猪瘟病毒E0+E2基因的串联表达及多克隆抗体制备

串联表达猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)E0和E2蛋白，并制备多克隆抗体鉴定其免疫原性，为进一步研究亚单位疫苗和猪瘟ELISA抗体检测方法提供材料。应用PCR技术分别扩增CSFV E0和E2基因片段，运用重叠PCR将其串联扩增后克隆至pET-28a载体，构建重组表达质粒pET-28a-E0+E2。通过大肠杆菌表达系统表达重组蛋白E0+E2,切胶纯化后免疫昆明小鼠制备血清，通过间接ELISA方法测定抗体水平，间接免疫荧光(IFA)分析多克隆抗体的免疫原性和特异性。结果显示，37℃,1 mmol/L IPTG诱导条件下，E0+E2蛋白能够以包涵体形式表达，经纯化复性后免疫小鼠，制备的血清能与感染CSFV的细胞特异性反应。在大肠杆菌中高效表达了E0+E2蛋白，制备的多克隆抗体具有较高的特异性和反应性。     

猪MAVS基因原核表达载体的构建及其多克隆抗体的制备

通过RT-PCR从PK-15细胞系中扩增克隆MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein)基因,构建原核表达载体p ET-MAVS220,转化感受态细胞Rosetta(DE3),利用IPTG诱导表达,重组MAVS经纯化后免疫4周龄昆明系小鼠制备抗线粒体抗病病毒信号蛋白(MAVS)多克隆抗体。诱导表达的最佳条件为IPTG 0.05 mmol/L,37℃诱导6 h,重组MAVS以可溶性蛋白和包涵体两种形式表达。应用该重组蛋白免疫小鼠获得的抗MAVS多克隆抗体与纯化的重组MAVS蛋白反应效价可达1∶16 000;该抗体与Poly(I∶C)刺激PK-15细胞产生的MAVS及与转染了重组MAVS基因真核表达载体pcDNA3.0-MAVS的BHK-21细胞表达的MAVS蛋白发生特异性反应,效价可达1∶1 000,特异性良好。     

锡兰钩虫TIMP基因的序列分析与原核表达

为表达锡兰钩虫金属蛋白酶组织抑制剂(Ace-TIMP)重组蛋白,本实验根据GenBank中锡兰钩虫TIMP (ANCCEY-04405)基因序列设计引物扩增犬源锡兰钩虫Ace-TIMP基因,利用生物信息学软件对其序列鉴定;根据编码的氨基酸序列进行遗传进化关系分析;构建其重组表达质粒p ET-32a-Ace-TIMP-MP,转化大肠杆菌,并经诱导表达。结果显示,Ace-TIMP基因ORF为648 bp,编码215个氨基酸,包含16个氨基酸的信号肽,具有TIMP家族Cys-X-Cys特征性序列。进化树分析显示Ace-TIMP与犬钩虫TMP-2位于同一分支。经诱导表达与纯化,获得了分子质量约为42 ku的可溶性融合蛋白。本实验克隆了Ace-TIMP基因并利用原核表达系统表达了可溶性的重组蛋白,为Ace-TIMP生物学活性的研究和免疫潜能的评价奠定了基础。     

牛源犬新孢子虫NcGRA9基因原核表达及免疫原性分析

为了确定牛源犬新孢子虫NcGRA9基因的功能及表达蛋白的免疫原性，本试验PCR扩增牛源犬新孢子虫NcGRA9基因，构建克隆质粒pMD18-T-NcGRA9和原核表达质粒pGEX-4T-NcGRA9,转化大肠杆菌BL21感受态细胞中IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达重组蛋白的反应原性，应用重组蛋白与弗氏佐剂混合接种BALB/c小鼠，ELISA检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平以及IFN-γ、IL-4细胞因子水平。结果显示，经PCR扩增获得522 bp的NcGRA9片段，表达蛋白纯化后相对分子质量约为45 kDa,具有良好的反应原性；重组蛋白接种BALB/c小鼠后，免疫组小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体水平以及IFN-γ、IL-4细胞因子水平均极显著高于PBS对照组(P<0.01),说明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验表达的NcGRA9重组蛋白具有良好的抗原性，为新孢子虫病的防控奠定了基础。     

