猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒3/4/5型双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪博卡病毒(PBoV)3/4/5型的双重PCR方法,本研究根据Gen Bank中登录的PEDV ORF1基因序列和PBoV不同基因型VP1序列,设计2对特异性引物,通过对PCR扩增条件的优化,建立了能够同时检测PEDV和PBoV3/4/5型双重PCR方法,特异性检测结果显示该方法对猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、猪链球菌核酸扩增均为阴性;敏感性检测结果显示,对PEDV和PBoV3/4/5型重组质粒标准品的最低检出量分别为837拷贝/μL和1 000拷贝/μL;临床样品的检测结果显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出PEDV和PBoV3/4/5型混合感染及单独感染。本研究建立的双重PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效检测PEDV和PBoV提供了技术帮助。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒与非典型瘟病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立同时快速简便地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与非典型瘟病毒(APPV)两种病毒的方法,本研究根据GenBank中登录的PRRSV、APPV的基因序列,选取PRRSV的ORF2基因和APPV的NS2基因分别设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了能够同时检测PRRSV与APPV的双重RT-PCR方法。利用该方法对PRRSV、APPV重组质粒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒的cDNA和阴性对照进行检测,结果显示除PRRSV和APPV重组质粒扩增结果为阳性外,其余均为阴性,表明其特异性良好;该方法对APPV和PRRSV质粒标准品的最低检出量分别为2.17×10~4拷贝/μL、3.13×10~3拷贝/μL,敏感性较高;同时批间和批内重复性试验表明该方法重复性好。利用该方法对四川地区临床73份疑似仔猪颤抖病与猪繁殖与呼吸综合征病的病料样品进行检测,结果与单一RT-PCR的检测符合率为100%。本研究建立的双重RT-PCR方法具有良好的实用性,可用于临床样品的检测,对临床早期诊断具有重要意义。     

羊口疮病毒和丝状支原体簇双重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种同时快速检测羊口疮病毒(ORFV)和丝状支原体簇(Mm cluster)的方法,本研究根据ORFV的B2L基因和Mm cluster的16S r RNA基因序列,设计合成了2对特异性引物,通过条件优化,建立了同时检测ORFV核酸和Mm cluster核酸的双重PCR方法。该方法可以同时扩增出ORFV和Mm cluster的特异性片段,而对其它常见病原的DNA模板均无扩增,对ORFV和Mm cluster的最低检出量分别为3.8×10~4拷贝/μL和1.3×10~3拷贝/μL。利用该方法对36份临床样品进行检测,结果显示双重PCR检测结果与单一PCR检测结果符合率为100%。本研究建立的双重PCR方法特异性强,敏感性高,可重复性好,为临床ORFV和Mm cluster的快速检测、诊断及流行病学调查提供了方法。     

猪圆环病毒2型和3型双重PCR检测方法的建立

猪圆环病毒3型(PCV3)是一种新的猪圆环病毒,与猪皮炎和肾病综合征、母猪繁殖障碍及心脏和多系统炎症相关。为了建立一种同时快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)和PCV3的双重PCR方法,根据GenBank收录的PCV2和PCV3基因序列,分别在PCV2 Cap基因和PCV3 Rep基因高度同源保守区设计并筛选2对特异性引物,经过双重PCR反应条件的优化,建立了同时检测PCV2/3的双重PCR检测方法。本方法可同时扩增出PCV2、PCV3的486,270bp特异性片段,而扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)等病原核酸结果均为阴性;PCV2/3最低检出量分别为139,21.7拷贝/μL。经临床应用表明,本试验建立的双重PCR方法简便、快速,敏感度高,特异性强,为PCV2/3的鉴别诊断和联合检测提供了依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪肺炎支原体双重荧光PCR检测方法的建立

