血清4型禽腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速有效的检测血清4型禽腺病毒,本试验针对高度保守的Hexon基因序列设计引物和探针,建立了TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,结果显示:该方法线性关系良好,R~2=0.998;特异性强,对禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)均无扩增;敏感性好,最低可检测病毒含量为50拷贝/μL,比常规PCR方法敏感10倍;稳定性良好,组内和组间重复试验的变异系数分别为0.75%～1.71%和0.60%～1.74%。本试验建立的TaqMan荧光定量PCR方法,为血清4型禽腺病毒感染临床快速、准确诊断提供了技术支撑。     

禽腺病毒4型荧光定量PCR检测方法的建立与初步评估

为了对禽腺病毒4型(FAdV-4)引发的鸡心包积水-肝炎综合征的病原学监测和疫情诊断提供技术支撑,本研究经对部分发表在NCBI的禽腺病毒4型序列进行比对,在其六邻体基因上找到一段相对保守序列,并设计出PCR引物和TaqMan探针。以FAdV-4 HB1510株作为标准品,通过反应条件优化,建立了FAdV-4荧光定量PCR检测方法,并对其敏感性、特异性和重复性进行了分析。结果显示,该方法的灵敏度为10 EID₅₀/mL,为常规PCR方法的10倍;组内和组间重复性良好;与鸡减蛋综合征病毒、大肠杆菌等禽类病原的核酸无交叉反应。通过对65份临床样品进行检测,FAdV-4荧光定量PCR和常规PCR的检测符合率为90.7%。因此,FAdV-4荧光定量PCR的快速、敏感、特异等优点使其在禽腺病毒4型的早期检测及预防、控制等方面有较好的应用前景。     

鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在建立鸭腺病毒A型（duck adenovirus A,DAdV-A）TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原（如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌）检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%（6/85）,PCR方法的阳性率为5.88%（5/85）,且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。     

鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原(如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%(6/85),PCR方法的阳性率为5.88%(5/85),且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。     

禽腺病毒4型PCR检测方法的建立与应用

根据禽腺病毒4型(FAdV-4)Hexon基因核苷酸序列,设计用于扩增FAdV-4的PCR引物,建立了FAdV-4 PCR检测方法。特异性和敏感性实验结果表明,该方法可扩增出954 bp的特异性核酸片段,而对禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒与禽腺病毒11型的检测结果均为阴性,对FAdV-4的最低核酸检出量为12.9 pg。该方法可用于禽腺病毒4型的临床检测与流行病学调查。     

禽腺病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

禽腺病毒4型(FAdV-4)是心包积水综合征的重要病原。本研究拟建立FAdV4荧光定量PCR检测方法,为FAdV4感染的流行病学调查、早期诊断、疫病净化提供技术手段。根据GenBank中的禽腺病毒4型六邻体(hexon)基因序列,设计一对引物,扩增hexon基因,将目的基因与载体pEASY-T3连接,构建重组阳性质粒pEAST-T3-H,利用所制备的质粒pEAST-T3-H为模板,对PCR反应体系、反应条件进行优化。建立了禽腺病毒4型SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,检出的标准品的敏感性为1.7×10拷贝/μL,优于常规的PCR检测方法。该方法与其他禽病病毒均无交叉反应。表明该方法具有特异型强、灵敏度高、重复性好的特点,可用于临床样本的检测。     

牛腺病毒5型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

建立针对牛腺病毒5型六邻体(Hexon)基因的实时荧光定量TaqMan PCR检测方法。根据牛腺病毒5型Hexon基因高度保守区设计引物和TaqMan探针,绘制标准曲线,对其灵敏度、特异性、重复性进行验证,建立牛腺病毒5型实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法。结果显示,构建的重组质粒pUC57-BAV5,标准曲线在10~2～10~7拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.975 2,建立检测方法的最低检测限为32拷贝/μL;应用建立的方法检测牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒、牛呼吸道合胞体病毒无交叉反应;重复性试验表明,同一浓度的20个平行样品的变异系数为1.4%。牛腺病毒5型TaqMan探针荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可以用于牛腺病毒5型的快速、准确的检测。     

