鸡肾型传染性支气管炎病毒广东分离株s1基因的序列分析

采用特异性RT-PCR方法,对9株广东传染性支气管炎病毒分离株的s1基因进行序列扩增、测定,应用DNAStar、MEGA4.1等分析软件将这些分离毒株与常用疫苗毒株、国际上其它血清型的代表参考毒株的s1基因序列进行同源性和进化关系分析。研究结果表明:9个分离毒株都属于类4/91分支,与疫苗株H120和Ma5的亲缘关系较远。     

产蛋鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及其遗传变异和血清型分析

[目的]明确产蛋鸡源传染性支气管炎病毒(IBV)分离株(GX-YL170808)的结构基因及抗原变异情况,为广西种鸡场的传染性支气管炎(IB)防控提供科学依据.[方法]通过鸡胚尿囊液血凝试验、鸡胚侏儒化试验及3'端非编码区(3'-UTR)测序对分离株进行鉴定;采用RT-PCR扩增S1、E、M和N基因,以MegAlign和MEGA 6.0分别进行核苷酸序列相似性及系统发育进化树分析,运用RDP4和SimPlot对S1、E、M和N基因进行重组分析,利用NetNGlyc 1.0和NetOGlyc 4.0进行糖基化位点预测分析,并通过中和试验进行血清型鉴定.[结果]分离株的鸡胚尿囊液血凝试验呈阴性,鸡胚盲传5代后出现侏儒胚典型病变,其3'-UTR序列与IBV的3'-UTR序列相似性为99.13%;综合病鸡临床症状及其病理变化可确定该病毒为IBV,命名为GX-YL170808.GX-YL170808分离株S1、E、M和N基因的开放阅读框(ORF)长度分别为1620、327、675和1230 bp,对应编码540、109、225和410个氨基酸残基,与参考株的核苷酸序列相似性分别为60.4%~96.5%、81.8%~97.2%、85.6%~93.5%和85.7%~92.0%;GX-YL170808分离株的S1、M和N基因属于LX4型,而E基因属于LDT3型;4个结构基因内部均无重组区域;除S1基因同时具有N-糖基化和O-糖基化位点外,E、M和N基因均只有N-糖基化位点;S1蛋白裂解位点为HRRRR,与参考株LX4的裂解位点相同.GX-YL170808分离株属于血清4型,不同于常用的疫苗株H120(血清3型)和4/91(血清5型),也不同于广西主要侵害雏鸡的IBV优势血清型.[结论]产蛋鸡源IBV分离株并非疫苗株,其基因型和血清型均已发生变异,且该毒株的血清型不同于广西地区侵害雏鸡的优势血清型,提示了广西地区IB防控的严峻性及新型多价疫苗研发的紧迫性.     

鸡传染性支气管炎病毒Jin13株的分离与鉴定

为了对近年从郑州郊区鸡群中分离到的1株传染性支气管炎病毒(Jin13株)进行定型鉴定,作者采用气管环(TOC)中和试验、血凝抑制(HI)试验、单抗交叉ELISA、序列分析和免疫试验对其进行了研究。气管环(TOC)中和试验和血凝抑制(HI)试验表明Jin13病毒只与M41阳性血清反应,而与其它ND、EDS76、H9AI、IBD标准阳性血清不发生反应,序列分析证实该分离毒Jin13株是IBV。在交叉气管环(TOC)中和试验和交叉血凝抑制(HI)试验中Jin13株与肾变型Y株不交叉(R≤0.25),而与马萨株血清型的M41株和H52株有明显交叉(0.25≤R≤0.8);单抗交叉ELISA结果显示Jin13株与针对M41株的J1单抗有很好的反应(≥640～1 280),而与针对肾变型Y株的单抗C2几乎不反应(≤40),这进一步证实了Jin13与呼吸型M41株、H52株属同一血清型。与M41株相比较,Jin13株S1氨基酸序列在第126,386,390,461位出现了突变,又在S1基因第1 166位出现一个新Aiu I酶切位点,是M41株的一个变异株。对Jin13株纯化后原代毒进行免疫效力检测证实其免疫原性优于M41株和H52株。Jin13毒株是一株免疫原性良好的IBV地方流行毒株。     

