弓形虫和新孢子虫交叉反应抗原MIC7A对小鼠的免疫保护效力分析

弓形虫和新孢子虫是两种亲缘关系接近的顶复亚门原虫,二者之间存在一定程度的交叉免疫保护作用,这种作用可能是基于交叉反应抗原产生的。本研究旨在表达并鉴定弓形虫和新孢子虫的交叉反应抗原TgMIC17A,通过将其应用于小鼠的免疫保护试验,评估该抗原对弓形虫和新孢子虫感染产生的交叉免疫保护作用。对TgMIC17A进行基因克隆和原核表达,通过免疫印迹试验鉴定其反应原性和交叉反应性。重组蛋白免疫小鼠后测定血清特异性IgG抗体水平,评价其免疫原性。二免后,分别用1×10³个弓形虫Pru速殖子、1.5×10⁷个新孢子虫Nc1速殖子攻虫,对小鼠的体重变化、存活率进行监测,并在攻虫30 d后检测各组存活小鼠的脑荷虫量,评价TgMIC17A重组蛋白免疫小鼠后对弓形虫和新孢子虫的交叉免疫保护效果。结果显示,rTgMIC17A可以被弓形虫和新孢子虫的阳性血清识别,相较于未免疫组小鼠,免疫组小鼠体内可产生高水平特异性IgG抗体(P＜0.01),且感染弓形虫或新孢子虫的脑荷虫量均显著降低(P＜0.01)。本研究克隆并表达了TgMIC17A,鉴定其为新孢子虫和弓形虫的交叉反应抗原。该抗原可以刺激小鼠产生较好的体液免疫反应,并对弓形虫和新孢子虫的感染产生一定的交叉免疫保护作用,可以为弓形虫和新孢子虫共感染的防治,以及筛选具有交叉免疫保护力的重组疫苗提供可借鉴的研究资料。     

屠宰场犬新孢子虫和弓形虫的感染情况调查

<正>犬新孢子虫和弓形虫是呈世界性分布的重要寄生虫^[1]。犬是犬新孢子虫的主要终末宿主,可以排泄出对环境有抵抗力的卵囊。犬新孢子虫是导致牛流产的重要原因^[2-3]。弓形虫病属人兽共患病,由于犬与人及猫的关系密切,因此犬弓形虫病的感染情况可以反映当地弓形虫病的流行特点。犬可以通过吞食被弓形虫卵囊污染的泥土,或采食含弓形虫包囊的生肉而感染弓形虫。犬还可以经机械传播途径将弓形虫卵囊传染给人类^[4]。     

新孢子虫与弓形虫交叉抗原AMA1基因重组腺病毒的构建及免疫应答分析

为构建新孢子虫和弓形虫AMA1基因重组腺病毒,并分析其免疫原性,本试验根据新孢子虫和弓形虫AMA1基因序列的开放阅读框,设计新孢子虫和弓形虫交叉抗原AMA1基因通用引物,构建重组克隆质粒pMD18T-NcAMA1、pMD18T-TgAMA1及重组腺病毒穿梭质粒ADV4-Nc/TgAMA1,将ADV4-Nc/TgAMA1和骨架质粒pacAd5线性化后共转染293T细胞,包装Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒,测定病毒滴度后,收集病毒液接种BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清IgG抗体水平。结果显示,Nc/TgAMA1在Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒中获得表达,测定Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒滴度为10⁹PFU/mL,接种BALB/c小鼠后,Ad5-Nc/TgAMA1接种组IgG抗体水平明显高于pVAX1-Nc/TgAMA1质粒组和PBS对照组。结果表明,构建的Ad5-Nc/TgAMA1重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。本试验为新孢子虫和弓形虫交叉抗原AMA1基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础。     

弓形虫蛋白质二硫键异构酶的免疫保护作用

为了探讨皮下免疫弓形虫蛋白质二硫键异构酶(TgPDI)对弓形虫急性感染的保护作用,本试验通过原核表达获取了重组TgPDI,将纯化并去除内毒素的重组蛋白皮下免疫昆明小鼠,利用ELISA方法监控抗体水平变化,通过实时荧光定量PCR检测感染小鼠的组织载虫量并记录小鼠存活时间,评价TgPDI的免疫保护作用。结果显示,免疫重组TgPDI可以有效刺激小鼠产生抗体(1∶16 000);免疫该蛋白可以极显著抑制弓形虫感染小鼠血液、肝脏、脾脏和脑组织中的弓形虫增殖(P0.01),并能延长小鼠感染后的存活时间。结果表明,皮下免疫重组TgPDI可以刺激小鼠产生保护性免疫应答,TgPDI是预防弓形虫感染的免疫候选分子。     

