转“全鱼”GH基因黄河鲤胚胎发育观察研究

正转基因鱼是借助生物技术手段,将外源基因导入受体鱼内,通过外源基因的定点整合,使其优良性状在鱼体上得以表达,并经过人工选育而培育出的一类性状优良、遗传稳定而且具有较高经济价值的鱼类。中国科学院院士朱作言等于1985年率先在世界上成功研制出了转基因鱼,并建立了转基因鱼模型,此后鱼类基因转移技术在世界范围内迅速发展,     

文蛤Clq基因的克隆与表达及其重组蛋白活性的研究

利用构建的文蛤cDNA文库,克隆得到了文蛤Clq基因全长cDNA序列,该序列全长1213bp,5′UTR为316 bp,3′UTR为372bp,开放阅读框长度为525bp,编码174个氨基酸.在文蛤Clq(MmClq)蛋白中,Clq结构域与软体动物、两栖类动物和脊椎动物中的Clq结构域均具有较高的同源性.通过荧光实时定量PCR,MmClq mRNA在所检测的各个组织中均有表达,在肝胰脏中表达量最高.在细菌感染试验中,文蛤受鳗弧菌感染后,Clq相对表达水平有明显的上升调节,注射2h,MmClqmRNA表达量最高,为对照组的2.19倍.包含成熟肽的MmC1q cDNA片段被重组,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用牛津杯法对MmClq重组蛋白进行体外抑菌试验,但并未检测到明显的抑菌活性.     

文蛤C1q基因的克隆与表达及其重组蛋白活性的研究

利用构建的文蛤cDNA文库,克隆得到了文蛤C1q基因全长cDNA序列,该序列全长1213bp,5′UTR为316bp,3′UTR为372bp,开放阅读框长度为525bp,编码174个氨基酸。在文蛤C1q(MmC1q)蛋白中,C1q结构域与软体动物、两栖类动物和脊椎动物中的C1q结构域均具有较高的同源性。通过荧光实时定量PCR,MmC1q mRNA在所检测的各个组织中均有表达,在肝胰脏中表达量最高。在细菌感染试验中,文蛤受鳗弧菌感染后,C1q相对表达水平有明显的上升调节,注射2h,MmC1qmRNA表达量最高,为对照组的2.19倍。包含成熟肽的MmC1q cDNA片段被重组,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用牛津杯法对MmC1q重组蛋白进行体外抑菌试验,但并未检测到明显的抑菌活性。     

坛紫菜杂交重组品系的选育与特性分析

坛紫菜选育品系(HR-6)具有叶状体快速生长期的前期生长较快,色素蛋白含量高,但成熟较早,生长期短,丝状体的壳孢子放散量较少等特性;坛紫菜另一个选育品系(HR-5)具有叶状体快速生长期的前期生长较慢,色素蛋白含量高,但成熟晚,生长期较长,丝状体的壳孢子放散量多等特性。为改善HR-6品系叶状体成熟较早,壳孢子放散量较少的弱点,本文以HR-6品系为父本,HR-5品系为母本进行种内杂交,从杂合丝状体产生的F1叶状体中选育出了综合性状更加优良的品系(WD-7)。在叶状体的快速生长前期(日龄30~45d),父本品系的绝对生长率为6.68cm/d,母本品系为3.63cm/d, WD-7品系为6.67cm/d;在叶状体的快速生长中后期(日龄46~60d),父本品系的绝对生长率降至5.15cm/d,母本品系则升至7.27cm/d,而WD-7品系高达11.54cm/d。父本品系的叶状体成熟最早,培养35d左右,大部分个体已成熟;WD-7品系遗传了母本品系成熟较晚的优点,日龄55d之后,大部分个体才出现成熟。日龄35d的叶状体平均厚度,WD-7品系为29.87μm,分别比父、母本品系增加了10%和16%,藻体的韧性明显增强。WD-7品系的壳孢子放散总量为183.42万个/壳,分别是父、母本品系的1.17倍和0.57倍。上述结果证实,WD-7品系不仅遗传了父本品系叶状体快速生长期的前期生长较快的特性,同时又遗传了母本品系叶状体成熟晚、生长期长、中后期生长快的优点,壳孢子放散量也比父本品系有所增加,此品系有望被培育成适宜大规模栽培的新品种。     

基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒病毒样颗粒的构建与鉴定

为研究II型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)病毒样颗粒(viruses-like particles, VLPs)疫苗,本试验利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统(baculovirus expression vector system, BEVS)将编码VP35蛋白的GCRV-S11基因克隆入杆状病毒载体pFastBacHTA^TM,然后将鉴定正确的重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,筛选得到重组穿梭质粒Bacmid-VP35。将穿梭质粒Bacmid-VP35以及实验室前期构建的重组穿梭质粒Bacmid-VP3、Bacmid-VP4分别转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4。利用Bac-PAK快速滴定试剂盒测定重组杆状病毒滴度,并通过间接免疫荧光(IFA)和Western Blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果显示,本试验获得了较高滴度的重组杆状病毒,并且重组蛋白在杆状病毒感染的sf9昆虫细胞中正确表达。将成功表达的重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4共感染sf9细胞组装GCRV-VLPs,通过透射电镜(EM)进行检测。结果显示,GCRV的3个蛋白在sf9昆虫细胞中可以完成自我组装,形成与天然病毒结构形似的VLPs,直径大小为65-72nm。本试验结果为进一步研制安全、高效的GCRV-VLPs疫苗奠定基础。     

