奶牛乳腺炎5种病原菌多重PCR快速检测方法的建立与评价

为建立一种能同时快速检测多种奶牛乳腺炎致病菌的多重PCR检测方法,本研究以化脓隐秘杆菌ISR基因、无乳链球菌cfb基因、大肠杆菌phoA基因、副乳房链球菌23S rRNA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因,设计并合成了5对特异性引物,通过方阵法对多重PCR反应体系及反应条件优化,建立了一种能快速检测5种病原菌的多重PCR方法。对各菌种随机组合后利用该多重PCR方法检测,结果显示,该方法能同时快速检测奶牛乳腺炎乳样中5种主要病原菌,而其他病原菌则呈阴性结果,具有较强特异性。分别将化脓隐秘杆菌、无乳链球菌、大肠杆菌、副乳房链球菌、金黄色葡萄球菌菌液10倍倍比稀释后,利用建立的多重PCR方法进行检测,确定该方法敏感性,结果显示,该方法对5种病原菌最低检测浓度分别为:金黄色葡萄球菌6.25×10~4cfu/mL,大肠杆菌2.95×10~6cfu/mL,化脓隐秘杆菌2.95×10~5cfu/mL,副乳房链球菌4.3×10~5cfu/mL,无乳链球菌3.15×10~5cfu/mL。对临床送检及人工模拟的乳样检测结果显示该方法具有较好符合率及灵敏度。本研究首次建立了对包括副乳房链球菌在内的奶牛乳腺炎致病菌多重PCR检测方法,为快速检测奶牛乳腺炎病原菌提供了可行的技术手段。     

甘肃省山丹地区马子宫内膜炎主要病原菌的分离鉴定及多重PCR检测方法的建立

旨在对甘肃省山丹地区马子宫内膜炎主要致病菌进行分离鉴定并建立一种病原菌多重PCR(multiplex polymerase chain reaction, MPCR)检测方法。根据病原菌分离鉴定结果,选取主要致病菌金黄色葡萄球菌(Saphylococcus aureus,S.aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)和马链球菌(Streptococcus equi,S.equi)进行多重PCR检测方法的建立。提取3种标准菌株基因组并基于nuc、phoA、fneB的保守区域设计3对特异性引物,扩增预期核酸片段分别为1 319,385,109 bp,进行引物特异性MPCR验证同时对扩增条件中的退火温度、引物浓度优化,建立检测3种病原菌的多重PCR,完成样品检测评估。结果表明,山丹地区马子宫内膜炎主要致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和马链球菌,设计的引物与无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,S.agalactiae)、肺炎链球菌(Pneumococcus)无交叉反应,建立的多重PCR检测方法退火温度在59.4℃时最佳;在引物为0.3～...     

病原菌分子生物学诊断技术及其在奶牛子宫内膜炎诊断中的应用进展

子宫内膜炎(Endometritis)是奶牛常见的生殖系统疾病,影响奶牛的生产性能,给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失。奶牛子宫内膜炎多由病原菌混合感染,若能及时、准确地检测出致病菌,对该病的综合防控至关重要。目前,奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术的相关报道甚少,为进一步研究开发奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术,论文对目前应用于其诊断的PCR技术、环介导等温扩增(LAMP)技术、基因芯片技术等的研究进展进行了综述,并对其应用情况和优缺点进行了分析与总结,以期为奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术研究提供参考。     

奶牛子宫内膜炎乳房链球菌耐药性与毒力基因检测分析

[目的]了解奶牛子宫内膜炎乳房链球菌的耐药性和携带毒力基因。[方法]采集香河县5家奶牛场患子宫内膜炎奶牛的子宫黏液样本76份,用PCR鉴定分离菌株的乳房链球菌,采用微量肉汤稀释法测定8种抗菌药对乳房链球菌的最小抑菌浓度（MIC）,判断其耐药性。用PCR检测乳房链球菌携带的10种毒力基因。[结果]PCR检测出18株乳房链球菌,总分离率23.68%。18株乳房链球菌对克林霉素、庆大霉素、四环素耐药性较高,耐药率分别为66.67%、88.89%、72.22%。所有菌株均携带slp、sua、gapC、fpb、cfu和pauA,而hasA、hasB、acdA检出率分别为38.89%、50.00%、33.33%,未检出hasC。[结论]该地区乳房链球菌是奶牛子宫内膜炎主要致病菌之一,耐药性较严重,毒力基因流行广泛,应加强监测,合理用药。     

