猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中已登录的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)在Nsp7基因中的保守区域设计合成了1对特异性引物,通过反应条件的优化,建立了检测美洲型PRRSV的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法,同时与商品化荧光定量PCR试剂盒进行比对分析。结果表明,该方法特异性强,灵敏度高,能很好的区分美洲型猪繁殖与呼吸道综合征病毒和其他病毒。使用该方法对14份临床样品进行检测,阳性率85.7%,与商品化试剂盒符合率100%。     

CSFV、PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及其应用

由猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的繁殖障碍性疫病在中国的不断暴发,增加了猪的发病率和死亡率。为了建立同时检测这3种病毒的多重PCR方法,本研究根据GenBank中这3种病毒的参考基因序列设计引物,并对反应中的影响因素进行优化,建立了同时检测CSFV、PRV和PRRSV的多重PCR方法。该方法扩增的基因片段大小分别为570(CSFV),232 (PRRSV)和173bp(PRV)。敏感性和特异性试验结果显示,该方法对3种病毒的核酸最低检出量分别为23.88(CSFV),13.10(PRRSV)和14.60pg(PRV),对大肠杆菌(Ec.oli)、沙门菌(Salmonella)、猪乙型脑炎病毒(JEV)及猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。对2015年5月至2016年1月收集的168份临床样本检测结果显示,CSFV阳性率为24.4%,PRRSV阳性率为21.4%,提示河北省该段时间内引起猪繁殖障碍性疫病的主要病原为CSFV和PRRSV。经多重PCR检测为PRRSV、PRV或CSFV阳性的临床样本,再次使用商品化的试剂盒进行检测,符合率为100.0%。这些结果表明,本试验建立的多重PCR方法省时、高效,可用于PRRSV、PRV和CSFV感染的临床诊断。     

食源性动物组织中CSFV和PRRSV双重双色荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检检测食源性动物组织中猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病病毒(PRRSV)的双色荧光定量RT-PCR方法。本研究根据SCFV和PRRSV基因序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应的体系和扩增条件,建立了能够检测食源性动物组织中SCFV和PRRSV的双重双色荧光定量PCR的方法。其检测下限为1×102拷贝/μL,而且与其他一些猪病病毒无交叉反应,具有良好的特异性。该方法重复性和稳定性试验表明其组内和组间的变异系数最高分别为4.2和4.5。对比试验表明,该方法对CSFV和PRRSV检验的敏感性为常规RT-PCR方法的200倍;该方法的建立为食源性动物组织中CSFV和PRRSV提供了有效手段,该方法特异性和敏感性较好,能够应用于临床检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,采用RT-PCR扩增PRRSV N基因266bp片段,并克隆到pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,建立了PRRSV荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.3×101拷贝/μL,与猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪日本脑炎病毒(JEV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明,建立的PRRSV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征病毒病(PRRS)的诊断。     

猪主要繁殖障碍疾病病原的多重实时定量PCR快速检测

本研究旨在建立多重Real-time PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV).根据GenBank数据库中PRRSV、PCV2、PRV、和PPV的核苷酸序列设计特异性引物和探针,通过优化反应条件,检测系列稀释的纯化阳性质粒,建立检测PRRSV、PCV2、PRV和PPV的单项和多重Real-time PCR方法.灵敏度和特异性试验结果表明,无论是单项和多重Real-time PCR检测,该方法都具有高度特异性,与其它病原检测无明显交叉反应;对4种病毒的最低检测量为＜101拷贝或1 TCID50,检测灵敏度比常规PCR高100倍.对40份临床样本进行检测,多重Real-time PCR检测结果和单项Real-time PCR检测结果完全一致.建立的同时检测PRRSV、PCV2、PRV和PPV的多重Real-time PCR方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能对样品进行定量检测等优点.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。     

同时检测猪瘟病毒和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定量RT-PCR方法的建立

应用猪瘟病毒（CSFV）及北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）特异性引物和TaqMan水解探针,建立一种同时检测CSFV和PRRSV的复合荧光定量RT—PCR方法。该方法可检测到3．2TCID50的CSFV和1．8TCID50的北美洲型PRRSV,比常规PCR方法敏感性高50倍以上。用复合荧光定量RT—PCR方法对155份现地样品进行检测,结果73份为PRRSV阳性,16份为CSFV阳性,13份为CSFV和PRRSV混合感染,与常规RT—PCR的符合率高达99．4％。该复合荧光定量RT—PCR方法敏感、特异、重复性好。     

