针对nsp9基因的siRNA在Marc-145细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

为了验证猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)nsp9基因对PRRSV的复制影响,化学合成针对nsp9基因的siRNA,转染到Marc-145细胞中,接种PRRSV之后分别通过荧光定量和Western blot方法来测定病毒的滴度变化和表达情况。结果发现,转染siRNA的Marc-145细胞中病毒的滴度低于未转染特定siRNA的对照组,同时N蛋白的mRNA和蛋白水平均低于未转染特定siRNA的对照组。初步得出结论nsp9基因为病毒复制关键基因,针对nsp9基因的siRNA会在Marc-145细胞中抑制PRRSV的复制。     

干扰和稳定表达GP5对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染早期复制的影响

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)主要结构蛋白GP5对病毒复制的影响及其机制,利用PiggyBac Transposon载体系统构建表达GP5的重组质粒(pPB-GP5),转染Marc-145细胞通过嘌呤霉素抗性筛选和3次亚克隆,获得稳定表达GP5的Marc-145细胞,在确定GP5表达不影响细胞增殖的基础上,用PRRSV感染筛选的细胞,通过N基因拷贝数、N蛋白表达水平和病毒滴度检测确定GP5表达对病毒复制的影响,并采用ELISA方法检测培养上清中IFN-α、IFN-β、IFN-γ的水平;进一步针对PRRSV ORF5编码区设计合成3对特异性siRNA,转染Marc-145细胞6和12h后以0.1 MOI病毒感染细胞,感染后24h收集细胞,采用荧光定量PCR(qPCR)检测GP5mRNA的表达,采用Western blot检测PRRSV N蛋白的表达。结果显示:经RT-PCR、Western blot和IFA检测,确定GP5在Marc-145细胞中获得稳定表达,且不影响细胞增殖,但可以在感染早期促进PRRSV在细胞中的复制,这种促进作用可能是通过下调IFN的表达发挥的;与阴性对照siRNA相比,3对特异性siRNA均能抑制PRRSV复制,其中100nmol·L~(-1)的siRNA GP5-471的抑制效果最好。研究表明GP5在PRRSV复制中发挥着重要作用。     

RNAi靶向N基因抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制

根据编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N)基因的序列,设计3个干扰靶位(N12、N23、N26),构建siRNA表达载体,转染Marc-145细胞后接毒,测定病毒TCID50、CPE,并利用实时荧光定量PCR及间接免疫荧光检测病毒在Marc-145细胞上的复制情况。结果表明,利用RNAi技术靶向N基因,其中N12干扰靶位可以高效抑制PRRSV的增殖,证实N基因可能是病毒复制所必需的结构基因,所选的干扰靶位是病毒复制的关键性位点。     

苦参碱对感染PRRSV Marc-145细胞受体表达的影响

为探讨苦参碱在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染Marc-145细胞过程中的抗病毒机制。本研究建立感染PRRSV的Marc-145细胞模型,将试验分为4组:细胞对照组、病毒对照组、苦参碱对照组和苦参碱试验组,每组重复3次。PRRSV感染细胞3,6,12,24h后,收集细胞,采用qRT-PCR和Western blot分别检测苦参碱对PRRSV N基因及其细胞受体CD163、Vimentin和CD151的影响。结果表明,在PRRSV感染24h内苦参碱显著降低PRRSV N基因的表达(P0.05)。与病毒对照组相比,在PRRSV感染6h时,苦参碱可显著降低CD163的表达量(P0.05);在PRRSV感染3,6h,苦参碱试验组Vimentin的表达量显著降低(P0.05);在PRRSV感染3,24h时,CD151的表达量显著低于病毒对照组(P0.05)。以上结果表明苦参碱在PRRSV感染Marc-145细胞的不同时间点可通过抑制细胞不同受体的表达来抑制PRRSV吸附和侵入宿主细胞,从而干扰PRRSV在细胞中的复制。     