猪丹毒丝菌SpaA基因原核表达及表达蛋白质的免疫原性分析

旨在克隆表达猪丹毒丝菌SpaA蛋白,分析其免疫原性,为猪丹毒新型疫苗的研发奠定基础。运用PCR扩增SpaA基因,连接至pGEX-6P-1载体,将阳性重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDSPAGE分析表达产物,GST亲和层析纯化融合蛋白质,Western blot鉴定;纯化SpaA蛋白免疫小鼠,间接ELISA检测血清中IgG和Th1、Th2相关细胞因子;不同致病力猪丹毒丝菌攻击免疫小鼠,观察病理组织变化及其免疫保护率。结果显示,猪丹毒丝菌SpaA基因在大肠杆菌中实现表达,获得大小为75ku的纯化目的蛋白质。该蛋白质能特异性识别猪丹毒丝菌抗血清,可诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体IgG,并使TNF-β、IFN-γ、IL-5、IL-10含量显著升高,对攻毒菌的免疫保护率均为100%,病理组织变化与攻毒对照组之间差异明显。可见成功获得的重组SpaA蛋白具有良好的免疫原性,能激发机体的体液免疫和细胞免疫,产生较强的免疫保护力,可以作为研发猪丹毒亚单位疫苗的候选抗原。     

安氏隐孢子虫COWP部分编码基因的表达及免疫原性

依据NCBI中安氏隐孢子虫囊壁蛋白(COWP)编码基因设计特异性引物,提取安氏隐孢子虫长春株总RNA,RT-PCR扩增目的基因AF,构建重组原核表达载体pET28a-AF,通过大肠杆菌BL21诱导表达,产物经SDS-PAGE以及Western blotting鉴定。然后纯化重组蛋白,通过免疫BALB/c小鼠进行体液免疫和细胞免疫水平的检测。结果显示,重组原核表达质粒pET28a-AF构建成功,Western blotting显示重组蛋白约为18 000,可被安氏隐孢子虫免疫小鼠的多克隆抗体和HRP标记的抗组氨酸抗体识别。重组蛋白免疫BALB/c小鼠的抗体水平差异显著(P0.05),与对照组相比,CD4+的值差异极显著(P0.01),而CD8+的值差异显著(P0.05)。结果表明,成功克隆并表达了重组安氏隐孢子虫囊壁蛋白,纯化的重组蛋白具有一定的免疫原性。     

日本血吸虫重组IAP蛋白的免疫保护效果评估

为研究日本血吸虫凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein of Schistosoma japonicum,SjIAP）重组蛋白诱导BALB/c小鼠的免疫保护效果,利用PCR技术扩增SjIAP基因,构建重组表达质粒pET-28a（＋）-SjIAP,诱导表达重组SjIAP蛋白,并利用重组蛋白制备兔源多克隆抗体血清。然后,选用SjIAP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用ELISA检测免疫小鼠血清中的特异性抗体水平,以及免疫小鼠脾脏淋巴细胞在SjIAP重组蛋白刺激后产生的细胞因子水平。强化免疫后,将小鼠进行血吸虫尾蚴攻虫试验,感染38 d,进行剖杀,计算虫体减虫率及肝脏减卵率。Western blot结果表明本研究制备的兔源多抗血清能特异性识别SjIAP重组蛋白。ELISA检测表明免疫SjIAP重组蛋白可诱导较高水平的IgG及IgG亚型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。动物试验表明,免疫SjIAP重组蛋白的小鼠与PBS组相比分别获得了31.5%的减虫率和37.2%的肝脏减卵率。免疫SjIAP重组蛋白能诱导小鼠获得一定减虫和减卵保护效果,提示血吸虫凋亡蛋白抑制因子可作为抗血吸虫病的疫苗候选分子。     

