视黄酸诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究

体外胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)向生殖细胞分化可用于治疗不育症,同时也为揭示种系世代的分子机制提供最佳模型。试验旨在探讨视黄酸(retinoic acid,RA)诱导鸡胚胎干细胞(chicken embryonic stem cells,cESCs)向雄性生殖细胞(male germ cells,MGCs)分化的作用效果。利用胰蛋白酶消化法从新鲜种蛋X期鸡胚中分离胚胎干细胞,以鸡胚成纤维(chicken embryo fibroblast,CEF)细胞为滋养层,进行体外培养,利用形态法、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色和胚胎阶段特异性表面抗原(embryo specific surface antigen 1,SSEA-1)检测对获得的胚胎干细胞进行鉴定。结果表明,获得典型的呈巢状或岛状的cESCs克隆,细胞AKP染色呈蓝紫色,表明其具有较高的内源性AKP活性;SSEA-1鉴定结果呈阳性,显示cESCs克隆具有多能性。采用10~(-5) mol/L RA诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化,镜下观察细胞形态变化,分别于诱导第0、2、4、6、8、10天提取细胞总RNA,反转录成cDNA,用于实时荧光定量PCR检测生殖细胞标志基因的表达。结果表明,在此诱导过程中,作为胚胎干细胞标志基因Nanog、Sox2表达量持续显著下降,而生殖细胞特异性基因Dazl、Stra8、c-kit、integrinα6表达量呈持续上升趋势;免疫细胞化学检测可观察到特异基因相关蛋白的阳性克隆。本研究成功分离出cESCs,可体外培养并保持未分化状态及多能性。10~(-5) mol/L RA能够促进cESCs向雄性生殖细胞方向分化,可以引起生殖细胞相应基因的表达,为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供参考。     

视黄酸诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究

体外胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）向生殖细胞分化可用于治疗不育症,同时也为揭示种系世代的分子机制提供最佳模型。试验旨在探讨视黄酸（retinoic acid,RA）诱导鸡胚胎干细胞（chicken embryonic stem cells,cESCs）向雄性生殖细胞（male germ cells,MGCs）分化的作用效果。利用胰蛋白酶消化法从新鲜种蛋X期鸡胚中分离胚胎干细胞,以鸡胚成纤维（chicken embryo fibroblast,CEF）细胞为滋养层,进行体外培养,利用形态法、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）染色和胚胎阶段特异性表面抗原（embryo specific surface antigen 1,SSEA-1）检测对获得的胚胎干细胞进行鉴定。结果表明,获得典型的呈巢状或岛状的cESCs克隆,细胞AKP染色呈蓝紫色,表明其具有较高的内源性AKP活性;SSEA-1鉴定结果呈阳性,显示cESCs克隆具有多能性。采用10^-5 mol/L RA诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化,镜下观察细胞形态变化,分别于诱导第0、2、4、6、8、10天提取细胞总RNA,反转录成cDNA,用于实时荧光定量PCR检测生殖细胞标志基因的表达。结果表明,在此诱导过程中,作为胚胎干细胞标志基因Nanog、Sox2表达量持续显著下降,而生殖细胞特异性基因Dazl、Stra8、c-kit、integrin α6表达量呈持续上升趋势;免疫细胞化学检测可观察到特异基因相关蛋白的阳性克隆。本研究成功分离出cESCs,可体外培养并保持未分化状态及多能性。10^-5 mol/L RA能够促进cESCs向雄性生殖细胞方向分化,可以引起生殖细胞相应基因的表达,为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供参考。     

鸡胚精原细胞体外转染EGFP方法的比较

以增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）为报告基因体外转染鸡胚胎精原细胞（Chicken embryonic spermatogonial cells,CESCs）,比较磷酸钙、脂质体（梭华-Sofast）、电穿孔3种方法转染EGFP的效率,以获得高效的体外转染方法。本研究分离孵化16d的鸡胚睾丸,获取CESCs,体外培养和传代扩增,传至第2代后进行碱性磷酸酶（AKP）活性和阶段特异性表面抗原-1（Stage specific embryonic antigen-1,SSEA-1）免疫荧光鉴定。运用磷酸钙、脂质体（梭华-Sofast）、电穿孔3种方法体外转染第2代CESCs,荧光细胞计数法分析转染效率。结果表明：与磷酸钙法、脂质体法相比,电穿孔法可获得更高的细胞成活率和转染率（68％ vs 39％、65％,19．70％ vs 2．92％、9．73％）,差异显著（P〈0．05）。因此得出,电穿孔法是将外源基因导入鸡胚精原细胞的适宜方法。     