禽腺病毒血清4型纳米PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速有效检测禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的方法,本研究根据FAdV-4五邻体(Penton)基因序列,设计合成1对特异性引物,经过条件优化,建立了检测FAdV-4的纳米PCR方法(Nano PCR)。特异性试验结果显示,该方法对鸡新城疫病毒等12种家禽常见病原及国内报导的FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11等5个主要血清型病毒的扩增结果均为阴性,仅FAdV-4检测结果为阳性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对FAdV-4的最低核酸检出量为54.0拷贝/μL,较常规PCR方法高10倍,敏感性较高。应用该方法和病毒分离培养法同时对87份临床样品进行检测,二者均检出14份阳性样品,总体符合率为100%。以上结果表明本研究建立的Nano PCR方法特异性好、敏感性高,可以用于FAdV-4的临床检测和分子流行病学调查。     

Ⅰ群4型禽腺病毒特异性SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立Ⅰ群4型禽腺病毒特异性SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,参考Gen Bank中已发布的禽腺病毒的六邻体基因(Hexon)序列设计两对引物,通过PCR扩增出Hexon基因的954 bp目的片段,克隆至p MD-19T载体,提取阳性质粒测定浓度,10倍系列稀释作为荧光定量PCR的标准品模板,制备标准曲线。结果显示,荧光定量PCR熔解曲线峰值单一,产蛋下降综合症病毒(EDSV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽白血病病毒(ALV)等外源病毒均无扩增曲线出现,对标准品模板最低检出值为1.2×101拷贝/μL。对7份Ⅰ群4型禽腺病毒的细胞培养物的检出率为100%,表明建立的实时荧光定量PCR检测方法准确可行。     

口蹄疫病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测口蹄疫病毒(FMDV)的方法,本研究根据GenBank中FMDV的2B基因序列,设计合成一对引物和一条TaqMan探针,将2B基因克隆到pBlueScriptSK(-)载体中,利用T7体外转录试剂盒制备标准品,通过优化反应条件,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果表明,该检测方法的敏感性达到102拷贝/μL;与其它主要相关病毒均不发生交叉反应,批内和批间试验重复性的变异系数(CV)均小于3％.本研究建立的FMDV TaqMan荧光定量PCR方法对FMDV的快速检测具有重要意义.     

鲤科疱疹病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速和敏感的检测鲤科疱疹病毒2型(CyHV-2)的方法,本研究根据CyHV-2 DNA聚合酶基因序列合成引物和TaqMan探针,建立了CyHV-2荧光定量PCR检测方法.结果显示,以重组质粒为标准品建立的标准曲线在5拷贝/μL～5×108拷贝/μL具有良好的线性关系,相关系数为0.999;其最低检出量为5拷贝/μL,比普通PCR的敏感度高100倍.该方法仅对CyHV-2的靶基因序列进行扩增,而对锦鲤疱疹病毒、流行性造血器官坏死病病毒、病毒性出血性败血症病毒、传染性胰脏坏死病病毒及鲤春病毒血症病毒核酸扩增结果均为阴性.组内和组间重复试验变异系数的平均值分别为0.5％和0.3％,具有良好的重复性.与常规PCR相比较,该方法具有快速、敏感、特异及高通量检测等优点,适用于对CyHV-2的快速检测.     