传染性支气管炎病毒广西分离株S1基因高变区Ⅰ的序列分析

对7个传染性支气管炎病毒广西分离株的S1基因高变区Ⅰ(HVRⅠ)进行RT-PCR扩增和序列分析,并用DNA star软件将这7个分离毒株与我国常用疫苗毒株、国际上其他血清型的代表参考毒株分别进行核苷酸和氨基酸系统发生进化关系分析。核苷酸与氨基酸序列分析结果表明:7个广西分离毒株可形成2个分支,第1分支与疫苗株H 120、H 52、M a5和参考株M 41、B eaudette的亲缘关系较近,第2分支则与疫苗株H 120、H 52、M a5的亲缘关系较远,但与欧洲分离株4/91的亲缘关系较近。结果提示广西的流行毒株变异较大,实际免疫中要根据流行毒株的特性来生产和选择合适的疫苗株。     

5株传染性支气管炎病毒分离株的鉴定和血清分型

从四川、重庆和广东3个不同地区,不同时间发病的肉鸡中分离出5株病毒．通过鸡胚发育试验、NDV干扰试验、动物回归试验和感染后鸡血清中抗体水平变化确定这5株病毒均为传染性支气管炎病毒．血清中和试验表明,这5株病毒血清型与北京分离的A2株一致,而与H52、H120、M41、T和Holte株不同．该研究结果证实了鸡传染性支气管炎病毒类4／91毒株在我国华南和西南地区的流行．     

上海地区鸡传染性支气管炎病毒流行与疫苗株的血清型比较

从上海地区疑有IB感染的病鸡中,分离出4株冠状病毒其中3株为形态典型的传染性支气管炎病毒（IBV）,1株形态上与IBV差异较大。用鸡胚中和试验将这3株典型的IBV与目前使用的IB疫苗株（H株,M_(41)株）进行血清交叉保护率测定,表明上海地区流行的IBV毒株中,有与疫苗株血清型相近的毒株（R>25％）,也有与疫苗株血清型差异较大的毒株（R<25％）。为上海地区IB防治工作及研制更有针对性的疫苗提供了依据。     

保定地区传染性支气管炎病毒S1基因遗传变异分析

为了解传染性支气管炎病毒S1基因遗传变异情况,用鸡胚传代、血凝特性检测、传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus,IBV)膜蛋白(Membrane,M)基因检测等方法对保定地区鸡群分离的9株病毒进行了鉴定,并对其S1蛋白基因进行了遗传变异分析。结果表明:9株分离毒接种鸡胚尿囊液直接血凝均为阴性,间接血凝和IBV M基因检测均呈阳性。9株IBV分离毒S1蛋白基因编码区长1 608/1 611/1 620 nt,分别编码536/537/540个氨基酸;与27株IBV参考毒株间的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为59.8%～99.3%和49.2%～98.9%。9株分离毒S蛋白裂解位点模式为HRRRR/HRRKR/HRHRR。9株分离毒均属于Ⅰ群中的LX4型IBV,与疫苗毒YX10D90vaccine株亲缘关系较近,与疫苗毒LDT3-A、4/91vaccine、Ark99、J9、Connecticut vaccine、H120株等亲缘关系较远,与疫苗毒Georgia 1998 Vaccine株亲缘关系最远。本研究结果可为传染性支气管炎防控提供有益参考。     

H120活疫苗对部分基因型传染性支气管炎病毒的免疫保护效力

对LH、PZ、CZ-JT和JT等最新分离的传染性支气管炎病毒(IBV)进行S1基因序列分析和基因分型.结果表明:LH株和PZ株均属于QX基因型,但分属2个不同的基因亚群；CZ-JT株属于HN08基因型；JT株则属于CK/CH/LSC/991基因型.用商品化传染性支气管炎活疫苗(H120株)对4个分离株和M41标准强毒株...     

