反向PME基因片段,荧光定量PCR检测结果显示受侵染的愈伤组织中PME基因表达量降低,表明反向插入的PME基因片段起到了抑制内源基因表达的效果。     

山定子遗传转化体系的优化

为了优化山定子(Malus baccata)遗传转化体系,利用DNA重组技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)克隆到植物表达载体pBI121中,得到新型的重组质粒pBI121-eGFP。重组pBI121-eGFP质粒在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105介导下转化山定子。结果表明,叶片切块后振荡侵染5~8min,共培养3 d,之后用含有500 mg/L Cef的MS液体清洗后转移到含有300 mg/L Cef的筛选培养基中,同时卡那霉素的筛选浓度由5 mg/L加大到20 mg/L时,获得的转化效率较高。对体系优化过程中获得的7株抗性苗进行了PCR检测、RT-PCR分析、绿色荧光现象观察及荧光蛋白信号分析,结果显示,其中6株抗性苗PCR检测呈阳性,3个eGFP基因表达量较高的转基因株系T1、T3和T6的绿色荧光现象较强,且具有较高的荧光蛋白信号。荧光检测与分子检测结果基本一致,从而可以利用绿色荧光直接检测转基因植株,达到优化山定子遗传转化体系的目的。     

根癌农杆菌介导谷子的遗传转化

将带有gus基因的双元表达载体pBI121，由根癌农杆菌(Agrobacterum turnefaciens)LBA4404介导转到谷子(Tetaria italica)的愈伤组织中，经50mg／L卡那霉素筛选，获得抗性愈伤组织，抗性愈伤组织进一步筛选分化得到转化植株。经Sorthern杂交和GUS活性检测，表明外源基因已经整合到谷子基因组中，并且可以有效地表达，转化效率为6．6％。     

草莓乙烯受体FaEtr1和FaErs1基因的克隆及其反义表达载体的构建

在已报道的FaEtr1和FaErs1基因序列的基础上,设计特异引物,分别克隆草莓(Fragaria ananassa)乙烯受体FaEtr1基因580bp部分特异序列和FaErs1基因445bp部分特异序列,将上述2个片段分别反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子和Nos终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr1和pBI121Ers1。将带有完整启动子和终止子的FaEtr1和FaErs1基因引入pCAMBIA1301中,最终获得FaEtr1和FaErs1的双价植物表达载体pFRS。将这3个重组表达质粒pBI121Etr1、pBI121Ers1和pFRS导入根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)EHA105中,PCR及限制性内切酶酶切确定质粒已被导入。     

拟南芥低温诱导cor15a基因的启动子克隆及在转基因马铃薯中的表达

利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)品种Columbia的基因组中扩增出低温诱导基因cor15a的启动子片段并插入克隆载体。序列分析表明，克隆的启动子长900bp，与目前已经发表的启动子序列完全一致。将此启动子插入pBI121的gus基因及NOS终止子上游构成表达载体pLB，通过直接法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，并转化马铃薯(Solarium tuberosum)获得转化再生植株。再生植株PCR检测和PCR-Southern鉴定结果证明，cor15a基因启动子已经成功地转入到马铃薯植株基因组中。GUS组织染色证明拟南芥cor15a启动子在马铃薯中也同样具有低温诱导表达的能力。     

农杆菌介导的蓝色基因转化中国水仙

从矮牵牛(Petunia hybrida)花瓣中分离得到编码蓝色基因F3'5'H(类黄酮3',5'羟基化酶)的Hf2基因(1527 bp),从牵牛(Ipomoea nil)花瓣中分离得到dfr基因(二氢黄酮醇4-还原酶,1212 bp),将正向Hf2片段和反向dfr片段连接到pBRLys双元载体质粒上,得到具有Ubi(ubiquitin)组成型启动子的植物表达载体pU-bi-Hf2-dfr.利用冻融法将双价重组质粒pUbi-Hf2一afr导入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105中,菌落PCR鉴定农杆菌转化子.以中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)愈伤组织为材料,进行遗传转化.CTAB法提取130株中国水仙遗传转化再生苗的基因组DNA,进行PCR和PCR-Southem blot检测,获得3株阳性转基因植株.     

