湖南省4株猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组序列测定与分析

为了解湖南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况,对湖南省2016—2019年分离的4株PRRSV(Hunan/2016/075、Hunan/2017/085、Hunan/2018/123、Hunan/2019/055)进行全基因组测序,对其ORF5、NSP2基因以及全基因组核苷酸序列进行分析。结果显示,分离的4株病毒株均为美洲型,全基因组同源性为83.1%～98.7%,其中3株属于高致病型,1株为属于类NADC30型。Hunan/2016/075、Hunan/2017/085毒株全长序列与谱系5中亚系5.1的代表性毒株BJ-4亲缘关系相近,聚为一簇;Hunan/2018/123毒株与谱系8.7中的tjnh1501毒株聚为一簇;Hunan/2019/055毒株独立成一簇,与谱系1亲缘关系相近。本研究掌握了湖南省PRRSV的遗传变异情况,从而为制定有效的防控策略提供了依据。     

一例类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的诊断及防控

2021年12月初,河北望都县某猪场出现疑似猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）疫情,主要表现为繁殖母猪流产、仔猪高热和呼吸困难等。为确定发病原因,对病死仔猪进行剖检,发现仔猪全身淋巴结肿大、肺脏肿大充血等,采集病猪肺脏、淋巴结和扁桃体等组织样品进行实验室诊断。结果发现,送检的2份样品均为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性,但其它病原核酸均为阴性。以RT-PCR法对该毒株ORF5基因部分序列进行扩增与分析,发现该毒株与类NADC30毒株对应序列同源性较其它基因型PRRSV毒株同源性更高。以上结果提示,该场暴发PRRS是类NADC30毒株感染所致,可采取疫苗接种和提高生物安全防控水平等方式对该病进行科学防控。     

两株类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称为"猪蓝耳病",是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的猪传染性疾病。本研究将采集到的2份疑似患有PRRS的流产胎儿的肺组织研磨后离心,取上清液接种猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)盲传3代。通过RT-PCR方法和间接免疫荧光方法,对组织样品及细胞培养物进行了鉴定和分型。结果显示本研究成功从2份样品中分离到了类NADC30,且该毒株可以在PAM细胞上增殖。该研究结果为研究类NADC30毒株的重组机制、致病情况及研制预防疫苗提供参考。     

一株重组类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及基因组分析

为分离上海地区猪繁殖与呼吸综征病毒（PRRSV）并分析其分子遗传进化关系,对来自该地区某猪场疑似PRRSV感染病猪的2份肺样进行RT-PCR检测,阳性样品接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs),将盲传3代后出现细胞病变的PAMs经间接免疫荧光鉴定,通过RT-PCR扩增分离株全基因组序列,测序后与GenBank登录的参考株全基因组序列进行同源性及遗传进化分析,分析了分离株Nsp2、GP5氨基酸序列的遗传进化关系,并对分离株做了重组分析和细胞嗜性试验。结果显示,成功分离出1株PRRSV,命名为SH2019,其全基因组开放阅读框大小为14677 bp,分离株与NADC30的核苷酸同源性最高,属于目前流行于中国的类NADC30 PRRSV,其Nsp2存在131个氨基酸缺失的分子特征;分离株是以谱系1毒株为主要亲本,以谱系3、谱系5或谱系8毒株为次要亲本,在12601~12901 nt(ORF2~ORF4)发生了基因重组的重组毒株,分离株不能感染Marc-145细胞。本研究分离鉴定一株重组类NADC30 PRRSV,可为该地区猪繁殖与呼吸综合征的防控提供参考。     

猪繁殖与呼吸综合征 病毒类NADC30毒株的新近流行

猪繁殖与呼吸综合征是严重危害养猪生产的病毒性传染病.自20世纪90年代中期在我国发生和流行以来,已经20余载.据田间流行优势毒株的不同,可大致分为三个阶段:经典毒株流行阶段(1995—2006年)、 高致病性变异株流行阶段(2006—2013年)和新近的类NADC30毒株流行阶段(2013年至今).2013—2014年间与美国分离株NADC30亲缘性较高的一类PRRSV毒株开始在我国暴发流行,其具有与NADC30和MN184等谱系1(lineage 1)毒株相同的nsp2编码区缺失模式.致病性分析及疫苗保护试验结果表明,其致病性介于高致病性毒株与经典株之间,目前商用疫苗对其保护效果不佳.且类NADC30毒株易与其他PRRSV毒株发生重组,产生新的变异株.类NADC30毒株的广泛流行,以及相关重组毒株的叠现,进一步增加了PRRS疫病防控的难度.     