宿主抗新孢子虫感染的免疫机制研究进展

新孢子虫病是一种危害世界养牛业的重要动物原虫病,其病原为顶复门寄生原虫新孢子虫,主要造成牛、羊等反刍动物的流产。目前缺少可以用来预防或治疗新孢子虫病的疫苗和药物,究其原因,主要是由于对新孢子虫致病机制的认识有限。研究表明,新孢子虫感染导致流产的机制与母胎界面的炎症以及感染刺激宿主细胞介导的免疫反应有关。先天免疫反应中的模式识别受体在识别新孢子虫感染中起着关键作用,并进一步激活下游的多种级联信号通路;适应性免疫中的Th1型细胞免疫在抗新孢子虫入侵以及清除新孢子虫中也发挥着至关重要的作用。论文主要综述模式识别受体、先天免疫途径以及细胞免疫等在宿主抵抗新孢子虫感染中的研究进展,以期为后续新孢子虫致病机制的深入研究及防控措施的开发提供参考。     

北京地区犬猫弓形虫和新孢子虫感染的检测与分析

了解犬、猫弓形虫和新孢子虫感染情况,应用SPA-ELISA和ICT对2008-2011年间收集的北京地区137份流浪猫、186份宠物猫和763份宠物犬及其他部分省市的57份乡村犬进行血清抗体检测;同时,提取猫及部分犬的血样DNA,分别扩增弓形虫和新孢子虫特异性基因片段。结果显示,流浪猫和宠物猫弓形虫抗体阳性率分别为24.1%(33/137)和13.4%(25/186),宠物犬和乡村犬分别为14.5%(111/763)和24.6%(14/57),不同来源的犬或猫抗体阳性率差异显著(P0.05);流浪猫和宠物猫的新孢子虫抗体阳性率分别为7.30%(10/137)和6.45%(12/186),宠物犬和乡村犬分别为6.06%(8/132)和10.5%(6/57),差异均不显著(P0.05)。宠物猫和流浪猫基因检测的阳性率分别为3.65%和2.15%,差异不显著(χ2=0.22,P0.05);132份宠物犬和29份乡村犬基因检测阳性率分别为18.2%和6.90%,差异显著(P0.05)。血液中虫体特异性基因检出率低于血清抗体检出率。宠物犬和宠物猫弓形虫和新孢子虫感染随着年龄增加呈上升趋势,但各年龄段差异不显著(P0.05)。     

细胞因子在犬新孢子虫感染中的作用

犬新孢子虫是一种专一性细胞内寄生虫，它的感染导致了宿主Th细胞的分化。一方面，刺激宿主产生Th1型细胞因子反应，这些细胞因子包括IL-12、IFN-7和INF-α。Th1型细胞因子反应同时还激活了产生氧自由基（FOR）、一氧化氮（NO）及其代谢物，这些细胞因子对犬新孢子虫均具有致命的杀伤力。另一方面，引发宿主产生IL-4、IL-5和IL-10等Th2型细胞因子，Th2型细胞因子主要在宿主妊娠过程中发挥作用。     

新孢子虫急性感染对小鼠器官中TLR3表达的影响

为了研究新孢子虫急性感染对小鼠体内不同器官中Toll样受体3(TLR3)表达的影响,试验将培养、纯化的新孢子虫Nc-1株速殖子通过腹腔注射途径感染5周龄C57BL/6小鼠(8×106个速殖子/只),感染后第2天和第8天分别采集小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和脑,通过荧光定量PCR和免疫组织化学方法,分别从mRNA和蛋白质水平检测各器官中TLR3的表达量。结果表明:感染组小鼠脾脏和肺脏中TLR3 mRNA的相对表达量较对照组显著或极显著升高(P0. 05或P0. 01),其中脾脏中第2天和第8天TLR3 mRNA的相对表达量为对照组的6倍或9倍,肺脏中TLR3 mRNA的相对表达量约为对照组的4倍;肝脏和心脏中TLR3 mRNA的相对表达量约为对照组的2倍,但差异均不显著(P0. 05),脑中TLR3 mRNA的相对表达量未见明显变化。免疫组织化学结果与荧光定量PCR结果基本一致。说明新孢子虫急性感染可上调小鼠多个器官中TLR3的表达。     