外源lea3基因转化紫花苜蓿的研究

将来源于大麦的lea3基因通过基因枪法导入紫花苜蓿栽培品种“中苜一号”的胚性愈伤组织中,经过膦丝菌素类除草剂(PPT)的4次筛选获得抗性愈伤组织,诱导分化后共获得21株抗性再生植株。经叶片涂抹除草剂试验和lea3基因的PCR分子检测证明,lea3基因已整合到紫花苜蓿的基因组中。与对照植株相比,获得的转基因植株具有显著增强的耐盐能力,表明遗传转化lea3基因可用于苜蓿抗旱耐盐新品种的选育。     

GAPB基因原核表达载体的构建

以拟南芥cDNA为模板,用PCR扩增出GAPB的基因全长,然后将GAPB基因片段连接到PET28a(+)载体上,构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α,经菌落PCR和酶切鉴定筛选出阳性克隆,测序正确后,再将阳性克隆的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。结果表明:成功构建了原核表达载体PET28a(+)-GAPB,为后续的GAPB融合蛋白的表达以及纯化奠定了基础。     

农杆菌介导的木薯转基因研究初报

将米曲霉植酸酶基因phyA克隆于植物表达载体pB1121的CaMV35S启动子（P35s）下游,构建了含有P35s—phyA-TNOS表达盒的重组质粒pBI-phyA,并用电脉冲法将其导人大肠杆菌中。通过三亲接合将pBI—phyA质粒由大肠杆菌导入根癌农杆菌LBA4404菌株,获得带有phvA基因的根癌农杆菌工程菌株LBA4404／pBI-phyA。用LBA4404／pBI—phyA转化木薯外植体652个,在含100mg／L卡那霉素和250mg／L氨苄青霉素的MS分化培养基上诱导分化芽,获得24株抗卡那霉素转化苗。以转化苗和未转化植株的总DNA为模板,用phyA基因的同源序列为引物,进行聚合酶链式反应（PCR）,结果表明9株转化苗的PCR结果为阳性,初步证明目的基因phvA已经转入木薯中。     

花青素调节基因Lc对转基因烟草和矮牵牛花色的影响

利用PCR的方法从油菜(Brassica napus)基因组中扩增得到花瓣特异性启动子XY355，将XY355与玉米花青素调节基因Lc融合构建植物表达载体pXY60。用冻融法将pXY60转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，然后以烟草（Nicotiana tabaccum L.）和矮牵牛（Petunia hybrida）的叶盘为外植体，通过根癌农杆菌介导法进行遗传转化。对再生植株的PCR检测证明外源基因已经整合到转基因烟草和矮牵牛的基因组中。对转基因烟草和矮牵牛的表型进行观察：转Lc基因烟草的花色由浅红变成了红色，转Lc基因矮牵牛的花色由白色变成了浅紫色。     

玉米Lc基因植物表达载体构建及菊花转化

Lc基因是从玉米中分离得到的与花青素合成相关的调节基因，它在多种植物中的异源表达可以增加花青素的含量。本研究对pBI121载体Gus基因后的终止子进行2次PCR扩增，在原Sac I酶切位点后添加了新的Sac I酶切位点，利用组织化学染色法检测，结果表明改造后的载体上的Gus基因能正常表达，终止子功能正常，载体改造成功。用改造的pBI121N构建了含有Lc基因的植物表达载体pBI121N-Lc，利用农杆菌介导法转化菊花叶盘，获得了19株生根抗性苗。通过提取抗性苗基因组总DNA，PCR扩增Lc基因和CaMv35S启动子获得了11个阳性株系，PCR结果表明Lc基因已经转入菊花中。同时，在己获得的转基因植株中发现7个株系的根系有变红的现象。     

辣椒烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸基因(NADPH)在辣椒中的遗传转化及其抗病性鉴定

为了分析辣椒NADPH基因与辣椒疫病抗性之间的关系,明确其在辣椒抗疫病方面的作用,以辣椒NADPH基因为目的基因,利用载体pBI121构建了植物表达载体pBI121-NADPH,采用农杆菌介导法转化辣椒(Capsicum annuum L.)感病品种B12,获得了5个卡那霉素抗性转化株系。对卡那霉素抗性转化植株进行PCR和RT-PCR分子检测发现,这5个转化株系含有目的基因CanNADPH。应用辣椒疫病抗性离体叶片鉴定技术,鉴定转基因植株对疫霉菌(Phytophthora capsici)的抗病性,结果表明,转基因辣椒的发病率较非转基因植株降低了22.2%,其病情指数降低了46.5%,表明辣椒NADPH基因在辣椒抗疫病方面有重要作用。     