犬Ⅰ型腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立

通过分析对比GenBank公布的几株犬Ⅰ型腺病毒序列,针对犬Ⅰ型腺病毒特有的E3区,设计了1对特异性引物。对引物浓度、退火温度、扩增体系等条件优化后,建立了犬Ⅰ型腺病毒荧光定量PCR检测方法,并对40份CAV-Ⅰ人工感染银黑狐的粪便样品进行了检测。结果表明,与普通PCR相比,建立的犬Ⅰ型腺病毒荧光定量PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性强的特点。该检测方法可用于Ⅰ型犬腺病毒的快速诊断与监测,并能够定量分析CAV-Ⅰ的感染程度。     

血清1型FAdV TaqMan探针荧光定量PCR方法的建立及应用

为特异性地检测家禽中血清1型禽腺病毒(fowl adenovirus, FAdV)的感染,本研究以血清1型FAdV保守的52K基因为模板设计引物和探针,通过矩阵法优化后建立了针对该病毒的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,并用该方法检测1日龄SPF鸡攻毒后咽、肛拭子排毒量及组织病毒载量。结果显示,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,只能检测出血清1型FAdV,对其他血清型FAdV和其他禽类病毒均无阳性扩增;最低检测限度低至10拷贝/μL;组间和组内离散度均小于2%;标准曲线为y=-3.836x+41.791,相关系数R²=0.996,具有良好的线性关系;对SPF鸡攻毒结果显示,在攻毒后第1～14日的咽、肛拭子均可检测到血清1型FAdV,在攻毒后第8日的肝脏、肾脏、肌胃、回肠中也可检测到病毒,而腺胃和盲肠中未检出病毒。本研究为血清1型FAdV的定量检测提供了方法。     

鸭痘病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测鸭痘病毒的TaqMan荧光定量PCR方法,本试验克隆了鸭痘病毒P4b基因,构建重组质粒pMD-DPV-P4b,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的禽痘病毒P4b基因设计合成1对特异性引物及与该引物相匹配的特异探针。以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-DPV-P4b为标准品,通过对反应条件进行优化,建立了一种检测鸭痘病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,该方法与禽流感病毒、鸭黄病毒、鸭肝炎病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒和小鹅瘟病毒等其他水禽病毒,以及山羊痘病毒和鸡痘病毒等其他痘病毒均无交叉反应,特异性好。该方法最低检测限为1.29×10²拷贝/μL,比普通PCR检测方法高100倍。组内和组间变异系数均小于2%。结果表明,本试验所建立方法具有灵敏、特异、安全、快速的特点,适用于鸭痘病毒的检测。     

猪丹毒杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感的检测猪丹毒杆菌方法,本研究根据猪丹毒杆菌16S rRNA基因保守序列设计种特异性引物及探针,并优化反应条件,建立了检测猪丹毒杆菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明:以重组质粒为标准品建立的标准曲线在7.66×108拷贝/μL~7.66×10拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;最低可以检测到7.66×10拷贝/μL的标准品阳性质粒;该方法与其他22种常见细菌均无交叉反应;批内和批间变异系数均小于3%。应用建立的方法和细菌分离鉴定方法分别对36份临床样品进行检测,阳性率分别为19.44%和11.11%,两者符合率为91.67%。本研究建立的方法可用于猪丹毒杆菌感染的早期诊断、临床样品的高通量快速诊断检测以及猪丹毒杆菌定量分析。     

禽腺病毒DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

禽腺病毒属成员鸭腺病毒3型(duck adenovirus type 3,DAdV-3)和禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype-4,FAdV-4)是养殖场主要流行的病原,对养禽业造成巨大的经济损失。目前尚未见可同时快速检测这2种病原的双重荧光定量PCR检测方法,本研究基于DAdV-3 GDMM10毒株和FAdV-4 GDMZ毒株Fiber2基因序列比对及遗传进化分析,分别在Fiber2基因保守区设计特异性引物,建立了能同时鉴别临床上常见的DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR检测方法。结果表明,DAdV-3 GDMM10和FAdV-4 GDMZ Fiber2基因处于两个不同进化分支上,同源性为46.10%。建立的检测DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,最低可检出45拷贝/μL的DAdV-3样品和17拷贝/μL的FAdV-4样品;且检测结果可直接通过Tm值差异进行判定,简化操作时间。利用该双重荧光定量PCR方法对2022年度临床上采集的34份肝炎-心包积液疑似样品进行检测,DAdV-3和FAdV-4检出率分别为17.65%和...     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了检测猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus 2,PCV2)并对其进行准确定量,试验根据PCV2基因序列设计引物和探针,建立了一种特异性检测PCV2的TaqMan荧光定量方法。结果表明:该方法特异性良好;在5.0×10~1～5.0×10~9拷贝/μL模板范围内具有良好的线性关系;敏感性是常规聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法的100倍;重复性试验变异系数小于1.5%。与常规PCR方法相比,该方法对临床样品的检出率更高。该方法的建立为PCV2的实验室诊断、流行病学调查以及研究PCV2核酸载量与临床致病性关系提供了快速、准确的检测依据。     