转人乳铁蛋白基因奶牛多重PCR检测方法的研究

本研究旨在建立转基因奶牛多重PCR快速检测方法,为转基因动物及产品出入境检测技术平台的建立提供技术支持,并为转基因动物及产品检测技术标准的制定提供参考。根据牛物种特异性基因(mtDNA)设计奶牛内源基因引物,根据外源基因人乳铁蛋白基因(human lactoferrin,hLF)和新霉素磷酸转移酶基因(NPT Ⅱ)设计特异性引物,优化反应条件,建立转基因奶牛多重PCR检测方法。本方法敏感、快速、特异,一个反应可以检测多个基因片段,可有效用于转基因奶牛外源基因的检测。     

转人溶菌酶基因奶牛多重PCR快速检测方法的建立

建立转基因奶牛多重PCR快速检测方法,为转基因动物及产品进出境检测技术平台的建立提供技术支持,并为转基因动物及产品检测技术标准的制定提供参考。根据牛物种特异性基因线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)设计奶牛内源性基因引物,根据外源基因人溶菌酶基因(human lysozyme,hLY)及标记基因新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)设计特异性引物,优化反应条件,建立转基因奶牛多重PCR检测方法。结果表明,建立的方法灵敏、快速、特异,一个反应可以检测多个基因片段,可有效用于转基因奶牛外源基因的检测。     

巴彦淖尔地区奶牛子宫内膜炎致病菌分离鉴定及药敏试验

为了解巴彦淖尔地区奶牛子宫内膜炎的致病菌及其抗药性,按照奶牛子宫内膜炎的诊断标准,选取巴彦淖尔地区5家规模化养殖场子宫内膜炎病牛60头,采集子宫分泌物,对其病原菌进行分离鉴定及药敏试验。结果表明:链球菌和葡萄球菌是引起该地区奶牛子宫内膜炎的主要致病菌;诺氟沙星、环丙沙星、氟苯尼考三种药物对受试致病菌均表现为高度敏感,青霉素和链霉素对致病菌表现为严重的耐药性。     

奶牛乳房炎主要致病菌16S rDNA基因芯片检测方法的建立

本研究建立了快速检测奶牛乳房炎主要致病茵的基因芯片方法,试验以奶牛乳房炎4种主要致病菌的16SrDNA基因作为基因芯片检测的靶片段,设计和筛选通用性引物和特异性探针,对通用引物进行荧光标记、PCR扩增、芯片杂交和信号扫描分析,根据杂交信号强度和聚类分析结果,判定奶牛乳房炎感染的致病菌种类。实验结果显示：以16SrDNA为靶基因检测奶牛乳房炎主要致病菌（无乳链球菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌）的基因芯片方法,可以快速、特异、准确地对这4种试验菌株进行检测和鉴定。该检测方法的建立将为流行病学调查、食品卫生监督、乳房炎的防控等提供快速、有效的检测方法,具有良好的市场应用前景。     

转人血清白蛋白基因奶牛多重PCR快速检测方法的建立

建立转基因奶牛多重PCR快速检测方法,为转基因动物及产品进出境监测技术平台的建立提供技术支持,并为转基因动物及产品检测技术标准的制定提供参考。根据转基因奶牛内源基因β2-微球蛋白基因(β2-microglobulin,B2 M),外源基因人血清白蛋白基因(Human α-lactalbumin,α-LA)及标记基因绿色荧光蛋白基因(EGFP)和新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)设计特异性引物,优化反应条件,建立转基因奶牛多重PCR检测方法。该方法敏感、快速、特异,一个反应可以检测多个基因片段,可有效用于转基因奶牛外源基因的检测。     