鸡体细胞诱导重编程早期的糖代谢变化研究

为研究鸡体细胞诱导重编程早期的糖代谢方式的变化,试验采用OCT4、SOX2、NANOG和LIN28A(OSNL)四因子诱导体系将鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF)重编程为诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS),并利用碱性磷酸酶染色、阶段特异性胚胎抗原1(Stage-specific embyronic antigen-1,SSEA-1)免疫荧光染色、体外诱导分化及多能性基因表达检测等对iPS进行鉴定。通过检测重编程过程中糖代谢相关基因表达及酶活性的变化,并对葡萄糖摄取量、乳酸产生量及线粒体膜电位检测等研究鸡体细胞诱导重编程早期的糖代谢变化。结果显示,鸡CEF诱导重编程形成的iPS呈碱性磷酸酶染色阳性,表达SSEA-1蛋白,体外分化形成类胚体且表达多能性标记基因。同时重编程过程中氧化磷酸化基因表达下调而糖酵解相关基因表达上调,糖酵解关键酶活性均增强,且iPS的葡萄糖吸收量及乳酸产生量增加,而线粒体膜电位则下降。结果表明,OSNL四因子体系将鸡CEF诱导重编程形成iPS的过程中,细胞的主要糖代谢方式从氧化磷酸化转变为糖酵解,而糖酵解的激活可能会进一步促进iPS的形成。     

小鼠胚胎干细胞裂解液诱导鸡胚成纤维细胞发生重编程的研究

本研究采用小鼠胚胎干细胞(ESCs)裂解液与鸡胚成纤维细胞共孵育,通过形态学观察和多能性检测,旨在探讨小鼠ESCs裂解液逆转化鸡胚成纤维细胞为多能干细胞的可行性。结果表明:与小鼠ESCs裂解液共孵育的鸡胚成纤维细胞均变为圆形细胞,形成了42.33个细胞集落;经AKP染色以及Oct-4和SSEA-1免疫细胞化学染色,均呈阳性反应,表现出一定的多能干细胞特性;经核型分析表明这些细胞来源于鸡胚成纤维细胞。单独的重编程操作过程和与鸡胚成纤维细胞裂解液共孵育均无法将鸡胚成纤维细胞重编程为具有ESCs特征的细胞,说明参与重编程鸡胚成纤维细胞的物质来源于小鼠ESCs裂解液。因此,ESCs裂解液诱导体细胞重编程逆转化为多能干细胞的作用能够在小鼠和鸡之间发生。     

鸡胚胎干细胞的离体培养与鉴定

为探讨鸡胚胎干细胞的培养条件及鉴定方法,本试验以鸡胚成纤维细胞为饲养层,以高糖DMEM为基础培养基并添加SCF、bFGF、mLIF等抑制分化的细胞因子,离体培养鸡x期胚盘细胞。结果显示,该培养体系可以获得典型的呈集落状生长的细胞克隆,传至第4代仍可检测到胚胎干细胞的特定表面抗原SSEA-1;细胞克隆经悬滴——悬浮培养可形成拟胚体,并检测到中、内、外3个胚层的特异性基因CH-T、TTR、和β-activin的表达。结果表明,本试验培养出具有多分化潜能的鸡胚胎干细胞。     

动物胚胎干细胞及其研究进展

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES）是指从桑椹胚或附植前囊胚内细胞团分离的多潜能细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。下面介绍几种常见的动物胚胎干细胞及它们的新近研究进展。     