坛紫菜与Pyropia radi种间杂交重组优良品系的选育与特性分析

为获得具明显杂交重组优势的紫菜优良品系,实验以印度产紫菜Pyropia radi野生型品系(Pr-WT01,特点:藻体厚、生长慢、韧性好、壳孢子放散量多)为父本,坛紫菜诱变品系(Ph-HMC5,特点:藻体薄、生长快、韧性差、壳孢子放散量少)为母本进行种间杂交,从杂合丝状体产生的F1叶状体中选出4个综合性状优良的杂交重组品系,HR-6品系为其中的最优良品系。父本品系叶状体的绝对生长率最大值为0.39 cm/d,母本品系为5.24 cm/d,而HR-6品系高达9.27 cm/d,在日龄30~50 d期间,它的平均绝对生长率比母本品系的最大生长率还大。日龄60 d的叶状体平均体长父本品系为13.18 cm,母本品系为85.67 cm,而HR-6品系已达218.57 cm,分别是父、母本品系的16.58倍和2.55倍。日龄35 d的HR-6品系叶状体的叶绿素a含量高达9.43 mg/g,比父、母本品系分别增加了50%和20%;另外,它的总藻胆蛋白含量高达99.62 mg/g,分别是父、母本品系的2.18倍和1.74倍。日龄35 d的HR-6品系的叶状体平均厚度为26.22μm,比父本品系降低了37%,比母本品系增加了30%,叶状体的韧性明显增加。HR-6品系的壳孢子放散总量达167.72万个/贝,分别为父、母本品系的1.13和2.65倍。上述研究结果表明,HR-6品系具有生长快、品质好、壳孢子放散量大等优良性状,表现出良好的生产适用性。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) CSFR2基因的重组表达及其蛋白纯化与功能分析

通过对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)进行全基因组及转录组测序,预测了一个半滑舌鳎性别相关基因CSFR2,目前已对该基因进行了克隆和表达分析。为进一步研究CSFR2基因的功能,本研究从蛋白层面入手,构建了原核表达载体p ET-32a-CSFR2,转化到大肠杆菌E.coli进行诱导表达,用His Trap进行蛋白纯化,SDS-PAGE电泳检测诱导及纯化产物,并将表达纯化的CSFR2蛋白注射1龄半滑舌鳎精巢。由于CSFR2是一个性别相关基因,因此无法通过免疫反应来直接检测其蛋白活性,本研究通过不同时间点取样检测半滑舌鳎其他性别相关基因Cyp19a和Foxl2的表达量变化,来间接反应CSFR2蛋白的活性及功能。实验结果显示,重组蛋白能够进入到活体细胞内并发挥一定作用,在6–72 h内对性别相关基因Cyp19a和Foxl2的表达有上调作用,说明CSFR2蛋白具有生物活性,并能调节其他性别相关基因的表达量,间接促进雄激素转化为雌激素。本研究进一步了解CSFR2基因在半滑舌鳎性别决定与分化中的作用,可为半滑舌鳎性别控制提供理论依据,在人工诱导鱼类性逆转方面有重要应用价值。此外,本研究为蛋白活性验证提供了一种新方法。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌性特异基因CSW3重组蛋白的表达与应用

CSW3基因序列来源于半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)全基因组测序项目,是经过筛选得到的雌性特异候选基因之一。本研究探索了半滑舌鳎雌性相关基因CSW3的表达与应用,构建了半滑舌鳎雌性特异CSW3基因重组表达载体,通过大肠杆菌进行了体外重组表达,对基因表达产物进行分离纯化,并通过蛋白转染的方法研究了纯化的蛋白对几个性别相关基因的影响。结果显示,雌性特异CSW3重组蛋白注射鱼体后对半滑舌鳎性腺foxl2、sox9a、amh这3种性别相关基因的表达水平具有显著影响,能够引起雌性相关基因foxl2表达上调、雄性相关基因sox9a和amh表达下降。从蛋白水平对雌性相关基因CSW3的基因功能进行初步研究,为半滑舌鳎性别控制及全雌苗育种提供基因资源及技术方法。     