奶牛子宫内膜炎源性大肠埃希菌药敏试验与耐药基因检测

为探索奶牛子宫内膜炎源性大肠埃希菌耐药基因及其耐药性之间的关系。采用K-B纸片法对临床分离的54株奶牛子宫内膜炎源性大肠埃希菌进行12种抗菌药物敏感性测定,应用PCR进行这些抗菌药物相关耐药基因的检测。结果显示,54株大肠埃希菌对复方新诺明、恩诺沙星和四环素的耐药率较高,分别为67%、39%和35%。分离的54株大肠埃希菌中有41株至少含有所检测耐药基因中的1种,CyrA、CyrB、ParC和Tet耐药基因较为普遍,其耐药菌基因检出率依次为96%、83%、100%和95%,13株没有检测到相应的耐药基因。奶牛子宫内膜炎源性大肠埃希菌对常见抗菌药物耐药严重,耐药基因普遍存在于耐药菌株中,除氨基糖苷类耐药菌株,其他3种抗菌药物类型耐药表型与耐药基因检测结果有较高一致性。     

三种奶牛常见病菌多重PCR诊断方法的建立

根据GenBank公布的布鲁氏菌Bcsp31、牛分枝杆菌pncA、炭疽杆菌capA三种特异基因的保守序列分别设计引物,在引物前添加通用引物(Tag),建立3种奶牛常见病菌的多重实时荧光定量PCR方法;通过构建3种病菌PCR扩增目的基因的质粒用于制备标准品进行敏感性验证;利用大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌用于特异性试验,并对30份样本进行了检测。结果表明,本研究构建的多重实时荧光定量PCR检测时间仅需2h,灵敏度为100个拷贝/uL,与其它细菌无交叉反应,特异性为100%,阳性检出率为88.89%。因此,本试验成功建立了检测3种奶牛常见病菌早期诊断的方法,可以在奶牛养殖中应用。     

奶牛血浆PGFM浓度变化与子宫内膜炎关系的研究

奶牛子宫内膜炎是奶牛产后多发性疾病之一，产后子宫感染是一种非特异性感染，主要的致病菌有分泌型化脓菌（Arcanobacterium pyogenes）、埃希氏大肠杆菌及其他多种革兰氏阴性厌氧菌。子宫内膜炎对奶牛业有重要的经济影响，若能早期识别出对子宫内膜炎易感性较高的奶牛，并提高对子宫内膜炎患牛的诊断率，将会明显的减少因产后子宫感染所带来的损失。     

郑州市奶牛场奶牛子宫内膜炎病原菌分离和鉴定

为了掌握郑州市奶牛子宫内膜炎发病情况,为奶牛子宫内膜炎病的预防提供参考依据。方法:采集确诊为子宫内膜炎奶牛的子宫内容物样品进行子宫内膜炎细菌学分析,对郑州市88头奶牛子宫内膜炎样品进行细菌的分离和鉴定。结果感染的细菌主要有金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、产吲哚金黄杆菌、浅黄金色单胞菌、奥斯陆莫拉菌和蜡样芽孢杆菌等56个菌株,大多数为混合感染。表明郑州市奶牛子宫内膜炎感染普遍存在,葡萄球菌和大肠埃希菌是奶牛子宫内膜炎的主要致病菌。     

奶牛子宫内膜炎的诊断和防治

随着现代养牛业的发展,奶牛饲养密度大大增加,但是对疫病的抵抗力却在不断下降。奶牛子宫内膜炎是奶牛常见的生殖系统疾病,病原有多种致病菌,主要威胁奶牛发情、配种和受胎。本文分析了奶牛子宫内膜炎的病因和临床症状,指出诊断方法和防治措施,以期缓解奶牛子宫内膜炎对奶牛自身和养殖场(户)造成的威胁,为保障奶牛生殖系统健康提供理论依据。     

双重PCR检测奶牛隐性乳房炎大肠杆菌与无乳链球菌方法的建立及应用

为快速检测奶牛隐性乳房炎主要致病菌大肠杆菌和无乳链球菌,分别针对2种致病菌16S-23S rRNA和16S rRNA基因设计2对特异性引物,优化并确立双重PCR反应体系。特异性检测表明,对其他对照菌株未扩增出目的条带;敏感性试验表明,该双重PCR对大肠杆菌、无乳链球菌的最小检测浓度分别为10~2、10~3cfu/mL。同时采用双重PCR与细菌学检查法对送检的96份奶样进行检测,结果双重PCR检出63份大肠杆菌阳性、54份链球菌阳性;细菌学方法检出29份大肠杆菌阳性、37份链球菌阳性。说明本研究建立的双重PCR方法敏感、快速,可用于检测大肠杆菌和无乳链球菌引起的奶牛隐性乳房炎。     