传染性支气管炎病毒上海分离株S1基因克隆及遗传变异分析

对4株最新鸡传染性支气管炎病毒上海分离株的S1基因进行RT-PCR法扩增、克隆和序列测定分析。结果表明所克隆的S1基因全长约为1.63 kb,与常用IBV疫苗株和其它血清型代表株的S1基因序列及推导的氨基酸序列相比较,核苷酸序列同源性为77.4%～82.9%,氨基酸同源性为74.7%～82.6%,为研究上海地区IBV分子流行病学积累了资料。     

鸡传支气管炎病毒分离及S1基因特性研究

应用常规实验室方法对广东地区疑似传染性支气管炎病例进行病原分离鉴定,利用分子生物学技术对分离株S1基因进行克隆与特性鉴定,并与经典株等相应毒株S1高变区氨基酸序列进行相似性比较分析。结果显示,6株病毒分离株均具有明显IBV特征,序列分析证实广东地区存在多种基因型IB流行毒株,主要以LX4血清型为主,与常用疫苗株H52、H120及M4-91亲缘关系较远。     

猪胸膜肺炎放线杆菌山东分离株的血清型与Apx毒素型研究

 从山东省不同地区采集的85份具有严重呼吸道症状病死猪的肺脏、气管和扁桃体进行胸膜肺炎放线杆菌（APP）的分离鉴定，采用凝集试验和PCR方法对分离菌株进行血清型和APX毒素型的检测。结果从山东省不同地区分离到20株分属5个血清型的APP，其中，血清7型6株、血清5型5株、血清3型4株、血清4型3株、血清8型2株，血清7型、5型为优势血清型。不同地区分离的APP血清型不同，同一地区也存在不同的血清型。PCR检测结果表明，不同血清型的 APP共含有4种溶血毒素(Apx)，其中，血清3、4、8型APP含ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ，血清5型含ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅣ，血清7型含ApxⅡ和ApxⅣ，20株APP分离株均含有ApxⅡ和ApxⅣ两种毒素，表明野毒株的血清型与毒素基因的种类有一定的相关性。毒素序列分析结果表明，相同毒素型APP，其毒素基因序列的同源性在99.5％~100％之间，与血清型无关。致病性试验结果表明，所含毒素类型不同的APP对小白鼠的致病性不同，其中含ApxⅠ和ApxⅡ的血清5型APP毒力最强。该研究为猪传染性胸膜肺炎的免疫预防、亚单位疫苗的研制及基于ApxⅣ的PCR检测奠定了基础。     

信鸽新城疫病毒P/Anhui/1/09株囊膜糖蛋白基因的 遗传进化及氨基酸差异性位点分析

为分析流行于信鸽群中新城疫病毒致病株P/Anhui/1/09的分子遗传特性及其囊膜糖蛋白的差异性,采用RT-PCR法扩增其F和HN基因开放阅读框(ORF),并与已公布的主要代表性毒株序列进行遗传进化分析及615个全长F基因和480个全长HN基因推导氨基酸序列比对分析,同时对P/Anhui/1/09株进行型内遗传关系分析。结果显示:P/Anhui/1/09株F和HN基因开放阅读框长度分别为1 662 bp和1 716 bp,GenBank登录号分别为JQ290284和JQ305097,其F基因与NDV05-029、PG/CH/JS/1/06、CH/98-1鸽源毒株亲缘关系最近,同源率在98.2%～99.5%,同属基因VIb亚型,但与传统疫苗株LaSota、V4、B1和Mukteswar的遗传距离较远,同源率仅在84%～86.3%。HN基因ORF进化树分支拓扑结构与F基因相似。型内遗传关系分析显示,VIb亚型可进一步为VIb1～VIb5 5个进化分支,其中我国分离株都位于VIb1和VIb4进化分支中。氨基酸序列比对及糖基化位点分析显示,P/Anhui/1/09的F蛋白裂解位点氨基酸序列为112K-R-Q-K-R-F117,与NDV强毒株分子特征相符,并发现在七肽重复区旁497位新增一个潜在N-糖基化位点,除2个基因III型日本分离株(Miyadera和MIY/51)外,所有含497位新增糖基化位点的毒株都位于VIb1分支。包含P/Anhui/1/09株在内的大部分鸽源毒株在F蛋白aa132S(融合肽区)、aa259H和HN蛋白aa3H(胞质区)、aa122R、aa347G、aa349E存在一定特征性。     