猪丁型冠状病毒N基因原核表达及多克隆抗体制备

旨在研究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N蛋白的抗原性，为下一步诊断试剂盒的研发提供依据。试验通过RT-PCR的方法扩增PDCoV CH/GX/1468B/2017株完整的N基因并构建原核表达质粒pET32a-N,将pET32a-N转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，经诱导表达获得重组N蛋白，纯化后经Western blot方法检测其反应原性，免疫昆明小鼠制备重组N蛋白多克隆抗体并进行效价测定(间接ELISA法)和特异性验证(间接免疫荧光法)。结果显示：重组N蛋白在IPTG终浓度为1.0 mmol/L,37℃诱导表达6 h的条件下可获得最高表达量，该重组蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达；Western blot结果显示，纯化后的重组N蛋白可以和PDCoV阳性猪血清发生特异性结合，具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体的效价可达1∶64 000,间接免疫荧光法结果表明其能特异性识别和结合PDCoV,说明重组N蛋白具有较好免疫原性。提示：PDCoV N蛋白抗原性好，可作为诊断试剂盒的候选抗原。     

猪流行性乙型脑炎病毒B细胞多表位抗原的表达及免疫原性分析

流行性乙型脑炎病毒(JEV)可引起猪的繁殖障碍性疾病。本文利用基因重组技术,选取JEV prM/M、E、NS1蛋白的6个B细胞抗原表位,设计B细胞多表位基因,构建原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中表达融合重组蛋白rMEP。纯化的rMEP免疫小鼠,通过抗体、中和抗体及亚型检测研究其免疫原性。结果表明,rMEP在上清中高效表达,Western blot结果证实rMEP具有较好的抗原性。在小鼠免疫模型中,rMEP免疫组小鼠血清中产生较高水平的针对rMEP的抗体和特异性中和抗体,且rMEP可诱导产生IgG1和IgG2a抗体,但以IgG1为主。这些结果表明,构建的JEV B细胞多表位蛋白能够刺激小鼠产生较强的体液免疫应答,为研究JEV的多表位疫苗提供新的思路和参考。     

副猪嗜血杆菌血清5型TbpA蛋白的表达及其免疫原性分析

为原核表达副猪嗜血杆菌血清5型TbpA蛋白,本研究利用特异性引物扩增tbpA基因,并将其克隆到pMD 18-T载体中进行序列测定.再将其亚克隆于pET-28a中构建重组表达质粒pET-tbpA.将其转化受体菌E.coli BL21 (DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳和western blot分析表明,表达的重组蛋白约106 ku,并以包涵体形式存在.表达的重组蛋白经纯化后,免疫6周龄昆明小鼠制备免疫血清,ELISA分析表明制备的血清抗体效价在1∶3 200以上,表明TbpA具有良好的免疫原性.     

高致病性PRRSV JL-04/12株核衣壳蛋白的表达与抗原性分析

为获得高浓度、高质量的有效原核表达蛋白作为ELISA诊断抗原,通过RT-PCR法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JL-04/12株的核衣壳蛋白(N蛋白)基因并克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,转入到大肠埃希菌BL-21感受态细胞,经IPTG诱导表达,通过温度和IPTG浓度的优化,进行重组蛋白的高效表达,经SDS-PAGE和Western blot对表达产物的特性进行分析,利用GST柱纯化表达蛋白,并免疫小鼠,ELISA检测其刺激产生抗体的能力-抗原的免疫原性。结果表明,0.1mmol/L的IPTG、28℃诱导4h可高效诱导重组蛋白的表达,在表达上清中目的蛋白达40%,原核表达的重组N蛋白可诱导小鼠产生抗体,抗体效价为1∶256。原核表达的N蛋白与PRRSV具有相同的抗原性。     

犬瘟热病毒疫苗株与野毒株H蛋白球状头部域的免疫原性比较研究

以犬瘟热病毒疫苗株CDV3和野毒株LYM基因组RNA为模板,RT-PCR扩增得到CDV3和LYM的H全基因序列,PCR分别扩增得到CDV3和LYM-Head Domain基因,将其分别克隆于p ET-30a载体进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot分析表明,这两种重组蛋白均正确表达,分子质量约为50.8 ku。再将两种重组蛋白分别免疫小鼠,间接ELISA结果表明,这两种重组蛋白均能激发机体产生特异性抗体,具有一定免疫原性。中和试验结果表明,这两种重组蛋白的抗体中和效价差异不显著(P0.05)。     