人参皂苷Rb1对PRRSV的体外抑制作用及对病毒N蛋白表达的影响

为了在感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的Marc-145细胞模型上,探讨人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1, GSR1)抑制PRRSV能力及其作用机制。采用MTT法测定GSR1在Marc-145细胞上的最大安全浓度(Maximum no-cytotoxic concentration, MNTC)和半数毒性浓度(50%Cytotoxic concentration, CC_(50))。建立PRRSV感染Marc-145细胞模型,设计阻断PRRSV复制和直接杀灭PRRSV试验,确定GSR1体外抗PRRSV的作用方式;利用FQ-PCR检测GSR1对病毒N基因的影响,间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western Blot技术测定GSR1对PRRSVN蛋白表达的影响。结果表明,GSR1在直接杀灭PRRSV试验中最高抑制率为54.65%,在阻断PRRSV复制试验中前12 h起抗病毒作用,且最高抑制率达60.01%,推测GSR1主要通过直接使病毒灭活或干扰病毒的早中期复制来发挥其抗病毒作用。此外,在设定12～72 h试验时间内,阳性药物利巴韦林组,4 mg/mL、2 mg/mL GSR1组PRRSV N基因拷贝数显著低于病毒组(P0.05)。在对N蛋白含量影响试验中4 mg/mL GSR1和阳性药物可以减少N蛋白载量。表明GSR1可以通过抑制病毒N蛋白的表达来抑制病毒的复制,并可作为抗PRRSV的候选药物或先导物。     

非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A羧基端在PRRSV感染Marc-145细胞中的作用

为研究非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A(NMHCⅡ-A)羧基端在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染Marc-145细胞中的作用,本实验通过提取Marc-145细胞总RNA,RT-PCR方法扩增NMHCⅡ-A羧基端930 bp基因PRA,并进行核苷酸序列测定。将该基因连接到pEGFP-N1载体中,采用双酶切和PCR方法对重组质粒pEGFP-N1-PRA进行鉴定。将pEGFP-N1-PRA转染至Marc-145细胞后感染PRRSV,测定TCID50值及间接免疫荧光(IFA)检测PRA对PRRSV感染Marc-145细胞的影响。TCID50及IFA结果显示,与未转染的Marc-145细胞相比,转染pEGFP-N1-PRA的Marc-145细胞的PRRSV感染能力降低50%。本研究初步证明了PRA编码蛋白在PRRSV感染细胞中的作用,为PRRSV感染机制的研究提供了一定的依据。     

Nsp9基因在Marc-145细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

试验旨在验证Nsp9基因是否影响猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的复制。构建含有Nsp9全长基因的质粒pIRES2-EGFP-Nsp9,并转染到Marc-145细胞中,接毒之后分别通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法测定PRRSV N蛋白在mRNA和蛋白水平的表达。结果显示,转染Nsp9基因的Marc-145细胞上PRRSV的N蛋白在mRNA水平上显著高于未转染Nsp9基因的对照组（P<0.05）,是对照组的1.5倍,同时转染Nsp9基因后的Marc-145上PRRSV N蛋白水平也明显高于对照组。随着剂量的增加,N蛋白的表达量在mRNA和蛋白水平都有所增加。由以上结果初步可知,Nsp9基因可以在Marc-145细胞上促进PRRSV的复制,Nsp9基因与其复制密切相关。     

靶向HP-PRRSV ORF7基因的siRNA重组伪狂病病毒的体外复制抑制效果

为了评价靶向高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)ORF7的siRNA重组伪狂犬病病毒(rPRV)对HP-PRRSV复制的体外抑制效果。将500MOI的siRNA rPRV:rPRV gG-/siRNA N1、rPRV gG-/siRNA N2、rPRV gG-/siRNA N3分别感染Marc-145细胞,24h后再分别接种10 MOI PRRSV,感染病毒48h后,观察其抑制HPPRRSV HN1株复制效果;待细胞感染病毒72h后,应用间接免疫荧光试验(IFA)、实时荧光定量PCR及Western blot检测重组rPRV介导的siRNA对HP-PRRSV在细胞中复制的抑制作用。结果显示,与表达突变siRNA的rPRV gG-/siRNA Neg及接毒对照组相比,HP-PRRSV在细胞中的复制均可被3个siRNA rPRV有效抑制,其中重组病毒rPRV gG-/siRNA N2抑制效果最佳;进一步检测siRNA重组rPRV在Marc-145细胞中抑制HP-PRRSV HN1株的复制效果,结果显示,与对照组相比,重组病毒rPRV gG-/siRNA N1和rPRV gG-/siRNA N3抑制作用不明显,而rPRV gG-/siRNA N2不但能够有效抑制HP-PRRSV引起的细胞病变,而且能够消减HP-PRRSV N蛋白的表达,明显降低ORF7mRNA的表达水平(P0.05),且其抑制作用具有剂量依赖性,其抑制效果至少可持续5d,但随着时间的延长逐渐减弱。结果提示siRNA rPRV在体外能抑制HP-PRRSV的复制。     