为了建立快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪肺炎支原体(Mhp)的双重荧光PCR检测方法，本试验根据NCBI数据库中的PRRSV ORF7和Mhp P36基因，分别设计引物和TaqMan探针，通过优化扩增反应条件，建立PRRSV和Mhp的双重荧光PCR检测方法；分析所建立PCR方法的特异性、敏感性和重复性，并初步应用于临床样品检测。结果显示，25μL PCR反应体系中各引物最佳添加量：PRRSV-F 1.5μL、PRRSV-R 1.0μL、PRRSV-P 0.8μL、Mhp-F 1.2μL、Mhp-R 1.3μL、Mhp-P 0.7μL。优化后的PCR反应程序：50℃反转录20 min, 95℃预变性2 min, 95℃变性5 s, 55℃退火10 s, 72℃延伸20 s (此处收集荧光),40个循环。建立的双重荧光PCR方法特异性较好，与其他猪常见病原体无交叉反应；检测PRRSV和Mhp的敏感性分别为4.2拷贝/μL和9.6拷贝/μL;批内和批间变异系数均不高于2%,具有很好的重复性。因此，本试验建立的双重荧光PCR方法可同时检测PRRSV和Mhp,为猪繁殖与呼吸综合征...     

食源性动物组织中CSFV和PRRSV双重双色荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检检测食源性动物组织中猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病病毒(PRRSV)的双色荧光定量RT-PCR方法。本研究根据SCFV和PRRSV基因序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应的体系和扩增条件,建立了能够检测食源性动物组织中SCFV和PRRSV的双重双色荧光定量PCR的方法。其检测下限为1×102拷贝/μL,而且与其他一些猪病病毒无交叉反应,具有良好的特异性。该方法重复性和稳定性试验表明其组内和组间的变异系数最高分别为4.2和4.5。对比试验表明,该方法对CSFV和PRRSV检验的敏感性为常规RT-PCR方法的200倍;该方法的建立为食源性动物组织中CSFV和PRRSV提供了有效手段,该方法特异性和敏感性较好,能够应用于临床检测。     

鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体双重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的双重PCR诊断方法,该研究根据GenBank中登录的MG gapA基因序列和MS heat shock ATP-dependent protease基因序列,设计2对特异性引物,通过对PCR扩增条件的优化,建立了能够同时检测MG和MS的双重PCR诊断方法。特异性检测结果显示,该方法能够扩增出729 bp的MG和309 bp的MS特异性片段,对禽巴氏杆菌、大肠杆菌、鸡白痢沙门菌、副鸡禽杆菌核酸扩增均为阴性;敏感性检测结果显示,对MG和MS DNA的最低检出量均为5×10^-2 ng/μL;临床样品的检测结果显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出MG、MS混合感染和单独感染。该研究建立的鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体双重PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效检测MG和MS提供了技术支持。     

水禽圆环病毒双重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测并区分鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)和鹅圆环病毒(Goose circovirus,GoCV)的方法,根据DuCV和GoCV基因组的保守区域设计两对特异性引物,预期特异性扩增DuCV和GoCV片段大小分别为192 bp、556 bp。经过反应条件的优化,建立了DuCV和GoCV的双重PCR检测方法。特异性检验表明该方法无法扩增其他水禽病原;DuCV和GoCV的最低检出限分别为10~4拷贝/μL和10~5拷贝/μL。临床样品检测结果显示,DuCV阳性率为8.01%,GoCV阳性率为1.6%,与常规PCR方法完全一致。结果表明,建立的双重PCR方法可以用于水禽圆环病毒检测和流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流行性腹泻病毒双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立快速、简便且能同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的方法,试验根据GenBank中已登录的PRRSV ORF7基因序列和PEDV N基因序列,设计2对特异性引物和2条TaqMan探针,通过优化扩增条件建立检测PRRSV和PEDV的双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,同时还进行了特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品检测。结果表明:最终确立的20μL扩增体系中各引物和探针的加样量分别为:PRRSV-F 0.8μL,PRRSV-R 0.6μL,PRRSV-P 0.5μL;PEDV-F 1.2μL,PEDV-R 1.0μL,PEDV-P 0.7μL。(优化后的最佳扩增程序为:50℃反转录6 min;95℃预变性1 min;95℃变性10 s,55℃退火10 s,72℃延伸10 s,共40个循环)。检测PRRSV和PEDV的敏感性可分别达到1.05 TCID_(50)/100μL和3.16 TCID_(50)/100μL,该方法特异性好,不与其他常见猪病病原体发生交叉反应,批内变异系数和批间变异系数均不高于2.0%。用该方法对234份临床样品进行检测,PRRSV阳性样品15份, PEDV阳性样品20份,检出率高于常规RT-PCR方法。说明试验建立的双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法敏感性高,特异性好,可同时准确、快速检测PRRSV和PEDV。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测PRRSV方法的建立