委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

原核表达并纯化委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)E2蛋白胞外区,并以此为抗原免疫动物制备多克隆抗体。利用PCR扩增VEEV E2蛋白胞外区基因并将其插入到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达。优化诱导条件并对目的蛋白进行亲和纯化,用纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。通过PCR扩增出约为1 023bp的VEEV E2基因胞外区,成功构建重组表达质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,在37℃,0.6mmol/L IPTG诱导3h条件下目的蛋白表达量最高且主要以包涵体形式存在;将纯化的目的蛋白免疫BALB/C小鼠成功制备了抗VEEV E2蛋白胞外区鼠源多克隆抗体,经间接免疫荧光鉴定制备的抗体能够特异性识别真核表达的VEEV E2蛋白。VEEV E2基因胞外区在大肠杆菌中获得稳定表达,且表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,为VEEV快速诊断方法及新型疫苗的研究奠定了基础。     

牦牛日本血吸虫Sjp38MAPK基因克隆、原核表达及免疫保护效果研究

为了分析牦牛日本血吸虫Sjp38MAPK重组蛋白的免疫效果,试验采用RT-PCR方法克隆出牦牛日本血吸虫Sjp38MAPK基因,构建重组表达载体pET-30a(+)-Sjp38MAPK,转化到BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western-blot方法检测其蛋白的表达情况。结果表明,获得约为55 ku的重组蛋白rSjp38MAPK,表达的重组蛋白Sjp38MAPK能被感染日本血吸虫的阳性血清识别,具有免疫原性。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,以临床分离的日本血吸虫尾蚴腹部贴片攻毒,发现重组蛋白免疫组能降低小鼠的减虫率和肝脏减卵率,可诱导产生特异IgG抗体,具有较好免疫保护效果。这为进一步研究Sjp38MAPK蛋白功能及研制基因疫苗奠定基础。     

安氏隐孢子虫囊壁蛋白编码基因的克隆及原核表达

为克隆和原核表达安氏隐孢子虫囊壁蛋白(COWP)的部分编码基因(AB),本研究根据COWP基因序列设计引物,RT-PCR扩增目的基因AB,从而构建重组原核表达质粒pET-AB。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE以及western blot鉴定。回收并纯化重组蛋白,免疫BALB/c小鼠,检测细胞免疫和体液免疫水平。SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白约为16 ku,可以被HRP标记的抗组氨酸抗体和安氏隐孢子虫免疫的小鼠血清识别。经重组蛋白免疫的BALB/c小鼠抗体水平以及CD4+和CD8+的值均差异显著(p0.05),表明获得的重组蛋白具有一定的免疫原性。     

牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌强菌株rpoE蛋白的原核表达及其免疫保护效力研究

为研究牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌(PM)强菌株rpoE蛋白的免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增牛荚膜A型PM的rpoE基因,构建pET-28a-rpoE重组表达质粒,经诱导表达后SDS-PAGE检测结果显示,表达的rpoE蛋白相对分子量约为20 ku,与理论值一致;western blot结果显示该蛋白具有很好的特异性和反应原性;纯化的rpoE蛋白经皮下免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测融合蛋白的免疫原性,结果显示rpoE蛋白可以诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体;PM攻毒后,免疫组保护率为70%。本研究获得的牛荚膜A型PM重组rpoE蛋白具有良好的免疫原性,免疫小鼠后能够提供一定的保护,可以作为研发PM亚单位疫苗的候选抗原。     