苦参碱对PRRSV的体外抑制作用及其机制

本试验以Marc-145细胞为模型,采用细胞病变(CPE)抑制试验和MTT法测定细胞活力,观察苦参碱(matrine)体外抗猪繁殖呼吸与综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)活性,并从抑制病毒复制、阻断吸附和直接杀灭3个方面探讨苦参碱体外抑制PRRSV的作用机制.结果显示,苦参碱CC50＞1 500 mg/L,最大安全浓度为750 mg/L,EC50为(443.5±33.4)mg/L,SI≥3.38,在安全浓度范围内对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制率达到93.6％;在直接杀灭和复制抑制试验中最高抑制率分别达到105.10％和91.53％;在病毒吸附抑制试验中抑制率＜20％,表明苦参碱不能阻断PRRSV对Marc-145细胞的吸附.结果表明,苦参碱在体外可有效抑制PRRSV对Marc-145细胞的感染,其抗病毒机制可能是干扰病毒的复制或/和直接杀灭病毒,提示苦参碱可作为研发预防及治疗猪蓝耳病的药物或先导化合物.     

Marc-145细胞接种PRRSV后多次收毒的探索

为提高单个Marc-145细胞的产毒数量,减少原材料的损耗,提高生产效率,对接种猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的Marc-145细胞在24h或36h收毒,随后补入不含病毒的维持液,12h或24h后再收毒,反复收毒4次。结果表明,数次收获毒液的TCID_(50)差异不显著,且与常规接毒细胞所产毒液的TCID_(50)基本相同,说明多次收毒在实际生产中具有应用前景。     

姜黄素通过增强血红素加氧酶-1的表达抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制

为研究姜黄素(curcumin)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制和血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)三者之间的关系,以高致病性PRRSV毒株GD-HD感染Marc-145细胞为研究对象,采用Western blot、病毒滴度测定和定量反转录PCR,分析姜黄素对PRRSV N蛋白和子代病毒滴度、HO-1 mRNA和蛋白表达水平的影响,并应用靶向HO-1特异性siRNA解析HO-1在PRRSV复制中的作用。结果显示,姜黄素呈浓度依赖性的抑制PRRSV N蛋白的表达水平和子代病毒滴度,同时增强HO-1 mRNA和蛋白的表达水平。用HO-1特异性siRNA敲低HO-1的表达可部分反转姜黄素的抑制作用。结果表明,姜黄素通过诱导HO-1的表达抑制PRRSV的复制。     

双香豆素对猪繁殖与呼吸综合征病毒的体外抑制作用

为探究双香豆素(DIC)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的影响,本研究首先通过CCK-8法检测DIC对Marc-145细胞的细胞毒性,并计算其半数毒性浓度(CC₅₀);进而使用荧光定量PCR和Western blot检测DIC对PRRSV增殖水平的影响;通过不同给药方式处理细胞进一步探究DIC针对的PRRSV增殖阶段。结果表明,DIC对Marc-145细胞的细胞毒性CC₅₀为96.11μmol·L^-1,并在浓度为25μmol·L^-1时即表现出明显的抗PRRSV活性;DIC可以呈剂量依赖性地抑制不同时间和不同滴度的PRRSV增殖。DIC对PRRSV感染周期的吸附、入胞和释放阶段无影响,但是可明显抑制PRRSV的复制阶段。本研究证实DIC以较低浓度在Marc-145细胞中表现出明显的抗PRRSV活性,并主要针对PRRSV的复制阶段。本研究提示双香豆素具备开发成临床抗病毒药物或添加剂的潜力,为新的PRRSV抗病毒药物的研发提供理论依据。     