坝上长尾鸡原始生殖细胞的分离、培养与鉴定

为了研究坝上长尾鸡的原始生殖细胞(primordial germ cell,PGCs),试验分别从孵化至13~15期的坝上长尾鸡鸡胚血液和5.5 d的鸡胚生殖嵴中分离得到PGCs,接种于24孔培养板,以鸡胚成纤维细胞(CEF)为饲养层,添加细胞因子的培养体系,在温度37℃、95%空气和5%CO2培养箱中进行体外培养和传代,借助组织化学及免疫组织化学方法进行染色,并采用PAS(高碘酸希夫氏染色)、AKP(碱性磷酸酶染色)以及SSEA-1等方法进行鉴定。结果表明:PGCs集落有典型的鸟巢状结构,且PAS、AKP以及SSEA-1染色呈阳性。     

从原始生殖细胞分离克隆绵羊胚胎干细胞

为了研究绵羊胚胎干细胞在体外培养过程中的生长行为,试验采用30～45日龄的绵羊胎儿生殖嵴及其周围组织共培养的方式分离克隆胚胎干细胞。结果表明:在不添加任何细胞生长因子的情况下,也能分离克隆到具ES细胞诸多特征的胚胎生殖细胞系,即具有连续传代能力、细胞集落有典型鸟巢状结构、AKP染色阳性等。说明该细胞具有多能性,类似ES细胞。     

鸡胚胎干细胞分离培养和单细胞克隆的制备

从鸡第X期胚胎中分离胚盘,以鸡成纤维细胞为饲养层,用添加了10%的胎牛血清、2％的鸡血清、2mmol／L L-谷氨酰胺、1mmol／L丙酮酸钠、5．5×10^-5mmol／L β-巯基乙醇、10μL／mL非必需氨基酸、以及含1000U／mL LIF、10ng／mL bFGF和5ng／mL SCF的高糖DMEM对细胞进行培养和传代。利用鸡第X期的胚胎干细胞,采用口吸管法、细胞稀释法和克隆环法3种方法,制备单细胞克隆,采用细胞化学法和免疫荧光法检测细胞表面标志物。结果显示,可获得传至5～6代的鸡胚胎干细胞。通过对传代培养后的鸡ES细胞进行AKP染色鉴定和SSEA-1的鉴定,证实细胞未发生分化,具有胚胎干细胞的特征。通过不同分离胚盘方法和不同消化时间的比较得出药勺法提取胚盘简单易行,原代消化5～8min的ES细胞适合于传代培养。口吸管法、细胞稀释法和克隆环法单细胞克隆形成率分别为0、4.2％和1．0％。经AKP活性和SSEA-1免疫荧光鉴定均呈阳性,扩增出的克隆能稳定增殖不分化。结果表明,细胞稀释法操作简单易行,试验时间短,对细胞伤害小,为鸡ES单细胞克隆进一步建系提供了可行的方法。     

蒙古绵羊原始生殖细胞(PGCs)的分离培养与鉴定

本试验从绵羊胎儿的生殖嵴中分离出原始生殖细胞,经体外培养后进行了初步鉴定。为建立绵羊原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的培养体系,试验对比了不同培养条件对蒙古绵羊PGCs生长的影响,将得到的胚胎生殖细胞(EG细胞)作形态学、酶学和免疫荧光鉴定。结果表明:绵羊EG细胞集落隆起,边缘整齐,呈鸟巢状,细胞排列紧密;AKP染色为弱阳性;免疫荧光检测特异标志物Oct3/4呈弱阳性,SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-61、TRA-1-80呈强阳性。     

糖原合成激酶抑制剂在胚胎干细胞自我更新中的作用

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)是从早期囊胚内细胞团分离培养出来的能够不断维持自我更新和具有发育多能性的细胞。Wnt信号通路在维持胚胎干细胞的自我更新方面起着重要作用,糖原合成激酶 (glycogen synthase kinase-3,GSK-3)抑制剂可以激活Wnt信号通路,促进胚胎干细胞自我更新和增强细胞间连接。作者就GSK-3抑制剂在胚胎干细胞自我更新、细胞连接方面的作用及其作用机制进行简单综述。     