塞内卡病毒Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据对GenBank中2015-2017年登录的18株国内塞内卡病毒(SVV)基因组序列比对分析结果,设计合成1对针对SVV 5’UTR区域的特异性引物和Taqman探针,通过优化荧光定量PCR反应条件,建立一种定量检测SVV的Taqman实时荧光定量PCR检测方法。该方法定量检测范围在10～10~9 copies/μL,检测下限为10 copies/μL,比常规PCR检测灵敏度高约1 000倍,同时检测口蹄疫病毒(FMDV)、猪水疱病病毒(SVDV)、猪水疱疹病毒(VSV)、圆环病毒(PCV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)均为阴性,特异性良好;对50份疑似病料同时进行荧光定量PCR检测和常规PCR检测,结果显示荧光定量PCR阳性检测率(38%)高于常规PCR阳性检测率(25%),证实本试验建立的SVV Taqman实时荧光定量PCR检测方法可实现对SVV的临床诊断和定量分析。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒的二重荧光LAMP方法的建立

建立一种二重荧光LAMP的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV)的快速诊断技术。根据已发表的PRRSV NSP2基因和PCV2 ORF2基因序列保守区域,分别设计并合成了两组针对PRRSV和PCV2序列的特异性引物和两条探针,两条探针分别标记不同的荧光基团,PRRSV-Probe 5’端标记FAM荧光基团,3’端标记BHQ1淬灭基团,PCV-Probe 5’端标记CY5.5荧光基团,3’端标记BHQ2淬灭基团。对组成反应体系中的引物、探针以及反应试剂进行优化,建立了二重荧光LAMP检测PRRSV和PCV2方法。对建立的方法进行特异性和敏感性测试,并用模拟混合样品和临床样品进行检测验证。结果显示,本研究建立的方法可以鉴别区分PRRSV和PCV2,特异性试验表明该方法只检测出PRRSV或PCV2,且与参试的对照病毒无交叉反应,特异性好。敏感性测试表明该方法最低检测PRRSV或PCV为100拷贝,敏感性好。对临床样品的检测,结果与荧光定量PCR方法检测结果一致。本研究建立的PRRSV和PCV2二重荧光LAMP检测方法,具有良好的特异性和敏感性,可用于临床样品中检测PRRSV和PCV2。     

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR定量检测试剂盒测量不确定度研究

为填补测量不确定度在兽医领域病原学检测的空白,建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒测量不确定度评估模型,对市售的3种美洲型PRRSV实时荧光RT-PCR检测试剂盒进行了测量不确定度评估,评估了移液器、温度、重复性测量因素对试验结果产生的不确定度影响。研究数据表明:移液器与重复性测量对试验结果产生的不确定度影响较大,应予以重视,需规范操作;建立的3种试剂盒测量不确定度模型缩小了试剂盒对可疑样品的判定区域,对样品临界参考值的检测结果判定具有实际意义。通过比对4个厂家的核酸提取试剂,筛选出了提取效率最高的试剂盒。本研究建立的PRRSV实时荧光RT-PCR定量检测试剂盒测量不确定度模型为兽医实验室检测结果不确定度评估及应用奠定了基础。     

PRRS流行毒株与减毒活疫苗TJM F92株qPCR区分方法的建立与应用

 
为快速准确区分PRRS流行毒株与减毒活疫苗TJM F92株以及对流行毒株进行定量检测,按GenBank中发表的美洲型PRRSV SX 1分离株、弱毒疫苗株NSP2基因缺失部位的不同设计了一对特异性引物,通过RT PCR和体外转录的方法,构建了体外转录RNA作为标准品,并对反应条件和反应体系进行优化,旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性和稳定性良好的qPCR鉴别方法。结果表明,该方法最低能检测出1.0×101拷贝/μL的模板,敏感性比常规PCR高100倍;应用该方法对218份临床样本进行鉴别与定量,qPCR检出率较常规RT PCR高12.9个百分点。研究表明,qPCR鉴别方法的建立实现了对PRRS流行毒株与疫苗毒株的快速区分以及对流行毒株的定量检测,为PRRS的快速诊断提供了依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒一步多重RT-PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的一步多重RT-PCR检测方法.通过多序列比对以及反应条件的优化,从4对引物中精选了3对特异性和敏感性较好、扩增片段分别为228、345和490 bp的引物,并应用所建立的方法对4种分离株的细胞毒和组织毒、田间样品及临床症状相似的疾病猪瘟和猪伪狂犬病毒做了检测；并对田间及实验室样品进行符合率试验,对阳性样品进行重复性试验.与常规RT-PCR法进行比较,证明该方法比常规RT-PCR法敏感性提高了10倍；而且利用该方法可使检测时间大大缩短；特异性试验证实该方法无交叉反应；阳性和阴性样本的符合率均为100％；3次阳性样品重复性检测结果完全相同；稳定性试验显示该试剂盒至少可保存1年以上.本研究所建立的PRRSV一步多重RT-PCR检测方法的敏感性高、特异性强、操作简便、省时、结果重复性好,不仅适用于临床病例尤其低微含量样品的诊断,而且在筛查隐形带毒动物及兽医检疫方面具有重要的应用价值.     