GS-441524体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒的抑制效果

利用CCK8方法测定GS-441524作用Marc-145细胞的安全浓度,并通过检测该化合物在病毒吸附、内化、核酸复制环节对病毒的感染能力、mRNA与蛋白合成能力的影响,评价了GS-441524体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的活性,确定其在体外抑制PRRSV的作用阶段。结果显示,在Marc-145细胞中,GS-441524具有良好的抗PRRSV活性,其EC₅₀为2.65μmol/L;该化合物在体外显示出良好的安全性,其CC₅₀为2 706.41μmol/L;对PRRSV复制周期的影响是GS-441524主要抑制PRRSV的复制早期阶段,而对病毒吸附、内化环节无阻断作用。结果表明,GS-441524具有抗PRRSV复制的潜在能力,该结果为抗PRRSV药物的选择和开发提供了新思路。     

对猪繁殖与呼吸综合征病毒易感的Marc-145细胞克隆株的筛选

为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)在Marc-145细胞中的增殖效价,本研究旨在筛选出一株对该病毒易感度高的Marc-145细胞株。采用有限稀释法从母代细胞中分离单细胞克隆株,通过RT-PCR的方法测定毒株在克隆细胞上的核酸量,通过TCID_(50)检测毒株对克隆细胞株的易感性,同时进行细胞生长曲线绘制。结果表明,获得2-D4、2-E6、 2-C8、2-G9、2-H11株共5株Marc-145克隆细胞。接毒72 h后,2-D4、2-E6、2-C8和2-H11株细胞出现明显细胞病变,2-G9株和母代细胞培养上清液核酸检测呈阳性,但未出现细胞病变。同时,2-D4株对PRRSV毒株高度易感,该克隆细胞的分裂增殖能力要强于其他克隆株。综合上述试验结果,2-D4株更适宜于PRRSV培养,因此采用有限稀释法筛选对PRRSV易感的Marc-145细胞是一种可行的科学研究方法。     

人参多糖体外抗猪生殖与呼吸综合征病毒活性

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是严重危害养猪业的传染病之一,也是重点防控的疾病之一。人参多糖(ginseng polysaccharides complex,GPS)具有抗病毒及增强免疫的作用。为了寻找有效预防和治疗PPRS的药物,本试验以Marc-145细胞为模型,采用细胞病变抑制试验和MTT法测定细胞活力,观察GPS在体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的作用,并通过改变药物作用方式初步探讨GPS的抗病毒机制。试验分为6组,分别为50,100,200和400 mg/L GPS组、病毒对照组及正常细胞对照组。在GPS对PRRSV感染Marc-145细胞的阻断和抑制作用中,各质量浓度GPS均显著提高感染PRRSV后Marc-145细胞的存活率(P<0.05),GPS处理组Marc-145细胞中的PRRSV量均显著低于病毒对照组(P<0.05)。而且,GPS可以促进Marc-145细胞中IL-6和IFN-γ的mRNA表达,也能增强细胞上清中IL-6和IFN-γ的活性。本试验研究表明GPS在体外可有效阻断或抑制PRRSV对Marc-145细胞的感染,提示GPS可作为预防和治疗PRRS的候选药物。     

黑水虻(Hermetia illucens L.)幼虫脂肪抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的体外增殖

