巴西橡胶树乳管细胞HblMYC3互作蛋白筛选与功能分析

MYC是b HLH转录因子家族的亚家族成员,在植物茉莉酸信号转导过程中发挥着重要的调节作用。Hbl MYC3是从巴西橡胶树的乳管细胞中分离鉴定到的MYC类转录因子,其基因表达受割胶和茉莉酸上调。采用酵母双杂交方法初步筛选Hbl MYC3蛋白的互作蛋白,旨在进一步了解Hbl MYC3的功能。结果表明:Hbl MYC1、Hbl MYC2、DNAJ蛋白、谷氧还蛋白2、含A20和AN1锌指结构域的胁迫相关蛋白5、28 ku热和酸稳定的磷蛋白以及25 ku泛素连接酶E2等7种蛋白不同程度地与Hbl MYC3蛋白互作。基于这些互作蛋白的功能,推测Hbl MYC1或Hbl MYC2通过与Hbl MYC3形成二聚体对小橡胶粒子膜蛋白基因表达进行调控,其他蛋白参与胁迫条件下维持二聚体的稳定性和胁迫反应后降解该二聚体。     

巴西橡胶树乳管分化的研究

巴西橡胶树的乳管组织，是决定橡胶产量的是最重要的结构成份。人们一直从两个方面来研究乳管分化，即乳管分化的细胞学和植株内外固子对乳管分化的影响。我们认为，在这些研究中，最值得注意的结果，是采胶对乳管分化的影响。有证据表明，排胶促进乳管分化和原有全部成熟乳管的死亡或去除导致形成密集乳管。据此，我们假定在已有的成熟乳管中存在有抑制将来乳管分化的物质。我们相信，这一假定是深入研究这分化的一个可能的途径。     

巴西橡胶树乳管生物学与胶乳生产

论述了3个限制天然橡胶生产的关键因素,即割胶后排胶持续的时间、两次割胶之间胶乳的再生和乳管从维管形成层的产生。同时说明,对橡胶树自身来说,乳管可能是与机械损伤相联系的一种保护组织,而乳管的形成和功能,能够被包括乙烯和茉莉酸在内的伤害信号高度地调节。     

巴西橡胶树乳管细胞HbSKP1基因克隆及原核表达

SKP1蛋白是茉莉酸信号途径关键环节之一的SCFCOI1复合体的成员,在CUL1和COI1之间起连接作用。本文采用RT-PCR和RACE技术,从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳中克隆了HbSKP1基因。该基因全长778bp,含一个543bp的开放阅读框,编码180个氨基酸。生物信息学分析表明,推导的HbSKP1氨基酸序列含有SKP1家族特征性的Skp1-POZ和Skp1结构域。HbSKP1与蓖麻、毛果杨、拟南芥、油棕、啤酒花、苜蓿的SKP1类蛋白的氨基酸序列同源性分别为64%、61%、47%、47%、47%和47%。原核表达了HbSKP1-His(6)融合蛋白。本研究为进一步鉴定乳管细胞中茉莉酸途径核心环节SCFCOI1复合体打下良好基础。     

橡胶树HbPIP1;1基因的克隆及蛋白的亚细胞定位与多聚化分析

水通道蛋白（aquaporin）是一类广泛存在生物体中高效转运水分子的膜内在蛋白,其在生物膜上以同源或异源四聚体的形式起作用。根据序列相似性及亚细胞定位,植物水通道蛋白可分为PIP （plasma membrane intrinsic protein）、TIP（tonoplast intrinsic protein）、NIP（NOD26-like intrinsic protein）、SIP（small basic intrinsic protein）和XIP（X intrinsic protein）等5大类,其中,PIP定位在细胞膜,是介导细胞间水分跨膜运输的主要通道。橡胶树最早起源于南美亚马逊河流域,是目前天然橡胶的主要商业来源。与其他植物相比,橡胶树除蒸腾耗水外,周期性的割胶活动也会造成水分的大量流失,因此,水分平衡对于橡胶树尤为重要。为揭示橡胶树水分平衡的分子机制,采用RT-PCR技术对1个PIP类水通道蛋白基因HbPIP1;1进行克隆,并在此基础上对其编码蛋白的亚细胞定位和多聚化特征进行分析。结果显示：该基因的编码区长864 bp,预测编码287 aa,其理论分子量为30.80 kDa、等电点8.59、不稳定系数49.27、脂肪族指数22.34、总平均疏水指数为0.639,属于不稳定的疏水型碱性蛋白;蛋白含有水通道蛋白家族特有的MIP（major intrinsic protein）结构域及6个典型的跨膜螺旋,每个螺旋的残基数介于20~23之间。研究构建了基因的亚细胞定位分析载体,并采用农杆菌介导法对烟草叶片进行了瞬时转化。荧光共聚焦显微镜观察显示,HbPIP1;1蛋白定位在细胞膜,与用生物信息学手段预测的结果一致。在烟草叶片中的双分子荧光互补实验显示,HbPIP1;1蛋白自身不能互作,这进一步得到了点对点的酵母双杂交实验的证实。以上结果表明HbPIP1;1蛋白可能通过异源互作的方式参与橡胶树水分的平衡。     