猪瘟病毒微滴式数字PCR方法的建立

为建立猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,实现猪瘟病毒定量检测.本研究根据猪瘟病毒5'UTR基因的保守序列设计了引物探针,对反应条件进行了优化,同时对该方法的灵敏性、特异性、重复性进行了评估,并对临床样品进行了检测.结果 显示:本方法的最低检测下限为3.2 copies/μL,未发现与其他病毒有交叉反应,样本重复的变异系数为...     

Establishment of the Quantitative Real-time PCR Method for PRRSV Nsp9 Gene Rapid Detection and Its Expression in PRRSV Infected Cells

The study was conducted to establish a quantitative Real-time PCR method for PRRSV Nsp9 gene rapid detection and study its expression in PRRSV infected cells.A pair of specific primers targeted to Nsp9 of PRRSV was designed and a Real-time PCR method based on SYBR Green Ⅰ fluorescent was developed for the quantization of PRRSV.The melting curve analysis using SYBR Green Ⅰ dye showed one specific peak,and no primer dimers peak was observed.No amplification was detected from HEV,SIV and PRV samples by this method.There was good reproducibility and low variation coefficient.The quantitative Real-time PCR method developed in this study would be useful for rapid laboratory diagnosis and epidemiology investigation of PRRSV.During the process of virus infecting cells,the expression level of Nsp9 increased gradually,and it got the highest at 36 h.This study laid the theoretical basis to explore the law of virus replication and clinical vaccine production.     

Nsp9基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及其在感染细胞过程中表达量的变化

试验旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp9基因的实时荧光定量PCR检测方法,并探究其在感染细胞过程中表达量的变化。根据PPRSVNsp9基因序列设计引物,建立基于SYBR Green Ⅰ检测模式的实时荧光定量PCR。结果显示,PRRSV Nsp9基因在1×10⁴~1×10⁸拷贝/μL范围内有很好的线性关系,扩增产物的熔解曲线只有1个单特异峰,无引物二聚体。该方法与猪戊肝病毒（HEV）、猪流感病毒（SIV）、伪狂犬病病毒（PRV）基因组均无交叉反应,可重复性好,组内变异系数小,可用于临床PRRSV检测。在病毒感染细胞过程中,Nsp9基因表达量逐步升高,36 h达到最高。本研究为探究病毒复制规律与临床疫苗生产奠定了理论基础。     

猪繁殖与呼吸综合征RT-LAMP检测方法研究

应用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N蛋白)ORF7基因保守序列的6个区域设计2对特异引物,经反应体系、反应条件优化及敏感性和特异性试验,建立了PRRSV RT-LAMP检测方法。研究结果表明,该检测方法不需要复杂仪器,仅用一台普通恒温水浴锅,在等温条件(63 ℃)保温1 h,即可完成核酸扩增反应,加入核酸染料SYBR GreenⅠ后,用肉眼即可对试验结果进行准确判定,为田间和基层部门检测猪繁殖与呼吸综合征病毒提供了一种廉价、简便、快速、敏感、特异的新方法。     

快速检测A型流感病毒的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法的建立

根据A型流感病毒基质蛋白（matrix protein,M）基因保守序列设计并合成特异性引物和TaqMan BHQ探针,建立快速检测A型流感病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆A型流感病毒M基因靶序列并将其连入pMD-18T载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.998。检测结果显示,该方法的灵敏度可达10 copies/μL或1 EID50病毒且特异性良好,除A型流感病毒外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪输血传播病毒检测结果均为阴性。该方法重复性好,批内和批间变异系数均小于3%。对40份实验感染样品的检测结果表明,该方法与病毒分离结果一致,比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高,特异性更强。