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗原表位基因的表达及其表达产物的抗原性

为了确定猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白A、B抗原表位之间的相互关系和对免疫的影响，应用PCR方法扩增出A、B抗原表位基因并分别克隆于原核和真核表达载体中。原核重组质粒表达的重组蛋白经Western blotting检测证明，该重组蛋白具有良好的抗原性。将重组蛋白和真核表达质粒免疫小鼠，前者可诱导产生针对PRRSV的特异性ELISA抗体，但是此抗体没有中和活性；后者不能诱导免疫小鼠产生PRRSV特异性抗体。结果表明，中和抗体的产生不但与A、B表位的空间构象有很大的关系，如果蛋白质分子质量过小也不能诱导机体产生有效的免疫反应。     

小反刍兽疫病毒M蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备鼠抗小反刍兽疫M蛋白多克隆抗体,提取小反刍兽疫病毒(PPRV,Nigeria 75/1疫苗株)总RNA,用RTPCR方法扩增M基因并克隆到pMD18-T载体中,以鉴定正确的质粒进行酶切,回收目的片段后克隆于原核表达载体PGEX-4T-1,获得重组质粒PGEX-4T-1-M,转化大肠杆菌Transetta(DE3)并进行诱导表达,优化诱导蛋白表达条件,放大培养收获目的蛋白,并进行纯化,用纯化后的目的蛋白制备免疫原免疫昆明鼠制备多克隆抗体,利用间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。结果成功扩增出大小约为1 005bp(去掉终止密码子)的PPRV M基因;并构建了真核表达载体PGEX-4T-1-M,经IPTG诱导后目的蛋白以包涵体的形式表达,蛋白表达的最优条件为37℃,0.4mmol/L IPTG诱导4h;用经Ni-NTA纯化后的重组蛋白3次免疫昆明鼠后成功获得了PPRV M蛋白鼠源多克隆抗体,间接免疫荧光试验显示该多克隆抗体能够特异性识别非变性全长M蛋白。     

鸭圆环病毒Ⅰ型与Ⅱ型Cap蛋白原核表达及免疫原性分析

为了比较鸭圆环病毒(Duck circovirus, DuCV)Ⅰ型与Ⅱ型Cap蛋白免疫原性,试验分别选取DuCV-BJ株(HM162350.1,DuCVⅠ型)和DuCV-FJ株(EF370476.1,DuCVⅡ型)Cap基因作为参考序列,进行抗原表位预测,密码子优化与合成,克隆至pET-28a载体,将重组质粒转化至BL21(DE3)宿主菌中进行诱导表达,获得重组蛋白。重组蛋白纯化后免疫Balb/c小鼠,检测免疫小鼠体内特异性抗体IgG水平和细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、IL-4。结果表明：DuCV-BJ株和DuCV-FJ株Cap蛋白平均抗原指数分别为1.727和0.505,抗原表位区域存在差异。密码子优化后,密码子适应指数(CAI)由原来的0.89增长至1.00。重组质粒pET28a-BJ和pET28a-FJ均在大肠杆菌中成功表达;重组蛋白rCap-BJ和rCap-FJ免疫Balb/c小鼠后,均可诱导小鼠产生特异性抗体IgG,三免后rCap-FJ组、rCap-BJ组IgG水平极显著高于对照组(P<0.01),但rCap-FJ组与rCap-BJ组差异...     

裂谷热病毒eGn蛋白的制备及免疫原性验证

通过PCR扩增裂谷热病毒(RVFV) Gn蛋白胞外区(eGn)基因,连入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-RVFV-eGn。将重组质粒转化至感受态BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经HisTrap~(TM)FF蛋白纯化柱纯化目的蛋白。将目的蛋白免疫BALB/c小鼠,分离小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,免疫荧光鉴定制备的单克隆抗体特性。结果显示,PCR扩增出1 287 bp的目的基因;构建的重组质粒转化BL21细胞后可有效表达目的蛋白,确定最佳表达条件为30℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,目的蛋白以包涵体形式表达;纯化后目的蛋白纯度为94.136%;制备的单克隆抗体可特异性识别哺乳动物细胞表达的Gn蛋白,表明RVFV eGn蛋白具有良好的免疫原性。研究结果为裂谷热新型疫苗和快速诊断试剂的研制奠定基础。