2016-2017年我国华北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株分子遗传演化分析

为了解我国华北地区类NADC30流行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及遗传变异情况,本研究自2016~2017年采集华北四省市(北京、天津、山东及河北)部分猪场疑似PRRSV样品239份进行RT-PCR检测,对所有阳性样品的ORF5基因测序分析及部分阳性样品病毒分离,并选择1株基因缺失病毒TJjh1602株进行全基因的序列扩增及分析.结果显示:PRRSV检测总阳性率44.35%(106/239),遗传进化显示52.83%(56/106)的流行毒株与类NADC30相近且位于系谱1(lineage 1),其中32.14%(18/56)的类NADC30流行毒株具有相同特征性的氨基酸位点缺失;TJjh1602株全基因长度为15018 nt,与NADC30同源性为95.2%,除具有上述特征性氨基酸位点缺失外,无其他插入或缺失.研究结果推测PRRSV类NADC30毒株在我国华北地区广泛流行,同时已遗传演化成一类具有ORF5缺失分子标签的新型类NADC30毒株,提示需进一步加强对PRRSV新型缺失毒株的流行病学调查及相关致病力研究.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30株感染的诊断与防控策略

2019年10月初,福建闽南地区某猪场出现疑似猪繁殖与呼吸综合征疫情,主要表现为25日龄断乳仔猪出现发热、采食量下降、扎堆、毛长、喘气等现象。为确定发病原因,将随机采集的血清样品165份送至国内某重点实验室进行猪瘟抗体、猪繁殖与呼吸综合征抗体和猪伪狂犬病野毒抗体检测,采集4份肺等病料对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒进行PCR检测,PCR产物送上海某公司进行基因测序。结果发现,送检的165份样品中,猪伪狂犬病gE抗体阳性率为0%、g B抗体阳性率为96.19%(101/105),猪瘟抗体阳性率为84.24%(139/165),猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性率为92.73%(153/165);病原学检测结果显示,未检出猪瘟病毒、伪狂犬病病毒,但猪繁殖与呼吸综合征病毒的检出率达100%;测序结果表明,4个样品的PCR产物序列均与NADC30毒株的同源性高达92%～93%。结果提示,该场暴发PRRS是类NADC30毒株感染所致,可采取与类NADC30毒株同源性高的疫苗接种和提高生物安全防控水平等方式对该病进行科学防控。     

一株针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株GP5蛋白的单克隆抗体的制备及鉴定

为获得针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株GP5蛋白的单克隆抗体,采用表达纯化的PRRSV NADC30-like毒株的GP5蛋白按常规方法免疫小鼠,采用间接免疫荧光方法筛选出1株阳性杂交瘤细胞（命名为3E10）,经3次亚克隆后制备腹水并进行纯化鉴定。结果显示：该杂交瘤细胞连续传代20代后细胞上清液的IFA效价仍不低于1:40。纯化后的单克隆抗体腹水浓度为0.204 mg/mL,亚类鉴定为IgM,且未发现有中和活性。特异性检测显示3E10单克隆抗体能与2株PRRSV NADC30-like毒株发生荧光反应,而与4株高致病性PRRSV疫苗毒株、2株经典株PRRSV疫苗毒株以及CSFV、PCV2、BVDV及Marc-145细胞均无荧光反应,显示出较好的应用前景。     

8株猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异分析

本研究拟初步了解中原地区近期猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况。对2011—2012年间从河南及周边省份发病猪场分离的8株PRRSV毒株Nsp2基因变异区进行RT-PCR扩增,同时对主要结构蛋白GP5基因进行克隆测序并与GenBank中登录的中国历年来流行的PRRSV代表毒株的GP5蛋白序列进行遗传进化分析,对主要氨基酸基序进行比对分析。结果表明,2011—2012年在中原地区分离的8株PRRSV分离株均为Nsp2缺失变异株,GP5基因与2006年中国高致病PRRSV代表毒株JXA1同源性较高。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株NSP2基因的序列分析

为了分析河北省流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) NSP2基因的变异情况,试验对2009年采自秦唐部分地区和廊坊地区的临床发病猪肺组织提取RNA,通过RT - PCR扩增样本中PRRSV的NSP2全序列,并对其进行生物信息学分析,应用DNAStar软件将其与VR -2332、CH - la、MLV、BJ -4、...     