巴西橡胶树乳管肌动蛋白细胞骨架与采胶的关系

以成龄巴西橡胶树为材料，用免疫印迹技术研究了胶乳中的肌动蛋白，并用异硫氰酸四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽荧光探针检查了乳管伤口的肌动蛋白细胞骨架。割胶后收集的胶乳，经超速离心分离的各个组分中，C乳清(胞质溶液)组分含有肌动蛋白。排胶初始期流出的胶乳中肌动蛋白含量多，排胶后期流出的胶乳中肌动蛋白的含量减少。比较了不同割胶强度下收集的胶乳中肌动蛋白的含量，结果表明在强度割胶条件下，胶乳中的肌动蛋白含量较少。用显示肌动蛋白微丝的鬼笔环肽荧光探针检测到，停止排胶时的乳管伤口末端有一团呈现橙红色的荧光物质，表明了肌动蛋白微丝在伤口末端聚积。进行了外施肌动蛋白微丝的解聚剂大环内脂和碘化钾刺激采胶试验，结果表明：施用质量分数1％的碘化钾和饱和浓度的大环内酯水溶液能使胶乳产量增加。这些事实表明，肌动蛋白细胞骨架可能在橡胶树乳管排胶和乳管堵塞中起重要作用。     

巴西橡胶树初生乳管分化与苗生长的关系

利用巴西橡胶树无性系热研７－３３－９７苗圃芽接幼树为材料,采用光学显微镜技术和电子显微镜技术研究了初生乳管分化与茎叶发育的关系。研究结果表明,苗端最初的乳管的分化和原形成束的分化相伴发生,这些乳管出现在原形成束附近,束的近轴一侧。但是当维管形成层形成时,束间形成层在初生乳管的近轴一侧产生,因而随着次生形成层的活动,初生乳管被定位于次生韧皮部远轴一侧。茎和叶中的初生乳管系统和初生维管系统一样连接成一个整体。最初形成的初生乳管是有节连续乳管,随后这些乳管侧壁向各个方向发生侵入生长,互相连接成为一个不规则的立体网状结构。在一个叶蓬生长过程中,茎和叶柄横切面上初生乳管的数目的芽萌动至叶古铜期期间迅速增加,到叶淡绿期增长基本停止。在差不多经历一个生长季的茎部,才产生次生乳管。当次生乳管出现时,初生乳管由于茎的次生加粗而被     

酵母双杂交系统筛选与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻蛋白

RBSDV编码的非结构蛋白P6为该病毒的沉默抑制子。为了研究P6与寄主水稻间的互作关系,首先利用RT-PCR扩增,获得水稻黑条矮缩病毒P6基因,并将其构建到酵母表达载体pGBKT7上,自激活验证表明,P6蛋白无自激活活性。利用酵母双杂交系统顺序转化法从水稻cDNA文库中筛选,获得4个与RBSDVP6互作的寄主因子,分别为水稻内囊体抗坏血酸过氧化物酶、醛糖1差向异构酶、immutans蛋白基因同源蛋白和一个功能未知蛋白。分析了3个已知功能的寄主因子在病毒侵染过程中的可能功能。     

用EST-SSR标记分析巴西橡胶树的遗传多样性

利用19对EST-SSRs引物对41份巴西橡胶树材料(6个野生材料和35个栽培种)进行遗传多样性分析.结果表明:19对引物均获得了预期的扩增结果,得到92个多态性位点,每对引物检测到的等位基因数为2～7个,平均为4.84个.在相似系数为0.64的水平上,野生材料和栽培种区分开来,在相似系数0.75的水平上,又可将栽培种材料分为四个类群;栽培种和野生材料间的遗传距离在0.11～1.16之间,栽培种间遗传距离较小,野生材料间遗传距离相对较大.在栽培种和野生材料之间,遗传距离最大的是AC/T/15/114与PR261(1.16),最小的是保亭155与热研7-20-59(0.11).     