2010—2013年我国鸡传染性支气管炎病毒分离株S1基因分子特性分析

为掌握近年来我国传染性支气管炎病毒的流行动态和变化规律,利用检测转化至克隆载体鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列,应用MEGA5分析软件进行聚类分析,并对瑞普生物疫病诊断研究服务中心2010—2013年间从我国野外分离并测定的30株传染性支气管炎的S1基因序列与常用疫苗毒株和GenBank中代表性IBV毒株的对应基因序列进行比较,结果发现:1)30株野外分离株可分为2个基因型:LX4型和TW型,分别占总数的93.3%和6.7%;2)LX4型分离株S1基因和氨基酸序列与常见疫苗毒株序列差别很大,同源性仅分别为77.6%~86.3%和75.8%~85.7%;3)分析S基因裂解位点时发现同一基因型毒株的裂解位点氨基酸序列高度趋同,且型间差异性较大。可见,近年来我国主要IBV分离株属于LX4型,并且彼此间亲缘关系较近,与我国现用传染性支气管炎主要弱毒疫苗和国外参考株属于不同的基因型,这可能是导致疫苗免疫失败,传染性支气管炎(IB)在鸡群中爆发的主要原因。该研究结果为筛选针对我国目前流行IBV毒株的疫苗株提供参考。     

副猪嗜血杆菌的分离与鉴定及其16S rRNA 生物信息学分析

从湖南省内送检的疑似患多发性浆膜炎与关节炎的猪病料中分离到12株细菌,细菌学试验证明12株细菌均符合副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)形态、培养和生化特性.根据HPS 16S rRNA序列设计引物对12株细菌进行PCR扩增,均得到预期目的条带,将扩增片段测序并运用DNAStar软件与GenBank中不同血清型HPS基因序列进行比对,表明其与Genbank中已公布的不同血清型HPS菌株16S rRNA序列的同源性为90.4%~99.9%,其中与血清5型同源性最高,对所测序列与参考序列进行遗传进化树分析,结果表明其中11株属于血清5型HPS.     

猪链球菌及其血清型的PCR检测

从广东省部分地区猪场采集疑似猪链球菌病病猪的扁桃体棉拭病料202份,用PCR方法检测棉拭样本培养物中猪链球菌（Streptococcussuis）及其主要致病血清型（1、2、7和9型）．检出阳性样品147份,检出率为72．8％．其中检出S．suis血清2型21份,检出率为12．9％;检出血清9型6份,检出率为3．0％;未检出血清7型和1型．此外,不同地区和不同发育阶段的猪,S．suis检出率和各血清型检出情况也存在较大差异．从而证实广东地区猪群中广泛存在S．suis呈地域性流行,并且是多种血清型共存．     