雏鸡隐孢子虫感染对新城疫免疫的影响

隐孢子虫寄生于多种动物,常引起宿主腹泻和呼吸困难等临床症状。目前,国内外已有不少关于本病的报道,但罕见隐孢子虫对宿主免疫影响的研究。为探索隐孢子虫感染与雏鸡新城疫疫苗免疫效果的关系,我们对感染隐孢子虫的病雏进行新城疫疫苗接种后,再作新城疫人工发病试验。结果,隐孢     

实验室小鼠自然感染弓形虫报道

弓形虫(Toxoplasma gondii)1908年发现,至今已有数十年的历史。其间已发现的中间宿主仅哺乳类就达200余种。其中猫、狗感染较为严重。鼠群以野生啮齿类普遍,实验室小鼠已不常见,剖腹产和屏障饲养群已近绝迹。     

鱼精蛋白对大肠杆菌急性感染小鼠的保护作用研究

为探究鱼精蛋白(PP)对大肠杆菌(E. coli)急性感染小鼠的保护作用,本研究将20只小鼠随机分为2组,每组10只,PP组皮下注射PP 100μg/0.2 mL/只,对照组皮下注射等体积生理盐水,7 d后采用致病性E. coli攻菌,观察小鼠的发病和死亡情况;同时,将16只小鼠随机分为2组,每组8只,按照上述方法皮下注射PP后攻菌,分别于攻菌12 h,24 h采集眼眶血,迫杀后无菌采集部分小鼠肝脏、脾脏,采用活菌计数法检测攻菌后小鼠外周血、脾脏、肝脏中的细菌载量,利用试管定量显色基质法检测小鼠外周血脂多糖(LPS)含量,利用动物生化分析仪进行血液生化检测;采用qRT-PCR方法检测攻菌后48 h小鼠脾脏中IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、TLR4、NF-κB、IRF3、IRF7等炎症相关因子的mRNA转录水平。结果显示,与对照组比较,PP能极显著提高攻菌小鼠的存活率(p0.01);亚剂量攻菌后,PP能极显著降低小鼠外周血、脾脏、肝脏中的细菌载量,极显著降低小鼠外周血中LPS含量以及血清谷丙转氨酶(ALT)含量(p0.01)。同时,PP能显著降低攻菌所致的与LPS-TLR4通路相关的细胞因子(TLR4、NF-κB、IL-1β、IL-6、IRF7、IFN-β)mRNA转录水平(p0.05)。以上结果表明PP注射后7 d可对E. coli急性感染小鼠提供较好的保护作用,这可能与PP通过增强机体对细菌清除能力,从而有效控制E. coli感染后的病程发展有关。本研究为PP临床防治E. coli急性感染的应用潜力探究提供了实验依据。     

硒化修饰太子参多糖对免疫损伤小鼠的免疫保护作用

取220只小鼠随机分为11组,即健康对照组、给药组(9个组)和环磷酰胺(CY)模型组,每组20只。其中,给药组的9个组中,硒化太子参多糖2(sRPP2)、硒化太子参多糖3(sRPP3)和太子参多糖(RPP)各按质量浓度1,2,3g/L分别设3个组。健康对照组和环磷酰胺(CY)模型组皮下注射生理盐水,持续14d。给药组皮下注射给药,连续14d。15d开始,除了健康对照组,9个给药组和环磷酰胺(CY)模型组腹腔注射环磷酰胺,连续注射3d,分别测定免疫器官指数、免疫球蛋白IgM和IgG的含量、巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α和IL-6含量、免疫细胞吞噬指数。结果显示:sRPP2、sRPP3、RPP各项指标都高于环磷酰胺组(P<0.05)。结果表明:硒化修饰能增强太子参多糖对免疫损伤小鼠的免疫保护作用,sRPP3的作用最好。     

犬新孢子虫Nc-GFP株对BALB/c小鼠的人工感染试验

为了解犬新孢子虫Nc-GFP株的生物学特性,本试验采用Vero细胞培养的犬新孢子虫速殖子,腹腔接种BALB/c小鼠,观察小鼠的临床症状及发病情况,脱颈处死濒死期小鼠,无菌分离小鼠脑组织,接种Vero细胞进行连续培养,并提取脑组织DNA进行NcMAG1基因的PCR鉴定。结果显示:BALB/c小鼠接种犬新孢子虫Nc-GFP株速殖子后,先后出现被毛逆立、共济失调等临床症状;小鼠脑组织接种Vero细胞14 d后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光的犬新孢子虫Nc-GFP株速殖子和包囊;小鼠脑组织经NcMAG1基因的PCR检测,扩增出1 047 bp的目的基因条带,经测序与GenBank中发表的NcMAG1(EF580924.1)核苷酸序列的同源性为99.6%。本试验成功地从BALB/c小鼠脑组织中分离出了犬新孢子虫Nc-GFP株,为Nc-GFP株生物学特性的深入研究奠定了基础。     