红笛鲷头肾消减cDNA文库的构建与分析

应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建红笛鲷(Lutjanus sanguineus)头肾消减cDNA文库,筛选红笛鲷免疫相关基因的EST.以哈氏弧菌(Vibrio harveyi)灭活疫苗体内诱导红笛鲷为实验组,以注射无菌生理盐水的红笛鲷为驱动组,通过SSH技术构建红笛鲷头肾消减.DNA文库.利用PCR技术和斑点杂交对文库进行筛选,从2 424个含插人片段的阳性克隆中筛选了680个克隆在上海生工进行了序列测定.使用BLASTx和BLASTn工具对获得的ESTs与GenBank数据库进行同源性比较并根据相似性序列的名称通过GO法对ESTs进行注释.结果获得了30个与红笛鲷免免疫防御相关基因的EST,如组织相容性抗原复合物基因(MHC I和MHCII),免疫球蛋白基因(IgH和IgL)、热休克蛋白基因(HSP10,HSP70和HSP90)等.本研究构建了哈氏弧菌灭活疫苗免疫后与正常组织差异表达的消减cDNA文库,并获得一批与红笛鲷免疫防御相关的ESTs,旨在为探讨红笛鲷分子免疫防御机制、筛选参与免疫防御调控相关的功能基因,揭示红笛鲷免疫抗病机制、提高机体抗病力、实现遗传改良奠定基础.     

黄鳝转铁蛋白基因的克隆及其N-lobe的重组表达

以黄鳝（Monopterus albus）肝脏c DNA为模板,利用RACE-PCR扩增了黄鳝转铁蛋白Tf基因5’和3’c DNA末端,构建了Tf基因N端原核表达载体;转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后经过Ni-NTA His·Bind Resin亲和柱分离纯化获得Tf-N蛋白;利用琼脂糖扩散抑菌圈法验证Tf-N蛋白的抑菌作用;分析了Tf-N蛋白对黄鳝肠道假单胞杆菌（Pseudomonas spp.）铁获取作用的影响。结果显示：成功克隆了黄鳝Tf基因全长,构建了pET28a/Tf-N重组表达载体,获得了纯化的Tf-N蛋白;Tf-N蛋白可抑制假单胞杆菌的生长,能与假单胞菌来源的Bfr蛋白一起共同促进假单胞杆菌的生长。该研究结果可为进一步探索鱼类Tf基因的功能提供参考。     

斜带石斑鱼生长激素基因重组蛋白的发酵

将含有石斑鱼生长激素基因的毕赤酵母X33进行震荡培养后,装入≥50L的自控罐中,28~30.5℃、pH 5.5~6.0、溶解氧≥30mg/L条件下发酵84h,生产石斑鱼生长激素基因重组蛋白。发酵期间,通过甲醇诱导毕赤酵母获得目的蛋白的高效表达,最后通过Western Blot和SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶电泳对目的蛋白进行定性定量检测。最终获得目的蛋白表达量约为1.5~2.0g/L,约占胞外可溶性总蛋白的16.4%。本试验用自控罐发酵生产含有斜带石斑鱼生长激素基因重组蛋白的毕赤酵母生产工艺,为实现工业化生产鱼类生长激素饵料添加剂奠定基础。     

草鱼Mx蛋白基因的克隆与原核表达

根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物，应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA，回收纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector系统的T载体上。重组子的序列分析表明：所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp，编码240个氨基酸，包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明，草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性，其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高，为87．1％。将此基因改造后定向克隆至原核表达质粒pBV220，构建成重组草鱼Mx蛋白基因表达质粒pBVgcMx，并在大肠杆菌中获得高效表达，重组草鱼Mx蛋白的表达量占菌体总蛋白的26．6％。Q-sephrose FF层析柱分离纯化的重组草鱼Mx蛋白纯度达95．6％。     

转生长激素基因中华倒刺鲃的构建及其检测

用从斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)cDNA文库克隆到的生长激素基因,与鲤β肌蛋白启动子、大麻哈鱼生长激素基因的poly(A)终止信号序列等调控元件共同构建了表达重组质粒pFV2 cfGH。提取重组质粒,用精子载体法导入中华倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)的受精卵中,经孵化培养成转基因成鱼。抽提423尾转基因实验鱼血总DNA,经PCR检测表明:斑点叉尾鮰生长激素基因已导入中华倒刺鲃基因组中,导入率为17.26%。同时通过RT-PCR技术检测阳性中华倒刺鲃中生长激素基因的表达情况。     

关于加快“海上潍纺”建设研究的探讨

建设“海上潍坊”是重大战略选择。作者围绕“海上潍坊”建设的基本估价，加快“海上潍坊”建设的基本条件以及加快“海上潍坊”建设的措施等专题，进行全面的论述。     

PolyI∶C不同途径诱导大菱鲆Mx蛋白基因的转 年际变化趋势及综合评价

以PolyI：C（又称聚肌胞）为诱导剂,分别通过腹腔注射、浸泡和投喂3种途径诱导大菱鲆Scophthalmus maximus体内抗病毒蛋白Mx基因的转录,利用半定量RT-PCR方法检测干扰素下游基因-Mx基因的转录水平来确定该诱导剂的诱导效果。结果显示,以上3种途径都能高效诱导Mx蛋白mRNA的转录,均在48h之后达到高峰,其中以浸泡的方式更容易诱导Mx基因转录,且在120h时仍保持较高水平。Mx基因转录的时相变化证明了国产PolyI：C可以通过多种途径诱导抗病毒蛋白MX的表达,为实际应用中确定用药途径提供了理论依据。另外,实验初步建立了半定量RT—PCR方法,为检测鱼体内干扰素的表达提供了技术方法。