1株NADC30-like重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及遗传变异分析

为研究山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行病毒株的遗传变异情况,本研究从山东省威海市某疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场采集的猪肺脏组织中分离到1株PRRSV,命名为SDwh,并对其进行了全基因组序列测定、遗传演化分析和重组分析.结果显示:该病毒株在Marc-145细胞上生长良好,可见明显细胞病变;全基因组演化分析和同源性比对分析结果显示,SDwh株与美国病毒株NADC30和中国的NADC30-like位于同一分支;与北美病毒株NADC30的同源性最高,为93.1%;与我国分离的NADC30-like病毒株CHsx1401、JL580的同源性分别为91.1%和88.4%;与北美经典病毒株VR2332、中国HP-PRRSV JXA1和HuN4的同源性均为85.3%;与欧洲型病毒株Lelystad-virus(LV)同源性最低,为60.6%.与VR2332相比,Nsp2氨基酸序列比对结果显示,SDwh株存在NADC30-like病毒株典型的131个不连续氨基酸的缺失,同时在584~585位缺失2个氨基酸;GP5氨基酸序列比对结果显示,SDwh在GP5抗原表位上有氨基酸的突变.全基因组重组分析结果显示,SDwh株是一株重组病毒株,为NADC30与JXA1-P80的重组病毒,潜在的重组位点位于Nsp2中(2066 nt).本研究结果为PRRSV流行株的重组、演化分析和防控提供借鉴意义.     

猪繁殖和呼吸综合征病毒GP3蛋白糖基化位点突变株的构建及其生物学特性分析

为研究猪繁殖与呼吸系统综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）GP3蛋白糖基化位点的作用,在弱毒疫苗株HuN4-F112感染性克隆的基础上,采用点突变的方法对GP3蛋白N29、N42、N50、N131位进行单点或多点组合突变去糖基化,构建了不同糖基化位点的单点和多点突变的PRRSV全长cDNA克隆,最终成功救获N29Q、N42Q、N50Q、N131Q、N29Q/N50Q、N29Q/N195Q六株含糖基化位点突变的病毒,而其余几种糖基化位点突变组合的全长cDNA未能拯救出病毒。对拯救毒株进行滴度测定及多步生长曲线绘制等特性分析,结果显示N29Q、N42Q、N50Q、N131Q位单个糖基化位点的缺失虽不影响子代病毒的产生但会不同程度地降低PRRSV感染细胞的能力,其中N50Q突变体较亲本下降6个滴度且生长明显延迟。多个糖基化位点同时缺失则会影响病毒的拯救,推测这些糖基化位点可能是产生具有感染性病毒粒子所不可或缺的。     

逆转录过程对猪繁殖与呼吸综合征病毒定量检测的影响

为探讨逆转录过程对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)定量检测的影响,本研究针对PRRSV保守性序列设计引物,优化反应体系及反应条件,建立准确检测PRRSV的数字PCR方法,并选择5种不同逆转录试剂盒,分析逆转录过程对数字PCR检测结果的影响。结果表明,建立的数字PCR方法线性关系良好(R^2为0.9995及0.9999),重复性良好(变异系数1.01%);利用不同逆转录试剂盒得到的定量结果存在显著性差异,揭示逆转录过程是影响RNA病毒定量检测的关键因素,提示实验过程中不同逆转录试剂盒的选用需要考察与分析。     

潍坊市猪繁殖与呼吸综合征的流行病学调查

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的传染病,主要引起妊振母猪的流产、死产、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病。本次调查采用RT-PCR对山东省潍坊市7个县20家猪场的送检样品进行PRRSV检测。结果显示,7个县猪场均检出PRRSV阳性,阳性检出率为35%~82%,平均阳性率为67.9%。流行病学调查结果表明,PRRSV感染已在潍坊市猪群中普遍存在,PRRS已成为危害当地养猪业的重要疫病。但各县市之间PRRSV感染率差异较大,在拥有较多小规模猪场的县市阳性率较高;不同日龄猪之间PRRSV感染率及死亡率差异较大,30~60日龄最高;不同品种猪群对该病毒的易感性和感染阳性率差别不大。     