旨在研究黑水虻(black soldier fly,Hermetia illucens L.)幼虫脂肪对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的体外抑制作用,初步探讨其产生抑制作用的机制。试验采用水解黑水虻幼虫脂肪乳化液(BSFLh)处理在Marc-145细胞上增殖的PRRSV,以乳化剂为阴性对照,月桂酸单甘油酯(GML)为成分对照,采用荧光定量PCR法测定PRRSV N基因RNA表达水平。试验结果显示,培养基中含BSFLh 250μg/mL,可以显著抑制PRRSV在Marc-145细胞上的增殖(P≤0.001);在PRRSV侵入Marc-145细胞前添加BSFLh,可以显著抑制PRRSV增殖(感染后6 h,P≤0.000 1),而在侵入后添加BSFLh对PRRSV增殖抑制不显著(感染后6 h,P0.05);乳化剂对照组抑制效果显著低于BSFLh组(P≤0.01);培养基中含月桂酸单甘油酯无法抑制PRRSV在Marc-145细胞上的增殖。研究表明,BSFLh可以抑制PRRSV在Marc-145细胞上的增殖,其抑制活性来自于水解黑水虻幼虫脂肪和乳化剂,抑制作用主要发生在病毒侵入细胞前。     

非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A羧基端蛋白的真核表达及在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞中的作用

前期研究结果证明抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的抗独特型抗体特异性结合Marc-145细胞上的非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A(Nonmuscle myosin heavy chainⅡ-A,NMHCⅡ-A)蛋白,其结合位点位于NMHCⅡ-A的羧基端。本研究通过真核表达NMHCⅡ-A的羧基端(PRA)蛋白,验证其对PRRSV感染Marc-145细胞的作用。通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达PRA蛋白。Western blot和间接免疫荧光鉴定PRA蛋白的表达及其与Marc-145细胞的结合。通过病毒中和试验、荧光聚焦中和试验和荧光定量PCR检测PRA蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的作用。Western blot和间接免疫荧光结果表明,PRA蛋白在真核细胞中得到成功表达,其最高表达量为接种1个MOI杆状病毒后96h时。PRA蛋白特异性结合Marc-145细胞,使PRRSV感染Marc-145细胞延迟24h并且感染效率降低60%。真核表达的NMHCⅡ-A羧基端蛋白能特异性结合Marc-145细胞并有效降低PRRSV的感染。这些结果为进一步阐明NMHCⅡ-A在PRRSV感染细胞过程中的作用提供了新的依据。     

融合抗菌MAPWA和PGBD-2抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外增殖效应的研究

为探索融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2在体外的抗病毒作用,特开展以下研究:用融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2与Marc-145细胞和PRRSV共培养,以实时定量RT-PCR技术检洲Marc-145细胞中及培养液的PRRSV含量.结果发现:PRRSV感染Marc-145细胞96 h,实验组的RT-PCR检测数量均≤1.7,而阳性对照组的RT-PCR检测数量达到3.38.实验组数值显著低于阳性对照组.说明融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2能够显著减少PRRSV在Marc-145细胞的复制量;证明融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2具有明显的抗病毒效应,能显著地抑制病毒复制,减少其在靶细胞中的含量.提示:融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2分子具有显著抑制PRRSV在靶细胞内复制的作用,为开发抗病毒新型生物饲料添加剂提供了重要的参考.     

猪繁殖与呼吸综合征CH-1R弱毒株低血清培养工艺研究

Marc-145细胞是用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)培养的易感细胞。通过对PRRSV CH-1R高敏感Marc-145/D2克隆细胞株培养特性的研究,以及分析病毒在不同血清浓度细胞维持液中的增殖水平,筛选出最佳培养条件。结果表明,以Marc-145/D2克隆细胞株无血清转瓶培养PRRSV CH-1R的抗原效价可达到108.0TCID50/mL以上。     

麦角甾醇过氧化物抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制试验

为了研究麦角甾醇过氧化物(ergosterol peroxide,PE)抑制PRRSV的活性,在体外用猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a毒株感染Marc-145细胞,在病毒感染的同时加入不同浓度的PE,24 h后固定细胞用间接免疫荧光检测细胞内的病毒N蛋白,同时收集细胞培养上清检测病毒滴度,结果显示,PE可剂量依赖性地抑制PRRSV在细胞中复制。分别用PE预处理病毒或细胞,结果发现,病毒与PE共孵育并不会抑制病毒感染细胞活性,而PE预处理细胞则会抑制病毒在细胞中复制。表明PE通过作用于宿主细胞而抑制PRRSV在体外细胞中复制,为进一步开发利用PE提供了基础。