食蟹猴志贺氏菌、沙门氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

根据志贺氏菌属侵袭性质粒抗原H(ipa H)基因、沙门氏菌属特异性基因和小肠结肠炎耶尔森氏菌(ail)毒力基因,分别设计3对特异性引物,通过优化、调整PCR条件,建立了一种能同时检测食蟹猴3种致病菌的多重PCR检测方法。临床初步应用于检测137例食蟹猴肛拭子样品137份,检出志贺氏菌属阳性12株,沙门氏菌属阳性1株,小肠结肠炎耶尔森氏菌阳性1株,与传统细菌培养生化鉴定方法检测结果一致。本试验建立的多重PCR方法具有快速、准确、简便、灵敏、稳定性高等优点,具有较高的实际应用价值,为食蟹猴腹泻病原菌提供了新的快速检测方法。     

奶牛子宫内膜炎诊断方法综述

奶牛子宫内膜炎是奶牛产后的多发病之一,产后子宫感染是一种非特异性感染,主要致病菌有分泌型化脓菌、埃希氏大肠杆菌及其他多种革兰氏阴性厌氧菌[1]. 1 临床诊断 急性子宫内膜炎和慢性子宫内膜炎都有明显的临床症状.患牛一般体温升高,食欲下降,精神沉郁,产奶量下降,有时弓背、举尾、努责,常作排尿姿势,经常从阴道内流出多量黏性分泌物,结合情期变化和黏液性质,可以建立初步诊断,尤其是在奶牛产后20～26 d检查,其结果将更为准确.如量多而稀薄,形如蛋清样,就可视为卡他性子宫内膜炎;如量少而浓稠,形如脓痰样,就可视为脓性子宫内膜炎[2].     

一株兔源荚膜血清D型多杀性巴氏杆菌的分离和鉴定

为确定山东某兔场母兔子宫内膜炎病原,从病死兔子宫内膜炎的子宫脓液中分离到一株细菌,并对细菌进行了鉴定.结果显示,通过瑞氏染色、特异性PCR以及荚膜血清分型PCR鉴定,确定该株致病菌为荚膜血清D型的多杀性巴氏杆菌,命名为SDZG0324;通过多位点序列分析,确定该株致病菌为ST11型;利用Mega X生物学软件进行基因进...     

奶牛源乳房链球菌毒力与耐药性分析

乳房链球菌是导致奶牛乳房炎的主要病原菌之一,但近年来研究发现乳房链球菌也与奶牛子宫内的感染相关,导致子宫内膜炎的发生.采集甘肃省不同地区5个牧场患有子宫内膜炎奶牛的子宫黏液样品48份,共计分离得到18株乳房链球菌.然后通过CAMP试验来检测分离菌株的协同溶血作用,采用普通PCR检测10种已知毒力基因(hasA、hasB...     

3种鼠源致病菌多重PCR检测方法的建立

本研究以沙门菌组氨酸转运操纵子hut基因、肺炎克雷伯菌外膜蛋白Pho E基因以及金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因作为靶基因,建立了同时检测这3种致病菌的多重PCR方法,并对混有3种致病菌的盲肠内容物分别采用传统细菌分离培养法和PCR方法进行检测,同时对混有3种致病菌的粪便样品进行PCR检测。该方法能扩增出目的片段分别为495 bp、333 bp、279 bp。在优化条件下,多重PCR同时检测沙门菌、肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌的敏感度分别为1.23 pg、1.9 pg、1.185 ng DNA。分离培养法对沙门菌、肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌的最低检出限分别为1×10~2CFU、1×10~0CFU和1×10~2CFU。混合有3种致病菌的盲肠内容物和粪便,经增菌培养后,PCR法的最低检出量均为1×10~0CFU。本研究建立的多重PCR检测方法具有特异性及灵敏度高、操作简单、周期短的优点,适用于实验小鼠多种致病菌的快速检测和监控。