2007-2010年江苏地区猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测及部分Nsp2基因序列分析

本研究参考GenBank已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp2基因序列,在高致病性病毒Nsp2基因缺失区的两端保守区设计并合成了一对引物,建立并优化了能够区分经典PRRSV和高致病性PRRSV的RT-PCR诊断方法,并利用该方法对2007～2010年间江苏地区的45份可疑临床病料进行了检测。结果表明临床病料阳性率为40％,所有毒株均属于高致病性毒株。对PRRSV阳性病毒的Nsp2基因序列分析表明,所有18株PRRSV均属于美洲型毒株,与中国高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1的氨基酸同源性分别在82．2％～97．6％、80．4％～95.3％。此外,18株病毒的Nsp2共同存在不连续的30个氨基酸缺失,缺失位置与同期中国高致病性PRRSV具有相同的特征。通过本研究掌握了江苏地区2007～2010年间PRRSV流行情况及Nsp2基因变异特征,为地方猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断和防治提供参考依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒强/弱毒感染PAM细胞生物学特性比较分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)强、弱毒株在PAM细胞上的增殖特性,本研究在体外分离培养了健康猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM),然后分别用高致病性PRRSV强毒HuN4株和弱毒疫苗HuN4-F112株感染PAM细胞,细胞病变观察和间接免疫荧光检测结果显示,二者在体外均可以感染PAM细胞,其中强毒HuN4株感染PAM细胞CPE较为明显。在两个毒株感染PAM细胞后12、24、36、48、60h分别收获病毒感染的细胞,利用抗PRRSV N蛋白单抗进行Western blot分析检测病毒核蛋白在不同时间表达量的变化,结果表明,强毒株在感染PAM细胞的早期,N蛋白合成表达量明显高于弱毒疫苗株,而弱毒疫苗株在感染Macr-145细胞早期,N蛋白的合成量则明显优于强毒株。比较HuN4株与HuN4-F112株在PAM细胞和Marc-145细胞的生长曲线,结果显示强、弱毒在PAM细胞和Marc-145细胞生长趋势存在明显差异,其中强毒HuN4株在PAM细胞上增殖能力明显强于弱毒株,而弱毒HuN4-F112株在Marc-145细胞上的增殖能力明显强于其在PAM细胞上的增殖能力,表明PRRSV强毒株对靶细胞PAM的感染能力较强,弱毒疫苗株对其感染能力相对较弱。本研究为深入了解PRRSV强毒株与弱毒疫苗株的致病性差异提供了理论依据。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒基因缺失标记疫苗ELISA鉴别诊断方法的建立

为了配合（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）基因标记疫苗株（rHN4-Δ25＋NP49株）的临床抗体鉴别诊断应用,本研究以标记疫苗中缺失的25个氨基酸多肽作为包被抗原,通过对ELISA反应条件的优化,确定抗原最适包被浓度为500 ng/孔,血清最佳稀释度为1：40,同时确定其阴阳性临界值S/P判定标准为0.15,批内和批间重复实验结果显示其变异系数均低于10%,表明该方法具有良好的重复性。对临床血清检测结果显示与IDEXX试剂盒检测结果的符合率为94.84%,采用25 aa负标记ELISA方法检测HuN4-F112免疫猪血清,结果显示从免疫后21 d可检测25 aa特异性抗体,该抗体至少可持续存在126 d。本研究建立的ELISA检测方法为今后PRRSV基因工程标记弱毒疫苗株在临床鉴别诊断的应用提供了有利保障。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒膜蛋白和核衣壳蛋白基因序列分析

猪繁殖和呼吸综合征病毒弱毒疫苗株基质膜蛋白和核衣壳蛋白基因克隆于ｐＢＶ２２０载体,然后将ＭＮ基因亚克隆于ｐＳＫ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐＴⅡＳＫ＾＋）载体,构建成重组质粒ＰＢＳＭＮ进行序列测定,共测得９５８ｂｐ,Ｍ和Ｎ基因分别位于ＯＲＦ６和ＯＲＦ７。