临床分离鸡源性大肠杆菌外膜蛋白型的研究

[目的]了解禽致病性大肠杆菌分离株的遗传相关性。[方法]对分离自保定、秦皇岛和北京3个地区规模化养鸡场的病死鸡体内的38株大肠杆菌,采用超声波裂解和N-十二烷基肌胺酸钠进行外膜蛋白(Omp)提取,利用SDS-PAGE进行Omp分型。[结果]38株大肠杆菌共有3个Omp型,其中Omp-1型为O78、O88、O2、O18、O93、O766个血清型分离株所共有,Omp-Ⅱ型多为O76血清型分离株,Omp-Ⅲ型为O93、O78、O88、O2分离株所共有。这表明同一血清型的菌株可能属于完全不同的Omp型,而血清学上毫不相关的分离株之间却可具有相同的Omp型。[结论]该研究证实了同一血清型的分离株之间可发生遗传分化,而不同血清型的分离株之间也可具有不同程度的遗传相关性。     

快生型大豆根瘤菌血清学特性的研究

以自新疆、黑龙江、辽宁、吉林、湖北、天津和北京等地分离的16株快生型大豆根瘤菌为供试菌,用交叉凝集反应比较研究了它们与目前国内外已报道的9株快生型大豆根瘤菌标准血清型菌株之间的血清学关系,研究结果表明：（1）菌株J711,NJ16、NJ111和A212均属O#-1（2048）血清型。（2）菌株RT15、Two-7和93F41与供试标准血清型菌株的菌体抗原均不相同,命名为O#-9、O#-10和O#-（11）3种新的血清型。菌株6-1为自凝菌株,其血清型为O#-0。（3）交叉抗原吸收试验结果表明,菌株92X10、C333、RT10和2056同属O#-5血清型,并可进一步区分为O#-（5ab）、O#-（5bcd）、O#-（5def）和O#-（5fg）4个血清亚型。菌株HA10-1-3、HA12-1-12和2120分属O#-6血清型的O#-（6ab）、O#-（6bcd）和O#-（6de）3个血清亚型。（4）将2048等6个标准菌株重新命名为O#-1,O#-2,O#-3,O#-4,O#-7和O#-8血清型。     

间接免疫荧光染色空斑计数技术的建立及应用

以间接免疫荧光抗体技术（ＩＦＡ）为基础，并加以改进，建立了间接免疫荧光染色空斑计数技术（ＰＣＴＩＩＦＳ），用其检测鸡马立克氏病（ＭＤ）二价疫苗，可快速准确地计数疫苗中不同血清型病毒各自的空斑形成单位（ＰＦＵ）及其ＰＦＵ总数。克服了常规法不能计数二价苗中两种病毒各自空斑数的缺点，敏感性显著高于常规病毒空斑计数法。     

大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium ddjaponicum）的血清型研究

以自东北地区分离的8株大豆慢生根瘤菌为供试菌用交叉凝集反应比较了它们与目前国内外已报道 的15株大豆慢生根瘤菌标准血清型菌株之间的血清学关系。研究结果表明：（1）菌株93H10F5和HJ15不与供试标准血清型菌株发生交叉凝集瓜在，分别命名为O14和O15血清型，（2）菌株HJ19、HJ28、93F42与标准血甭型菌株USDA94有交叉凝集反应，进一步的抗原吸收试验结果表明：HJ19和HJ28的抗原组成完全相同，命名为O3bxl血清亚型；USDA94仅与HJ19有交叉反应，命名为O３ab血清亚型，９３Ｆ４２也与ＨＪ１９有部分共同抗原，命名为Ｏ３de血清亚型。（３）菌株９３ＨＡ８与标准血清型菌株USDA135有部分共同抗原，分别命名为O12bc和O12ab血清亚型，（4）标准菌株USDA127、USDA129与USDA123有交叉凝集反应，抗原吸收试验分别将其细分为O12bc和O12ab血甭亚型。（4）标准菌株USDA127、USDA129与USDA123有交叉凝集反应，抗原吸收试验分别将其细分为O10ab。O10de和O10xxl等3个血清亚型。（5）将USDA的10个标准菌株重新命名为O1，O2，O4，O5，O6，O7，O8，O9，O11和O13血清型。