鸡胚胎干细胞及其应用研究进展

鸡胚胎干细胞是一种多能性干细胞,从X期胚盘分离胚盘细胞或早期鸡胚的生殖嵴分离原始生殖细胞,经体外长期抑制分化培养可得到鸡胚胎干细胞。为维持细胞在培养过程中的未分化状态,需要采用饲养层细胞培养,同时设计合理的培养液配方并添加多种抑制分化或促进增殖的细胞因子。通过碱性磷酸酶活性检测、胚胎表面特异性抗原检测、分化试验及嵌合体试验等方法,可对鸡胚胎干细胞进行准确鉴定。文章主要就鸡胚胎干细胞的分离、培养与鉴定方法的研究进展及其应用前景进行简要综述,为进一步发展更高效的鸡胚胎干细胞培养体系并应用于生产实践提供一定的借鉴。     

昆明系小鼠胚胎干细胞分离培养的优化

以昆明系小鼠为对象,经过丝裂霉C处理成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)制备饲养层,对影响小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)分离培养的相关因素进行研究。分别收集小鼠3.5d的囊胚(扩张囊胚)和4.5d囊胚(孵化囊胚)进行培养,比较扩张囊胚和孵化囊胚的贴壁率、原代克隆率及传代率的情况。收集3.5d胚龄的囊胚,通过全胚法和免疫外科法对内细胞团(Inner cell mass,ICM)进行分离培养ICM集落,确定离散ICM的适宜时间。用0.25%胰酶+0.04%EDTA,0.125%胰酶+0.02%EDTA和0.25%胰酶+1%小鸡血清等方法对小鼠ES细胞集落进行传代,观察不同酶浓度对ES细胞分离克隆的影响。结果显示,孵化囊胚的贴壁率高于扩张囊胚(P0.05),但传代率则相反(P0.05),原代克隆率差异不显著(P0.05);一般ICM增殖培养2～3d(免疫外科法)或4～5d(全胚培养法)后,出现典型的克隆集落,再挑取ICM;0.125%胰酶+0.02%EDTA及0.25%胰酶+1%小鸡血清,形成ES原代克隆率较高,2组没有显著性差异(P0.05);结果表明,分离得到的ES细胞经形态学观察,AKP染色,体外分化试验等表明其具有胚胎干细胞的特性。     

牛囊胚ICM克隆多能性标记基因与表面标记的研究

本研究旨在探究牛类胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES)的多能性标记基因与表面标记,为优化牛类ES细胞培养条件和相关研究提供依据。利用2i/LIF培养液,通过全胚接种及机械传代法分离培养牛囊胚内细胞团(Inner cell mass,ICM),免疫荧光染色法检测其多能性标记基因与表面标记;qRT-PCR检测免疫磁珠法分选的牛囊胚ICM和滋养层细胞(Trophectoderm cell,TE)的多能性标记基因的差异表达结果。试验成功分离出了牛囊胚ICM克隆,并体外培养至第10代,且各代克隆均呈现出了典型的干细胞形态。结果表明,ICM表面标记SSEA1、SSEA4和TRA-1-60染色为阳性,且多能性标记基因OCT4、SOX2和NANOG在其中均有表达;OCT4、SOX2和NANOG在牛囊胚ICM和TE中的表达存在差异(P0.05),其中SOX2的差异极显著(P0.01)。综上表明,2i/LIF培养液有助于牛囊胚ICM的培养;SOX2可能成为牛ICM克隆的候选多能性标记基因。     

鸡胚胎干细胞的分离及其嵌合体制备条件探索

分离培养鸡胚胎干细胞(ESCs),体外培养传代后,进行碱性磷酸酶活性检测和SSEA-1染色鉴定;并用线性化的质粒pEGFP-N1转染鸡ESCs。受体种蛋经赤道面开窗后,将经转染的ESCs注射到受体鸡胚胚下腔,以便制作嵌合体鸡;对获得的嵌合体鸡分别提取血液和组织DNA后进行PCR检测。结果表明:5只存活的的嵌合体鸡血液中没有发生EGFP基因嵌合,但有4只嵌合体鸡的部分器官表达了EGFP基因,其中有2只鸡的性腺发生嵌合,表明利用赤道面开窗后对受体鸡进行胚下腔显微注射可以生产嵌合体鸡。     