犬新孢子虫和刚地弓形虫超微结构的比较

使用透射电镜，对从犬获得的三株犬新孢子虫分离株的感染培养细胞的速殖子超微结构进行检查。三个分离株的超微结构相似，速殖子具有一个表膜、２２个表膜下微管、一个类椎体，前后均有极环，８—１２个电子致密对式细胞器、大量微丝、一个单在泡状核、管状线粒体、高尔基复合体、核糖体、内质网、一个无活性的微孔、电子致密体、脂质体和技链淀粉体。大多数速殖子寄生在靠近宿主细胞核寄生性空泡中，它含有大量内空泡管。速殖子以内出芽形式分裂。没有观察到犬新孢子虫组织包囊。犬新孢子虫和刚地弓形虫的速殖子可根据对式细胞器的结构和数量、微丝和电子致密体的数量和位置予以区别。     

犊牛先天性新孢子虫感染

２个奶牛场发生胎儿新孢子虫感染和流产后，又成功地复配４头母牛，并均妊娠，产下５头足月犊牛。用间接荧光抗体试验测得哺乳前犊牛血清抗新孢子虫ＩｇＧ抗体效价为５１２０～２０４８０。其母牛血清和初乳的抗体效价则为３２０～１２８０。２头犊牛发生轻度的神经分支缺损，３头犊牛有轻度的非化脓性脑脊髓炎，３头犊牛的中枢神经系统中发现新孢子虫。结果证实，母牛可经胎传播新孢子虫；有胎儿感染新孢子虫或流产史的母牛，可能产     

犬新孢子虫和刚地弓形虫超微结构的比较

使用透射电镜，对从犬获得的三株犬新孢子虫分离株的感染培养细胞的速殖子超微结构进行检查，三个分离株的超微结构相似，速殖子具有一个表膜、２２个表膜下微管、一个类椎体、前后均有极环、８－１２个电子致对式细胞器、大量微丝，一个在泡状核，管状线粒体，高尔基复合体，核糖体、内质网，一个无活性的微孔、电子致密体，脂质体和技链淀粉体。大多数速殖子寄生在靠近宿主细胞核寄生性空泡中，它含有大量内空泡管，速殖子以内出芽     

新孢子虫NcSRS2和NcSAG1重组蛋白免疫小鼠诱导的免疫应答

为了研究新孢子虫NcSRS2和NcSAG1重组蛋白对动物的免疫效果,利用重组表达的NcSRS2和NcSAG1蛋白与弗氏佐剂混匀后免疫BALB/c小鼠,检测小鼠抗新孢子虫抗体水平和血清中IL-4和IFN-γ含量。结果表明,免疫后的BALB/c小鼠IgG、IgG2a和IFN-γ抗体表达水平升高,IgG1抗体和IL-4表达水平也升高,表明NcSRS2和NcSAG1重组蛋白可激发机体产生Th1型和Th2型免疫反应,且NcSRS2重组蛋白的免疫增强效果与NcSAG1重组蛋白免疫组的差异具有显著统计学意义(P0.05)。本研究结果为研制高效安全的抗新孢子虫的新型疫苗提供了参考。     

新孢子虫GRA6表达、定位及对小鼠免疫效力的初步分析

顶复亚门原虫在其侵入宿主细胞及其纳虫空泡的形成过程中,有多种蛋白质发挥着重要的作用,其中致密颗粒蛋白在纳虫空泡的形成和修饰过程中起着至关重要的作用。作者从新孢子虫基因组中扩增致密颗粒蛋白GRA6基因,构建原核表达质粒pGEX-NcGRA6,表达、纯化蛋白质,制备鼠源多抗,利用IFA对NcGRA6进行细胞内定位,显示其定位于纳虫空泡的网状系统。构建真核表达质粒pcDNA-GRA6,分别用真核质粒和重组蛋白质免疫BALB/c小鼠,给三免后小鼠腹腔接种2×106新孢子虫速殖子,观察小鼠临床变化。每次免疫前,采血检测抗体水平;攻虫后第30天,处死小鼠,利用RT-PCR检测小鼠脑内荷虫量,结果显示真核表达质粒和纯化蛋白免疫后均对小鼠提供了较好的免疫保护,与未免疫的对照组小鼠相比差异显著(P0.05)。