鳜弹状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、准确检测鳜弹状病毒(SCRV)的TaqMan荧光定量PCR方法,本实验根据弹状病毒N基因中的保守序列,设计合成了一对特异性引物和TaqMan探针,以构建的标准质粒为模板,经条件优化后建立了SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验。结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法标准曲线的相关系数为0.999,质粒标准品在1×10~8拷贝/μL～1×10~1拷贝/μL范围内有较好的线性关系;该方法可以特异性检测SCRV,但对草鱼出血病病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)、石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、传染性脾肾坏死病(ISKNV)、神经坏死病毒(NNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)等7种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;最低可检测到的质粒标准品浓度为102拷贝/μL,比常规PCR方法灵敏100倍;该方法组内与组间变异系数均小于2%。采用该方法对35份临床样品进行检测,结果显示阳性检出率为31%,而普通PCR阳性检出率为14%,该方法检出率比常规PCR高。本研究建立的SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法为SCRV的快速检测提供了可行的技术手段。     

犬腺病毒和犬细小病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中已登录的CAV Hexon基因序列和CPV VP2基因序列,设计了2对特异性引物和2条Taq Man探针。经过条件优化建立了检测CAV和CPV的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示,以含有CAV Hexon基因和CPV VP2基因的重组质粒标准品为模板绘制标准曲线,其相关系数(R~2)均大于0.990,CAV和CPV荧光定量PCR均具有良好的线性关系。特异性试验结果显示,该方法仅对CAV-I型、CAV-II型和CPV检测结果为阳性,而对犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬冠状病毒检测结果均为阴性,表明其特异性强。该方法的敏感性检测结果显示其检测下限为10拷贝/μL。重复性试验结果显示该方法的组内和组间变异系数均小于2%,表明该方法重复性好。利用普通PCR方法与本实验建立的方法分别对感染CAV(10份)和CPV(27份)的犬模拟病料样品进行检测,两种方法对CAV和CPV检测的符合率分别可达100%和96.30%。本研究建立的荧光定量PCR检测方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于CAV和CPV的临床检测。     

犬腺病毒I型和II型TaqMan双重荧光定量PCR方法的建立

为鉴别检测犬腺病毒（CAV）I型和II型,根据GenBank中CAV-I和CAV-II型参考基因序列,设计合成1对通用引物和2条鉴别探针,建立了可鉴别检测CAV-I型和CAV-II型的双重荧光定量PCR检测方法。同时,对该方法进行了优化,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了试验,并与普通PCR检测方法进行样品检测符合率分析。特异性试验结果显示;本研究建立方法对犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒均未产生扩增曲线。敏感性试验结果显示,建立方法对CAV-I的检测敏感度为100 copies/μL,对CAV-II的检测敏感度为10 copies/μL。重复性试验结果显示,组内和组间变异系数均小于5%。临床样品检测对比结果显示,建立方法与普通PCR方法的符合率为95.12%。结果表明,本研究建立的TaqMan双重荧光定量PCR方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好等优点,可用于临床鉴别检测CAV-I和CAV-II型。本研究为CAV-I和CAV-II型感染的检测、鉴别以及流行病学调查提供了便捷快速的方法。