家蚕胞质肌动蛋白基因启动子的克隆及piggyBac转座子表达载体的构建

摘要: 利用PCR方法从家蚕（Bombyx mori）总DNA中克隆到细胞质肌动蛋白基因（cytoplasmic actin）启动子片段，序列分析表明，该片段中含有典型的组成型表达的细胞质肌动蛋白基因A3（BmA3）调控序列：SRE元件（serum response element）和ActE1元件(active element 1)。该序列的核苷酸序列与来自欧洲的一个家蚕品种的序列同源性为94%。通过多次重组，将A3启动子片段(不含信号肽序列)与转座子 piggyBac的转座酶编码区融合构建成辅助质粒；将其(含信号肽序列和部分编码区)与报告基因多管水母绿色荧光蛋白基因gfp融合，插入到人工合成的转座子piggyBac两反向重复末端序列之间，进而构建成基于转座子piggyBac的转基因载体。研究中构建的转座子转基因载体仅6.4 kb，并在两反向重复末端序列之间设计了1个多克隆位点区，便于目的基因的插入。     

杆状病毒SpltMNPV gp41基因的克隆、表达及抗体制备

摘要：GP41是杆状病毒包埋型病毒粒子（Occlusion-derived virus，ODV）特有的糖蛋白，它介导芽殖型病毒粒子（Budded virus，BV）的核衣壳通过胞核。用PCR方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedro virus，SpltMNPV）gp41基因, 并将其克隆至5′端有6×His编码序列的原核表达载体pQE30上，转化大肠杆菌(Escherichia coli )M15[pREP4]，在1 mmol/L异丙基-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导下超量表达了与理论预测值相符的1个37.9 kD融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔制备了特异的抗GP41抗体。Western印迹分析表明，该抗体适合进一步分析SpltMNPV GP41蛋白。     

绿脓杆菌ATCC27853菌株外毒素A全长编码基因的克隆及其在 HEK 293T细胞中的表达

采用PCR方法从绿脓杆菌ATCC27853菌株基因组扩增其外毒素A（PEA）全长编码基因,并将PEA基因插入到pcDNA3.1A真核表达载体中,构建成pcDNA3.1/ PEA质粒表达载体。经磷酸钙介导将重组质粒转染 HEK293T 细胞进行表达。结果表明本文克隆的PEA基因与标准菌株PA103碱基序列基本相似,同源性达99%。表达产物经蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测,表明本文构建的含有原基因信号肽的PEA基因能够在真核细胞进行分泌性表达,这为基于PEA的免疫毒素、疫苗佐剂和疫苗载体的研究奠定了基础。     

RPW2表达载体构建及对烟草的遗传转化

将RPW2基因插入表达载体pBI121的表达盒中,构建了RPW2组成型表达载体。通过农杆菌叶盘转化法转化烟草叶片,经卡那霉素筛选、PCR扩增和Southern杂交鉴定证明,RPW2基因已成功转入烟草细胞中,获得6个转基因株系。RT-PCR半定量分析表明,转基因烟草株系的叶片中有RPW2基因的表达。不同转基因株系表达量不同,转基因株系T-R2和T-R4表达量较高。转基因植株叶片上人工接种烟草赤星病菌液检测转基因植株的抗病性,结果表明,与对照植株相比转RPW2基因植株对烟草赤星病抗性显著增强,说明RPW2基因在烟草中也具有抗病能力。另外,转基因株系间RPW2基因表达量虽有差异,但抗病性没有显著差异。     

刚地弓形虫亲环蛋白基因TgCyP真核表达质粒的构建及其在Hela细胞内的表达

亲环蛋白（cyclophilin,CyP）是一类广泛存在于原核和真核生物体内的胞溶性蛋白,是刚地弓形虫（Toxoplasmngondii）速殖子的主要成分,能够诱导产生IL-12和IFN-γ,在控制弓形虫急性感染过程中起重要作用。本研究根据GenBank发表的TgCyP基因序列,设计并合成一对包含BamHI和EcoRI酶切位点的引物,以cDNA为模板,应用PCR技术扩增TgCyP基因。PCR产物连接到pMD18-T克隆载体。用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切克隆载体,将TgCyP目的基因克隆到载体pVAXI,构建真核表达质粒pVAXl-TgCyP。将真核表达质粒转染Hela细胞,利用问接免疫荧光检测其在Hela细胞内的表达情况。结果表明扩增的TgCyP基因与GenBank上相应基因序列（U04633．1）的一致性达100％,构建的真核表达质粒pVAX1-TgCyP能在转染的Hela细胞中表达,其表达产物与刚地弓形虫阳性血清具有免疫反应性。本研究表明Tg-CyP有望作为弓形虫疫苗的候选抗原,将为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定基础。