调控橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因转录因子的初步筛选

为研究橡胶树中法尼基焦磷酸合酶基因(Hb FPS)的表达调控机制,采用酵母单杂交技术筛选了胶乳中与Hb FPS启动子结合的蛋白因子。将Hb FPS启动子与报告质粒p HIS2.1连接构建诱饵质粒p His-FPS,经筛选确定抑制背景表达的3-氨基三唑(3-aminotriazole,3-AT)浓度为10 mmol/L。同时以橡胶树胶乳m RNA为模板合成双链c DNA,并将双链c DNA、线性化的p GADT7Rec2载体和诱饵质粒p His-FPS共同转化酵母菌株Y187,两载体共转化效率为1.7×106 cfu/μg。筛选共得到阳性克隆36个,获得31条序列。对获得的c DNA序列进行生物信息学分析,得到2个转录因子序列,分别为类乙烯响应转录因子ERF003和Hb LMYC2。结果为进一步研究Hb FPS表达调控机制奠定基础。     

橡胶树MSAP技术体系的优化与建立

通过对酶切反应最少酶用量及选择性扩增体系的优化,建立了橡胶树MSAP最佳反应体系。研究结果表明,500 ng橡胶树叶片基因组DNA,用EcoRⅠ、HpaⅡ和MspⅠ各0.5 U,在37℃酶切4 h,即可完全酶切。优化的选择性扩增体系为:Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、引物0.15μmol/L、Taq DNA聚合酶1 U;使用该体系,可获得清晰稳定的橡胶树MSAP图谱。     

启动子陷阱技术在橡胶树中的应用研究

启动子陷阱技术是克隆未知基因启动子的有效途径。首先用反向无启动子的GUSA替换pCAMBIA-2301载体上的GUSA及启动子序列,构建橡胶树启动子陷阱载体pCAMBIA2301：GUS-NOS,然后转化橡胶树。结果表明：获得了GUS染色阳性胚状体6个,再生后获得2个转基因株系。其中1个株系在胚状体、叶片和根中能检测到GUS基因的强烈表达,另1个株系仅在根中检测到微弱的GUS基因表达,说明获得的转基因植株为不同启动子启动GUS基因的株系。因此通过橡胶树启动子陷阱载体的构建及其在橡胶树中的表达,能够发现和克隆橡胶树内源基因的启动子。     

橡胶树体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶基因（HbSERK1）的克隆及表达分析

从橡胶树体细胞胚中克隆了一个与体细胞胚胎发生相关的类受体蛋白激酶基因,命名为HbSERK1。HbSERK1长2 159 bp,含有一个1 482 bp的阅读框,编码493个氨基酸。HbSERK1序列与毛果杨、葡萄、胡萝卜、马铃薯、拟南芥和燕麦的体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶同源性分别为91%、90%、88%、88%、87%、86%。生物信息学分析表明,HbSERK1含有一个高度保守的蛋白激酶家族结构域,同时含有ATP结合区、蛋白激酶活化位点和Ser/Thr活性位点。RT-PCR半定量分析表明,HbSERK1在叶、胶乳、雄花、生长在愈伤诱导培养基上30 d和50 d的愈伤组织及生长在胚状体诱导培养基上12 d的胚性愈伤组织中均未表达,而生长在胚状体诱导培养基上21 d和40 d的胚性愈伤组织及成熟体细胞胚中表达。橡胶树HbSERK1基因主要在体细胞胚发生的早期表达,表明其可能参与橡胶树的体细胞胚早期发生过程。     

巴西橡胶树HbHMAD1的克隆及表达

根据已获得的在橡胶树自根幼态无性系与老态无性系胶乳中一个差异表达的片段序列设计引物,通过RACE法获得了橡胶树编码含有重金属相关结构域蛋白的cDNA,命名为HbHMADl.序列分析结果表明,HbHMA D1长为814bp,含有453 bp的阅读框,78bp的5’-UTR和283 bp的Y-UTR,编码150个氨基酸,分子量为16.9 ku,等电点为10.4.HbHMAD1含有重金属相关结构域,与蓖麻(Ricinus communis)、拟南芥(Arabodopsis thesis)(3个)和玉米(Zea mays)中的含有重金属相关结构域蛋白的同源性分别为85％、64％、63％、60％和55％.半定量RT-PCR分析表明HbHMA D1基因在胶乳和树皮中表达,在叶中微量表达,在花中基本不表达.     

酵母双杂交系统筛选与水稻条纹病毒Pc2互作的寄主蛋白基因片段

水稻条纹病毒编码的Pc2蛋白在病毒侵染及宿主症状发生中起作用。研究其与寄主间的分子互作有助于揭示病毒侵染与致病的分子机制。分别将编码Pc2 N端（Pc2-N）与Pc2 C端（Pc2-C）的基因片段克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7上,并构建水稻叶片cDNA文库,然后分别用Pc2-N和Pc2-C为诱饵筛选文库寻找与其互作的寄主因子。结果表明,诱饵载体中插入的Pc2-N和Pc2-C编码框和氨基酸序列均正确。Pc2-N对酵母菌株AH109无毒性和自主激活能力,但Pc2-C对酵母具有细胞毒性。文库滴度为4×107 CFU/mL,且大多数插入片段在500~2 000 bp之间。利用Pc2-N为诱饵筛选水稻cDNA文库,获得有8个候选阳性克隆。经序列测定和BLAST分析结果表明,这些克隆共编码5种蛋白,主要为胁迫相关蛋白与光系统相关蛋白。