无血清培养关中奶山羊胚胎生殖细胞的研究

山羊胚胎生殖细胞是一种来源于胎儿原始性腺的多能干细胞,建立该细胞体外稳定分离培养体系对研究山羊繁殖育种具有重要价值。本试验通过酶消化法和组织培养法分离培养关中奶山羊胚胎生殖细胞,检测无血清培养基对细胞体外增殖的影响。结果发现,该培养基可以分离得到山羊胚胎生殖细胞,细胞集落形态典型,表达AKP、Oct4、TERT及SSEA-1。经体外分化试验表明,细胞可以分化为类胚体、成纤维样细胞、成脂细胞和卵母细胞样形态。无血清培养基可以用于山羊胚胎生殖细胞的分离与培养,本试验对进一步建立山羊胚胎生殖细胞长期培养体系提供了新的参考。     

绵羊胚胎成纤维细胞饲养层用于培养人诱导性多能干细胞的效果研究

试验在体外分离培养1月龄绵羊胚胎成纤维细胞(sheep embryonic fibroblast,SEF),经丝裂霉素C处理后探讨其作为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)体外培养饲养层的可行性。试验以SNL饲养层细胞为对照,人iPSC(hiPSC)为培养对象,通过形态学观察、碱性磷酸酶(AP)染色、以及实时荧光定量PCR和免疫细胞化学对hiPSC标志基因mRNA和蛋白表达的检测,比较了SEF细胞和SNL细胞作为干细胞饲养层的效果。结果表明,在试验期内,与SNL饲养层体外培养的hiPSC相似,SEF饲养层体外培养的hiPSC在形态上呈集落样生长,增殖速度快;AP染色呈蓝紫色,能够维持未分化状态;能正常表达多能性标志基因。两种饲养层细胞培养的hiPSC多能性标志基因c-Myc、Klf4、OCT4和SOX2 mRNA的表达以及OCT4、SOX2、SSEA4和TRA-1-60蛋白的表达并无显著差异(P0.05)。本研究结果初步表明SEF可作为体外培养iPSC的饲养层细胞,为进一步建立可表达促生长因子的基因修饰SEF细胞系奠定了基础。     

鸡胚胎干细胞的分离和培养

实验从鸡第X期胚胎中分离胚盘,以鸡成纤维细胞为饲养层,用添加了10%的胎牛血清、2%的鸡血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μL/mL非必需氨基酸以及含1000IU/mL白血病抑制因子(LIF)、10ng/mL碱性成纤维生长因子(bFGF)和5ng/mL干细胞生长因子(SCF)的高糖DMEM对细胞进行培养和传代,可以获得传至5～6代的鸡胚胎干细胞(ES)。通过对传代培养后的鸡ES细胞进行AKP染色鉴定和SSEA-1的鉴定,证实细胞未发生分化,具有胚胎干细胞的特征。同时通过不同分离胚盘方法和不同消化时间的比较得出药勺法提取胚盘简单易行,原代消化5～8min的ES细胞适合于传代培养。     

悬滴培养法促进鸡胚胎干细胞形成类胚体

本研究旨在通过悬浮培养法培养鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs),摸索鸡胚胎干细胞形成类胚体(Embryoid body,EB)的最佳方案,以期提高鸡胚胎干细胞体外诱导效率。将鸡ESCs培养传代至第3代,采用1×104、3×104和6×104 mL-13个细胞浓度,使用悬滴培养后,观察类胚体的形成效率。对悬滴培养形成的类胚体进行形态学观察,qRT-PCR检测干细胞标记基因的表达,免疫细胞化学检测相关蛋白的表达,并进行类胚体自分化检测和核型分析。3×104 mL-1细胞浓度生成的类胚体数量最高,单个视野下可观察到约267个类胚体,且形成的类胚体大小均一,呈圆球状。qRT-PCR检测结果表明,在类胚体形成48h内,干细胞标记基因Nanog、Sox2、Oct4和C-kit仍维持表达。免疫细胞化学检测显示,该方法形成的类胚体表面抗原检测Nanog和SSEA-1呈阳性。自分化检测三胚层分化标记基因SOX17、SMA和TUJ-1呈阳性。核型分析显示,悬滴培养形成的类胚体具有并保持正常的核型。鸡ESCs悬滴培养形成类胚体的适宜细胞浓度为3×104 mL-1,且形成的类胚体可分化成3个胚层,用于体外定向诱导过程。本研究建立了鸡ESCs体外悬滴培养形成类胚体的培养体系,为后期信号通路的体外验证提供试验基础。