根据编码PRRSV M蛋白的基因序列设计用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增的引物,通过温度梯度法优化反应体系;以不同科属常见猪致病性RNA病毒疫苗验证该检测方法的特异性,参考国内PRRSV分子流行病学特征,选择基因型代表性的2株疫苗株验证该检测方法的稳定性;以10倍梯度稀释的质粒为标准品扩增并构建标准曲线,探究该检测方法的灵敏度,随机挑取10份保存的PRRSV阳性病料和10份阴性病料同时使用农业部推荐的PRRSV RT-PCR检疫标准方法和建立的方法进行检测,以确定2种方法检测的符合率。结果显示,使用建立的方法可以在54.4℃80min内完成对PRRSV的检测,该检测方法具有特异性和稳定性;检测灵敏度为6.8×10拷贝/μL;以Ct值为横坐标,扩增序列拷贝浓度的对数值为纵坐标,得到标准曲线,方程为y=-3.411 x+39.002,R2=0.999;对随机挑取的10份PRRSV阳性病料和10份阴性病料进行检测,结果2种方法检测结果的符合率100%。结果表明,成功建立了PRRSV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR快速检测方法,为临床提供了一种很好的检测手段。     

猪繁殖与呼吸综合征3种毒株多重PCR检测方法的建立

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列设计2对特异性引物,第1对通用引物扩增美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因(466bp/376bp),第2对引物特异性扩增欧洲型毒株ORF7基因(580bp)。反应条件优化后,建立了能够同时检测美洲型经典毒株、美洲型变异毒株和欧洲型毒株的多重PCR检测方法。该方法可以特异性扩增3种毒株的基因,目的基因片段大小差异在90bp以上便于电泳观察,重组质粒标准品检测下限为1.93×103拷贝。应用该方法检测183份临床疑似病例,结果 PRRSV阳性35份,其中美洲型经典株2份,美洲型变异株31份,欧洲型毒株3份,美洲型变异株和欧洲型毒株混合感染1份。表明建立的多重PCR检测方法具有快速、准确、敏感等优点,对PRRSV 3种毒株的快速诊断有十分重要的意义。     

猪博卡病毒1/2型NS1基因与3/4/5型VP1基因的双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测不同基因型猪博卡病毒(PBo V)的PCR方法,本研究参考Gen Bank中登录的5种基因型PBo V1、PBo V2、PBo V3、PBo V4及PBo V5,设计了2对引物,通过对扩增条件进行优化,建立了PBo V1/2和PBo V3/4/5的双重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法可以同时扩增PBo V样品327 bp(PBo V1/2)和209 bp(PBo V3/4/5)的特异性片段,而对猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒等其他病原核酸扩增均为阴性。敏感性试验显示,该PCR方法对PBo V1/2和PBo V3/4/5的最低检出量分别为100拷贝/μL和1 000拷贝/μL。重复性试验显示该双重PCR检测方法具有良好的可重复性。应用该方法和单项PCR对30份临床样品进行检测,结果显示,同时感染PBo V1/2和PBo V3/4/5的阳性率为10%,并且两种方法符合率为100%。本研究建立的方法适合对PBo V1/2和PBo V3/4/5的联合检测。     

猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。     

鉴别猪伪狂犬病病毒的双重PCR方法的建立及初步应用

为了检测猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的感染情况,并进行强弱毒株的鉴别诊断,本研究建立了快速、简便、灵敏度高、特异性强的鉴别猪PRV的双重PCR方法。针对PRVgE和gB基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对退火温度(50~60℃,按照1℃递增)、引物浓度(0.2~1.4μL,依次增加0.2μL)的优化,结果表明,双重PCR反应的最佳退火温度为56℃、最适引物添加量为1μL。特异性试验结果表明,该方法可以扩增出PRVgE(316bp)和gB(432bp)的目的片段,对PCV2、PTV、CSFV、PPV、PRRSV、大肠杆菌的DNA或cDNA均无扩增。敏感性试验结果表明,PRVgE和gB的最低核酸检出量分别为4.4×10³和3.3×10³拷贝/μL,与单一PCR方法的敏感性相近。应用该方法对广东、广西地区临床送检的56份组织样品进行检测,检测结果显示,强毒感染阳性率为53.6%(30/56),阴性率为46.4%(26/56),未发现有弱毒感染。     

猪细小病毒7型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪细小病毒7型(PPV7)的快速定量检测方法,本研究根据PPV7(KU563733.1)基因序列设计一对特异性引物,扩增155 bp的PPV7衣壳蛋白基因,构建重组质粒pClon007-PPV7,以其作为标准品建立了PPV7的SYBR GteenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在5.00×10~9拷贝/μL~5.00×10~3拷贝/μL范围内呈良好的线性关系。该方法对猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病毒、乙脑病毒、口蹄疫病毒常见病原的检测均无特异性扩增,仅PPV7出现特异性扩增;该方法检测灵敏度可达5.00×10~1拷贝/μL;批内和批间变异系数均低于1%,具有较高的重复性和稳定性。对临床样品的检测结果显示,所建立的荧光定量PCR阳性检测率为71.88%,比普通PCR法检测的阳性率提高了约4.55%。该研究方法的建立为PPV7提供了一种新的快速定量检测技术。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,采用RT-PCR扩增PRRSV N基因266bp片段,并克隆到pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,建立了PRRSV荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.3×101拷贝/μL,与猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪日本脑炎病毒(JEV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明,建立的PRRSV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征病毒病(PRRS)的诊断。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。     

鉴别猪流行性腹泻病毒野毒株与疫苗株双重RT-PCR检测方法的建立

为建立鉴别猪流行性腹泻病毒野毒株与疫苗株的检测方法,本研究根据GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)M、ORF3基因序列,设计合成了2对特异性引物,通过PCR扩增条件的优化,建立了鉴别PEDV野毒株和疫苗株的双重RT-PCR检测方法。特异性试验显示,该检测方法对猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、Salmonella及E.coli等结果均为阴性;敏感性试验显示,所建立的双重PCR检测方法对M基因和ORF3基因的最低有效检测量分别为44.5拷贝/μL和481拷贝/μL。本研究建立的双重RT-PCR检测方法可实现对PEDV野毒和疫苗毒的快速检测,适合于现地猪流行性腹泻的鉴别诊断。     

猪圆环病毒2型和3型双重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速且同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和3型(PCV3)的方法,本研究根据GenBank中PCV2和PCV3的全基因组序列,设计了两对特异性引物,通过对扩增条件的优化,建立了能够同时检测PCV2和PCV3的双重PCR方法。该方法可以同时扩增PCV2的266 bp和PCV3的594 bp特异性片段,而对猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的基因组扩增结果均为阴性。对PCV2和PCV3的最低检出量均为100拷贝/μL。对广西境内100份健康屠宰猪淋巴结样品检测结果显示,单一PCR与双重PCR检测符合率为100%。结果表明,本研究建立了一种简便快捷、反应灵敏、稳定可靠且特异性强的双重PCR技术,为临床样品中PCV2和PCV3的快速检测提供了有效的技术支持。